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        反溶劑法制備玉米醇溶蛋白-海藻酸鈉復合微粒研究

        2021-12-08 08:39:04安豐豪曹煜婕姜珊珊劉佶軒
        中國果菜 2021年11期
        關(guān)鍵詞:方法

        安豐豪,曹煜婕,姜珊珊,劉佶軒,李 明

        (通化師范學院食品科學與工程學院,吉林通化 134001)

        玉米醇溶蛋白是存在于玉米胚乳中的一種醇溶性蛋白,約占玉米蛋白總量的60%[1-2]。雖然玉米醇溶蛋白不溶于水,但由于其含有50%以上的疏水性氨基酸,因此該蛋白質(zhì)可溶解于乙醇溶液、高濃度尿素、堿性pH 值(>11)緩沖劑和陰離子表面活性劑中[3],并且可以通過自組裝轉(zhuǎn)化為具有兩親性的微/納米顆粒,用于運載疏水性活性物質(zhì),提高其穩(wěn)定性和生物利用率[4-8]。然而,玉米醇溶蛋白單獨作為載體使用時,其穩(wěn)定性并不理想,對pH、離子強度和溫度的變化敏感。多糖作為天然材料已被廣泛用于食品工業(yè),具有高度的穩(wěn)定性、生物相容性和生物可降解性。由于多糖在分子鏈上帶有天然電荷(離子或非離子)和各種基團(羥基、羧基、氨基等),因此多糖可以通過化學交聯(lián)、物理交聯(lián)、多離子復合物和自組裝等方式與蛋白質(zhì)一起參與微/納米載體的制備[9-10]。因此,玉米醇溶蛋白常與多糖反應制備復合微粒以提高其穩(wěn)定性。

        玉米醇溶蛋白-多糖復合微粒的制備多采用反溶劑法(anti-solvent),也稱為液-液分散法(liquid-liquid dispersion)。目前,在玉米醇溶蛋白-多糖復合微粒的研究中,多集中于穩(wěn)定性及生物活性物質(zhì)的運載方面,對制備方法則鮮有報道。Joye 等[11]提出,反溶劑法制備微/納米顆粒的過程中,混合技術(shù)(攪拌或超聲波)、添加順序(溶劑向反溶劑中加入或反溶劑向溶劑中加入)、添加方式(滴加或倒入)、反溶劑與溶劑的比例、化合物濃度、溫度和穩(wěn)定劑等都可能會對產(chǎn)品特性產(chǎn)生影響。因此,本研究重點考察了不同制備技術(shù)對玉米醇溶蛋白-海藻酸鈉復合微粒特性的影響,以期促進蛋白質(zhì)-多糖復合微/納米顆粒技術(shù)的深入研究和推廣應用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        玉米醇溶蛋白,Z3625,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;海藻酸鈉、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉,分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        水浴鍋,DK-S24,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,RE-3000A,上海亞榮生化儀器廠;分光光度計,722N,上海儀電分析儀器有限公司;高速分散均質(zhì)機,F(xiàn)J-200S,杭州齊威儀器科技有限公司;真空冷凍干燥機,LGJ-12,北就松源華興科技發(fā)展有限公司;傅立葉紅外光譜分析儀,Nicolet iS20,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 復合微粒制備

        方法一(F1):將玉米醇溶蛋白溶于80%乙醇后得到玉米醇溶蛋白乙醇溶液,將其滴入海藻酸鈉水溶液中,邊滴邊攪拌,攪拌速率為10 000 r/min,混合后繼續(xù)攪拌5 min,然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,用蒸餾水定容至原體積,得復合微粒溶液,進行穩(wěn)定性檢測。

        方法二(F2):將海藻酸鈉溶液滴入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中,其他操作同方法一。

        方法三(F3):將玉米醇溶蛋白乙醇溶液緩慢倒入海藻酸鈉溶液中,其他操作同方法一。

        方法四(F4):將海藻酸鈉溶液緩慢倒入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中,其他操作同方法一。

        方法五(F5-分階段制備):將玉米醇溶蛋白乙醇溶液滴入蒸餾水中,邊滴邊攪拌,攪拌速率為10 000 r/min,混合后繼續(xù)攪拌5 min,然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,用蒸餾水定容至原體積,得玉米醇溶蛋白微粒懸浮液,然后將玉米醇溶蛋白微粒溶液與等體積海藻酸鈉溶液混合,得復合微粒溶液,進行穩(wěn)定性檢測。

