岳琳娜，向平，宋粉云，沈保華，嚴(yán)慧

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

新精神活性物質(zhì)，又稱“策劃藥”或“實驗室毒品”，是不法分子為逃避打擊而對管制毒品進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的毒品類似物。合成大麻素類（syn?thetic cannabinoids，SCs）是種類最多、增長最快、濫用最為嚴(yán)重的一大類新精神活性物質(zhì)[1]。

2-[1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（4F-MDMB-BUTINACA）也稱4FMDMB-BINACA 或4F-ADB，與合成大麻素3，3-二甲基-2-[1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（5F-ADB）結(jié)構(gòu)相似，屬于吲唑甲酰胺類合成大麻素類新精神活性物質(zhì)，是大麻素受體1（cannabinoid re?ceptor 1，CB1）的激動劑[2-4]。2018 年11 月初，英國、荷蘭、法國等多國向歐洲毒品和毒癮監(jiān)測中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction，EMCDDA）報告了4F-MDMB-BUTINACA 的濫用情況[2]。2019年1月，德國埃爾蘭根法醫(yī)學(xué)研究所分析了3種繳獲的、未標(biāo)記的草藥混合物，檢測出4F-MDMBBUTINACA 成分[5]。最近，EMCDDA 又報告了幾起與攝入4F-MDMB-BUTINACA 有關(guān)的死亡案例，新型合成大麻素4F-MDMB-BUTINACA 濫用日趨嚴(yán)重，對公共安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6-7]。

合成大麻素類化合物進(jìn)入體內(nèi)被廣泛代謝，原形化合物通常很難在生物基質(zhì)中檢出，大多數(shù)化合物在尿液中以代謝產(chǎn)物形式廣泛存在，因此需要進(jìn)行代謝研究，以便對新出現(xiàn)的合成大麻素濫用形勢進(jìn)行監(jiān)測。盡管有少量4F-MDMB-BUTINACA 體內(nèi)和體外代謝的研究報道[2，5-6]，但對于這類物質(zhì)的監(jiān)測仍缺乏系統(tǒng)的體內(nèi)分析方法和代謝數(shù)據(jù)的支撐。

斑馬魚（zebrafish）與人的基因高度相似，同源性高達(dá)87%[8-9]。斑馬魚體內(nèi)有內(nèi)源性CB1和CB2，具有與人類及其他哺乳動物高度相似的藥物代謝的相關(guān)酶系，包括Ⅰ相代謝酶[10]和Ⅱ相代謝酶[11]，研究[12-13]結(jié)果表明，斑馬魚可作為人類代謝研究的理想實驗?zāi)Ｐ?。作為一個完整的生物，斑馬魚也能彌補體外模型系統(tǒng)在藥物代謝研究方面的局限性。本研究旨在構(gòu)建4F-MDMB-BUTINACA 斑馬魚體內(nèi)代謝模型，建立液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法，探索4F-MDMBBUTINACA 在斑馬魚體內(nèi)的代謝方式及代謝途徑，以期為4F-MDMB-BUTINACA的鑒定提供方法和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

4F-MDMB-BUTINACA 標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，溶劑為甲醇，購自美國Cayman 公司；甲酸、乙酸銨（純度98%）購自瑞士Fluka 公司；乙腈、甲醇（色譜純，純度大于99.9%）購自美國Sigma-Aldrich 公司；實驗用水為超純水，由Mili-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 主要儀器與裝置

UltiMate 3000 UPLC 結(jié)合Q ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀以及Mass Frontier 軟件購自美國Thermo Scientific 公司，配有電噴霧離子源（HESI-Ⅱ）及XcaliburTM3.1 工作站；OMNI* Bead Ruptor 24 Elite 多功能生物樣品均質(zhì)器購自奧然科學(xué)技術(shù)有限公司；TDZ4-WS離心機購自湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；XW-80A 旋渦混合器購自上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；MiniSpin高速離心機購自德國Eppendorf公司。

1.3 動物實驗

將6 條成年斑馬魚（上海費曦生物科技有限公司）隨機分為空白對照組和實驗組，每組3條。將4FMDMB-BUTINACA 溶解于水中，實驗組斑馬魚在4FMDMB-BUTINACA（1 μg/mL）藥液中暴露染毒24 h后轉(zhuǎn)移到清水中清洗3 次，進(jìn)行樣品前處理。空白對照組斑馬魚不暴露于4F-MDMB-BUTINACA，直接進(jìn)行樣品前處理，以排除斑馬魚體內(nèi)、水中以及實驗試劑對原形化合物及代謝產(chǎn)物的干擾。本實驗已通過司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會的審查。