        1.3.2 紅外光譜檢測

        復合微粒溶液經(jīng)冷凍干燥后得固體樣品,取一定量固體樣品進行ATR-FTIR 檢測,檢測所得各樣品紅外光譜數(shù)據(jù)經(jīng)標準化處理后進行對比分析。

        1.3.3 穩(wěn)定性檢測

        復合微粒的穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在當環(huán)境發(fā)生變化時,微粒是否易于發(fā)生聚集甚至沉淀。復合微粒聚集時,粒度增加,粒度變化可由樣品的透光度反映出來[12]。在一定條件下,當樣品的透光度降低,說明復合微粒發(fā)生聚集,粒度增加,溶液渾濁度增加。因此,復合微粒溶液的透光度可反映樣品微粒的聚集狀態(tài),從而判斷復合微粒的穩(wěn)定性。

        (1)pH 穩(wěn)定性

        吸取1 mL 復合微粒溶液,加入19 mL 磷酸鹽緩沖溶液(pH 3~8),混勻,在波長500 nm 條件下測定溶液的透光度。

        (2)離子強度穩(wěn)定性

        NaCl溶液濃度分別為200、400、600、800、1 000 mol/L。吸取1 mL 復合微粒溶液,加入1 mL、200 mol/L NaCl 溶液,混勻,取1 mL 混合溶液,再加入19 mL、100 mol/L NaCl 溶液稀釋,在波長500 nm 條件下測定溶液透光度。其它不同NaCl 濃度條件下的離子強度穩(wěn)定性檢測方法同上。

        (3)熱處理穩(wěn)定性

        吸取1 mL 復合微粒溶液,加入19 mL 水,混勻,分別置于45、55、65、75、85、95、100 ℃水浴中,加熱15 min,在波長500 nm 下測定溶液透光度。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        每組實驗均至少重復3 次,結(jié)果表示為平均值±標準差。應用Origin 8.5 進行數(shù)據(jù)處理,并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行顯著性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 制備方法對復合微粒穩(wěn)定性的影響

        2.1.1 制備方法對復合微粒pH 穩(wěn)定性的影響

        由圖1 可知,pH 變化對F1 的穩(wěn)定性影響不顯著,但對F2~F5 具有顯著性影響(P<0.05)。說明F1 對pH 變化的穩(wěn)定性相對較好。除F1 和F4 的透光度比較接近外,其它方法制備所得樣品的透光度在數(shù)值上相差較大,其中F3 的透光度最高,其次是F1、F4、F2 和F5,說明F3 制備的微粒粒度最小,其次是F1、F4、F2 和F5。由以上結(jié)果可得,F(xiàn)1 的pH 穩(wěn)定性最好,F(xiàn)2 的穩(wěn)定性最差;F3的粒度最小,F(xiàn)5 的粒度最大。因此,在復合微粒制備過程中,玉米醇溶蛋白與多糖溶液的添加順序、混合方式(滴入、倒入)以及復合方式(F5)對pH 變化的敏感度不同,所得微粒的粒度也不同,是在微粒制備時需要重點考察的因素。

        圖1 制備方法對復合微粒pH 穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of preparation method on pH stability of composite microparticles

        2.1.2 制備方法對復合微粒離子強度穩(wěn)定性的影響

        由圖2 可知,離子強度的變化對復合微粒的穩(wěn)定性有顯著影響(P<0.05)。其中,F(xiàn)1 在200 mmol/L NaCl 條件下透光度最高,在300~500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化不顯著;F2 在100~300 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化不顯著,但在300~500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)先下降后上升;F3 在100~300 mmol/L NaCl 范圍透光度逐漸下降,在300~500 mmol/L NaCl 時透光度先上升后下降;F4 在100~500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)先上升后下降,300 mmol/L NaCl時透光度最高;F5 在100~500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi)變化顯著(P<0.05),在400 mmol/L NaCl 時透光度最低。通過以上分析可得,5 種制備方法對離子強度的變化都較敏感,透光度隨離子強度的變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢。由極差比較可得,在100~500 mmol/L NaCl 范圍內(nèi),F(xiàn)1 的透光度變化相對最小,F(xiàn)2 的透光度變化相對最大,因此,各制備方法對離子強度的相對穩(wěn)定性由大到小依次是F1>F5>F3>F4>F2。