1.4 樣品前處理

將斑馬魚置于2 mL 規(guī)格研磨管中，加入適量陶瓷珠及乙腈溶液300 μL，于生物樣品均質(zhì)器中冷凍研磨。研磨參數(shù)設(shè)置：速度6 m/s，研磨時間20 s，停留時間40 s，循環(huán)10 次。然后以14 104×g離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）微孔濾膜過濾后，裝入進(jìn)樣瓶待儀器分析。

1.5 實驗條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm；美國Agilent公司）。流動相：A相為20 mmol/L乙酸銨、5%乙腈和0.1%甲酸混合水溶液，B 相為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～6.5 min，5%～95% B；6.5～11.5 min，95% B。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，自動進(jìn)樣盤溫度為4 ℃。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式；噴霧電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為350 ℃；鞘氣流量為35 arb，輔助氣流量為10 arb，鞘氣、輔助加熱氣和碰撞氣均采用高純氮氣。

數(shù)據(jù)采集模式采用一級全掃描和自動觸發(fā)二級掃描（full scan-dd MS2）。一級掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置：分辨率70 000，質(zhì)荷比掃描范圍m/z100～1 000；自動增益控制（automatic gain control，AGC）3.0×106，最大注射時間（maximum injection time，MIT）50 ms。二級掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置：分辨率17 500，AGC 1×105，MIT 50 ms，歸一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）分別為20、40、60。

代謝產(chǎn)物的推斷依據(jù)：m/z測量值與m/z理論值的質(zhì)量偏差小于5×10-6，適當(dāng)?shù)纳V峰和保留時間，MS2質(zhì)譜圖中出現(xiàn)特征碎片離子，結(jié)合已報道的4FMDMB-BUTINACA[2，5-6]及其結(jié)構(gòu)類似物[14-19]的代謝轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)進(jìn)行斑馬魚體內(nèi)所產(chǎn)生4F-MDMBBUTINACA代謝產(chǎn)物的確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝產(chǎn)物結(jié)果匯總

本研究在斑馬魚體內(nèi)鑒定出4F-MDMBBUTINACA的26個代謝產(chǎn)物，包括18個Ⅰ相代謝產(chǎn)物和8個Ⅱ相代謝產(chǎn)物。26個代謝產(chǎn)物的質(zhì)荷比m/z測得值與理論值的質(zhì)量偏差均在±5×10-6內(nèi)。4F-MDMBBUTINACA 的保留時間為7.43 min，26 個代謝產(chǎn)物的保留時間為4.27～6.88 min，根據(jù)保留時間將26 個代謝產(chǎn)物標(biāo)記為Md1～Md26。4F-MDMB-BUTINACA及其26 個代謝產(chǎn)物MS2譜圖見圖1～3。表1 列出了4FMDMB-BUTINACA 及其26個代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化途徑、分子式、m/z理論值、m/z實測值、質(zhì)量偏差、保留時間以及響應(yīng)強度。4F-MDMB-BUTINACA 在斑馬魚體內(nèi)的代謝途徑見圖4。

圖1 斑馬魚體內(nèi)4F-MDMB-BUTⅠNACA的MS2譜圖Fig.1 MS2 spectrum of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

圖2 斑馬魚體內(nèi)4F-MDMB-BUTⅠNACA的18個Ⅰ相代謝產(chǎn)物的MS2譜圖Fig.2 MS2 spectra of 18 phase Ⅰmetabolites of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

圖3 斑馬魚體內(nèi)4F-MDMB-BUTⅠNACA的8個Ⅱ相代謝產(chǎn)物的MS2譜圖Fig.3 MS2 spectra of 8 phase Ⅱmetabolites of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

圖4 4F-MDMB-BUTⅠNACA在斑馬魚體內(nèi)的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

18 個Ⅰ相代謝產(chǎn)物包括1 個單羥基化代謝產(chǎn)物（Md26），11個酯水解代謝產(chǎn)物（Md3、Md5、Md7、Md13、Md14、Md15、Md16、Md17、Md19、Md24、Md25），1 個羰基化結(jié)合單羥基化代謝產(chǎn)物（Md20），3個氧化脫氟代謝產(chǎn)物（Md11、Md21、Md22），2 個脫烷基化代謝產(chǎn)物（Md18、Md23）。8個Ⅱ相代謝產(chǎn)物都是葡萄糖醛酸結(jié)合物（Md1、Md2、Md4、Md6、Md8、Md9、Md10、Md12）。

2.2 酯水解

Md24 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為350.187 26，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）減小了14.015 53，結(jié)合其m/z為219.092 71、145.039 67 碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是4F-MDMB-BUTINACA 通過酯水解形成的代謝產(chǎn)物。