        圖2 制備方法對復合微粒離子強度穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of preparation method on ionic strength stability of composite microparticles

        2.1.3 制備方法對復合微粒熱處理穩(wěn)定性的影響

        透光度可通過檢測樣品的混濁度而得,反映了樣品微粒聚集程度的大小或微粒粒度的大小[12]。由圖3 可知,在45~100 ℃范圍內(nèi),不同制備方法所得復合微粒的透光度對溫度的變化比較敏感(P<0.05),說明熱處理對復合微粒穩(wěn)定性的影響顯著。5 種制備方法所得的復合微粒中,F(xiàn)1 對熱處理的穩(wěn)定性相對較好,F(xiàn)5 對熱處理的穩(wěn)定性相對最低。

        圖3 制備方法對復合微粒熱處理穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of preparation method on thermo stability of composite microparticles

        綜上所述,在復合微粒制備過程中,不同的制備方法對所得微粒的透光度有顯著影響,說明不同方法所得微粒的粒度大小差異明顯,同時,不同制備方法所得微粒的穩(wěn)定性也不同。因此,在利用玉米醇溶蛋白和多糖制備復合微粒時,添加順序、混合方式及復合方式等制備參數(shù)都是需要重點考察的因素。

        2.2 不同制備方法所得復合微粒的紅外光譜分析

        傅立葉變換紅外光譜技術(shù)常用于研究蛋白質(zhì)與多糖的相互作用,有效地識別功能團。蛋白質(zhì)重復單元的振動產(chǎn)生一些特征性的紅外吸收帶,如酰胺A、B 和I~VII 等[13]。

        由圖4 可知,在玉米醇溶蛋白的紅外光譜中,1 644 cm-1和1 531 cm-1分別屬于酰胺I 帶(1 700~1 600 cm-1區(qū)域,主要是C═O 拉伸)和酰胺II 帶(1 600~1 500 cm-1區(qū)域,主要是C—N 拉伸加上N—H 彎曲模式),3 100~3 500 cm-1是由于羥基的O—H 拉伸振動,CH2反對稱和對稱拉伸振動的光譜在3 000~2 800 cm-1范圍內(nèi)。在海藻酸鈉的紅外光譜中,O—H 和C—H 的伸縮振動分別表現(xiàn)在3 242 cm-1和2 925 cm-1[14],而1 590 cm-1和1 409 cm-1分別來源于COO—和C═O 的伸縮振動[15],C—O—C 的伸縮振動表現(xiàn)在1 082 cm-1[16]。

        圖4 玉米醇溶蛋白(A)、海藻酸鈉(B)、玉米醇溶蛋白和海藻酸鈉的物理混合物(C)、方法1~5(D~H)所得微粒的紅外光譜Fig.4 The infrared spectroscopy of Zein (A),sodium alginate(B),zein-alginate physical mixture (C),microparticles obtained from F1~F5 (D~H)

        由圖4 可知,玉米醇溶蛋白和海藻酸鈉粉末混合樣品的紅外光譜(圖4C)與F1~F4 的光譜有顯著的區(qū)別,說明玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉的相互作用不是簡單的物質(zhì)混合,而是發(fā)生了某些化學反應。有研究顯示,蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用包括離子鍵、氫鍵和疏水作用力[10]。由F1~F4 的光譜結(jié)果可知(圖4 D~G),不同制備方法對樣品紅外光譜的影響不顯著,說明玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉的作用機制是相同的,不受溶液的添加順序和混合方式(滴入、倒入)的影響。但是,由圖4H 可知,F(xiàn)5 的紅外光譜與前4 種樣品的紅外光譜有顯著區(qū)別,說明F5 與F1~F4 的反應機制不同。

        3 結(jié)論

        由穩(wěn)定性研究結(jié)果可得,在玉米醇溶蛋白與海藻酸鈉復合微粒的制備過程中,添加順序和混合方式(滴入、倒入)對微粒的穩(wěn)定性有顯著影響,其中,F(xiàn)1 對pH 和熱處理的穩(wěn)定性相對較好。同時,不同制備方法所得復合微粒的粒度不同,由小到大依次是F3<F1<F4<F2<F5。由紅外光譜結(jié)果可得,分階段制備法(F5)與其它方法在微粒的形成機制上有本質(zhì)的區(qū)別,需要進一步深入的研究。

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