Md12的準(zhǔn)分子離子峰m/z為526.218 93，比Md24增加了176.031 67，其m/z為145.039 67、219.092 87 的特征碎片離子與Md24一致，推測其是由Md24與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。合成大麻素5FADB[14]、3-甲基-2-[1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（AMB-FUBINACA）[15]和2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5FMDMB-PICA）[16-17]的結(jié)構(gòu)與4F-MDMB-BUTINACA相似，此前已有報道其最突出的代謝產(chǎn)物都是通過酯水解形成。與此相同，酯水解也是4F-MDMB-BUTINACA的主要生物轉(zhuǎn)化方式，Md24 是斑馬魚體內(nèi)最豐富的代謝產(chǎn)物。多名4F-MDMB-BUTINACA 吸毒者的血樣或尿樣中均檢測到代謝產(chǎn)物Md24[2，5-6]，酯水解也是4F-MDMB-BUTINACA 在人體內(nèi)的主要代謝途徑。與Ⅱ相代謝產(chǎn)物相比，Ⅰ相代謝產(chǎn)物的檢測無需經(jīng)過酶水解等復(fù)雜的前處理過程，更適宜作為監(jiān)測合成大麻素攝入的生物標(biāo)志物，因此推薦將Md24 作為監(jiān)測4F-MDMB-BUTINACA 攝入的潛在毒性標(biāo)志物。

Md25的準(zhǔn)分子離子峰m/z為348.171 11，比Md24減小了2.016 15，結(jié)合其m/z為219.092 86、145.039 70碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是由Md24 脫氫得到。Md25是斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生的第二豐富的代謝產(chǎn)物，與人體內(nèi)代謝研究結(jié)果相似，Md25也是4F-MDMB-BUTINACA濫用者尿樣中普遍檢測到的代謝產(chǎn)物[2，5-6]，推薦將Md25作為監(jiān)測4F-MDMB-BUTINACA 攝入的潛在毒性標(biāo)志物。Md25可能發(fā)生脫烷基反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物Md13，產(chǎn)生m/z為145.039 63、246.123 67 的特征碎片離子。

Md14的準(zhǔn)分子離子峰m/z為348.190 52，比Md24減小了1.996 74，結(jié)合其m/z為145.039 79、217.096 89碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是由Md24 發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)得到。Md14 進(jìn)一步發(fā)生脫氫反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物Md15，Md15 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為346.175 78，比Md14減小了2.014 74，其m/z為145.039 75、217.097 75的特征碎片離子與Md14一致。Md2的準(zhǔn)分子離子峰m/z為522.206 36，比Md15 增加了176.030 58，推測其是由Md15與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md3 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為364.186 55，比Md14增加了15.996 03，可能是增加了1 個O。結(jié)合Md3 的MS2譜圖中m/z為145.038 94 的碎片離子，即吲唑環(huán)上未發(fā)生改變，說明羥基化位點發(fā)生在4-氟丁基烷烴側(cè)鏈上，但難以確認(rèn)羥基化的具體位點。

Md7和Md16的準(zhǔn)分子離子峰m/z分別為362.170 90和362.171 02，比Md3 減 小 了2.015 65 和2.015 53。結(jié)合Md7 和Md16 的MS2譜圖中分別出現(xiàn)的m/z為145.039 64、145.039 55 的碎片離子，說明羥基化反應(yīng)均發(fā)生在烷烴側(cè)鏈上，故Md7 和Md16 是兩個羥基化的同分異構(gòu)體，推測其中1 個是Md3 發(fā)生脫氫反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物。

Md17的準(zhǔn)分子離子峰m/z為366.182 34，比Md24增加了15.995 08，可能是增加了1 個O。結(jié)合Md17的MS2譜圖中出現(xiàn)的m/z為145.039 49的碎片離子，說明羥基化反應(yīng)發(fā)生在烷烴側(cè)鏈上。Md4 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為542.214 17，比Md17 增加了176.031 83，推測其是由Md17 與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md19的準(zhǔn)分子離子峰m/z為364.166 72，比Md17減小了2.015 62，其m/z為145.039 60、237.103 29 的特征碎片離子與Md17 一致，推測其是由Md17 進(jìn)一步發(fā)生脫氫反應(yīng)得到。Md1 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為540.200 74，比Md19 增加了176.034 02，推測其是由Md19與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md5 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為382.177 40，比Md24增加了31.990 14，推測是增加了2 個O，結(jié)合其m/z為253.098 10、161.034 04 碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測羥基化的發(fā)生位點是吲唑環(huán)和4-氟丁基側(cè)鏈，但難以確定羥基化的具體位點。

有研究[2，5-6]在4F-MDMB-BUTINACA 吸毒者的血樣或尿樣中檢測到代謝產(chǎn)物Md12、Md14、Md17、Md19、Md24 和Md25。此外，本實驗中4F-MDMBBUTINACA 在斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生的3 個Ⅱ相代謝產(chǎn)物（Md1、Md2、Md4）和6 個Ⅰ相代謝產(chǎn)物（Md3、Md5、Md7、Md13、Md15和Md16）均為首次發(fā)現(xiàn)。

2.3 氧化脫氟

Md22 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為362.206 48，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）減小了1.996 31，結(jié)合其m/z為145.039 64、217.096 99 碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是由4F-MDMB-BUTINACA 發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)得到。Md22 發(fā)生氧化反應(yīng)生成丁酸代謝產(chǎn)物Md21，Md22 和Md21 已在多名4F-MDMBBUTINACA吸毒者血樣或尿樣中被檢出[2，6]。

Md10的準(zhǔn)分子離子峰m/z為538.239 32，比Md22增加了176.03284，生成了m/z為362.20721、145.03946的特征碎片離子，推測其是由Md22 與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md11的準(zhǔn)分子離子峰m/z為392.181 70，比Md22增加了29.975 22，結(jié)合其m/z為145.039 61、217.096 77碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是Md22 進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)生成的羧酸代謝產(chǎn)物。

2.4 脫烷基化

Md23 是4F-MDMB-BUTINACA 脫烷基化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其準(zhǔn)分子離子峰m/z為290.149 48，在MS2譜圖中出現(xiàn)了m/z為145.039 60、230.128 71 的特征碎片離子。在吸毒者的尿樣中常檢測到代謝產(chǎn)物Md23，但生物樣本中Md23 的檢出不足以推斷4F-MDMBBUTINACA 的攝入，因為其可以通過5F-ADB[14]、3，3-二甲基-2-[1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（MDMB-4en-PINACA）[18-19]的生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生。

Md6 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為466.182 10，比Md23增加了176.032 62，其m/z為145.039 61、230.128 78 的特征碎片離子與Md23一致，推測其是由Md23與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md18的準(zhǔn)分子離子峰m/z為306.145 14，比Md23增加了15.995 66，可能是增加了1 個O。Md18 的MS2譜圖中出現(xiàn)的m/z為161.034 71 的碎片離子，說明羥基化反應(yīng)發(fā)生在吲唑環(huán)上，但難以確認(rèn)羥基化的具體位點。

2.5 其他

Md26 的準(zhǔn)分子離子峰m/z為380.199 01，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）增加了15.996 22，推測是增加了1 個O，結(jié)合其m/z為161.034 64、235.067 63 碎片離子的結(jié)構(gòu)，可知羥基化發(fā)生在吲唑環(huán)上，但難以確定具體位點。Md9的準(zhǔn)分子離子峰m/z為556.230 41，比Md26 增加了176.031 40，結(jié)合 其m/z為219.092 71、380.197 85 的特征碎片 離子，推測其是由Md26 與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

Md20的準(zhǔn)分子離子峰m/z為394.176 30，比Md26增加了13.977 29，結(jié)合其m/z為145.039 61、237.103 12碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測其是由Md26 進(jìn)一步發(fā)生羰基化反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物。Md8的準(zhǔn)分子離子峰m/z為570.209 40，比Md20 增加了176.033 10，結(jié)合其m/z為394.177 98、237.103 27 的特征碎片離子，推測其是由Md20與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

4F-MDMB-BUTINACA 在人體內(nèi)代謝速率較快，在尿液中基本無原形化合物檢出，這為該類毒品濫用的監(jiān)測和確認(rèn)帶來了極大的挑戰(zhàn)。本研究采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)，通過近年來藥物代謝研究中較為流行的斑馬魚模型，鑒定出了4F-MDMB-BUTINACA的26 個代謝產(chǎn)物及主要代謝途徑。本研究獲得的4F-MDMB-BUTINACA 體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)、開發(fā)的4FMDMB-BUTINACA 及其代謝產(chǎn)物的分析方法可應(yīng)用于4F-MDMB-BUTINACA 的濫用監(jiān)測，為司法鑒定實踐中該新型精神活性物質(zhì)濫用的打擊和預(yù)防提供技術(shù)支持，也為臨床4F-MDMB-BUTINACA 的中毒診治提供依據(jù)。上述研究結(jié)果還需更多的實際案例予以驗證。