陳紅娟，莊緒會(huì)，鄒海杰，李光濤，韓 偉，苗海江，杜傳林，羅曉宏?

（國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

小麥赤霉病是禾谷鐮刀菌引發(fā)的真菌性病害[1]，嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥的安全生產(chǎn)和糧食安全，而生物防治是一種綠色高效且相對(duì)安全的防治措施，契合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，近年來(lái)逐漸受到重視。本研究旨在從藥用植物內(nèi)生菌中篩選出小麥赤霉病拮抗菌，為植物生防提供理論依據(jù)。藥用植物白蓮蒿，系菊科蒿屬植物，除高寒地區(qū)外，廣泛分布于我國(guó)各地，具有清熱、解毒、涼血止血等藥理活性[2]。目前關(guān)于白蓮蒿研究多集中在倍半萜內(nèi)酯、薁類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[3-5]和保肝、抗炎、抗過(guò)敏、殺螨[6-9]等藥理學(xué)研究。然而，有關(guān)其內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物研究較少，截止目前還未見有關(guān)白蓮蒿內(nèi)生真菌及次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)報(bào)道。微生物次生代謝產(chǎn)物是天然產(chǎn)物庫(kù)的重要組成部分，是新型治療藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)的重要源泉[10]，本文首次報(bào)道了該植物內(nèi)生菌分離，純化，抗糧食病原菌禾谷鐮刀菌的活性和質(zhì)譜分析代謝產(chǎn)物，旨在為醫(yī)藥生產(chǎn)、植物病蟲害生物防治和綠色農(nóng)藥的研究提供有價(jià)值菌種資源和活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

活性測(cè)試菌種（小麥赤霉病菌），編號(hào)113713：科研物資采購(gòu)平臺(tái)；

白蓮蒿，采摘時(shí)間2019年11月5日：北京西山國(guó)家森林公園（北緯 39°57′59″，東經(jīng) 116°11′29″，海拔 214.1 m）；

色譜乙腈：默克股份兩合公司；色譜甲酸：西格瑪中國(guó)上海貿(mào)易有限公司；去離子水，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司；CJ-10超凈工作臺(tái)：天津市泰斯特儀器有限公司；XS105電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；TS-211B恒溫?fù)u床：常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；LDZF-75L-III高壓滅菌鍋：海申安醫(yī)療器械廠；MJX-50霉菌培養(yǎng)箱：紹興蘇珀儀器有限公司；Ultimate 3000&Q Exactive HF LC-MS：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

PDB培養(yǎng)基配方：1 000 mL蒸餾水后加入馬鈴薯塊200 g，煮沸30 min，三層紗布過(guò)濾后，濾渣繼續(xù)用水稀釋，最終補(bǔ)水值1 000 mL，再加葡萄糖20 g趁熱攪拌溶解，最后分裝三角瓶中，于121 ℃蒸汽滅菌 20 min。所有菌種培養(yǎng)均采用PDA培養(yǎng)基。

1.3.2 植物內(nèi)生菌分離、純化

取新鮮白蓮蒿用自來(lái)水沖洗干凈，曬干水分后，用滅菌刀片將根、莖、葉切成0.5×1 cm的小段，葉切成0.5×0.5 cm的方塊狀，用75%消毒酒精浸泡1 min后，無(wú)菌水洗3次，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌超凈臺(tái)，用無(wú)菌紙擦干表面水分后移入PDA培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)。28 ℃下培養(yǎng)5 d，采用尖端菌絲挑取法[11]，取邊緣新長(zhǎng)出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)移至新鮮PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記錄菌落的形態(tài)和做編號(hào)，同時(shí)要做無(wú)菌對(duì)照。

1.3.3 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的制備和提取

對(duì)培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌打5 mm的菌餅，接種于 600 mL PD液體培養(yǎng)基的三角瓶（3個(gè)菌餅/瓶），于 26 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng) 20 d，分離菌絲和發(fā)酵液，菌絲乙酸乙酯浸泡，提取浸膏；發(fā)酵液無(wú)菌過(guò)濾于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)試

各菌株抑菌活性測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]，以供試植物病原菌為檢測(cè)菌，測(cè)定白蓮蒿內(nèi)生菌發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑菌作用，將無(wú)菌發(fā)酵液2、18 mL冷卻到45 ℃左右PDA培養(yǎng)基混勻，倒入9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待凝固后將供試病原真菌菌餅（5 mm）倒置于平板中央，每處理三次重復(fù)，以 PDA培養(yǎng)液和無(wú)菌水處理為對(duì)照。培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測(cè)量供試菌落生長(zhǎng)直徑，取其平均值，計(jì)算抑制率。

1.3.5 液/質(zhì)譜分析

樣品前處理：將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，過(guò)濾，V（甲醇）∶V（濾液）=1∶1，取混合液過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜。

色譜條件：Zorbax Eclipse C18色譜柱（1.8 μm*2.1*100 mm）；柱溫為 30 ℃；流速 0.3 mL/min；流動(dòng)相組成A：（水+0.1%甲酸），B：純乙腈；進(jìn)樣量為 2 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度 4 ℃，流速為0.3 mL/min；采用梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：正模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 KV；毛細(xì)管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。掃描模式：一級(jí)全掃描（Full Scan，m/z 100～1 500）與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120 000（一級(jí)質(zhì)譜）& 60 000（二級(jí)質(zhì)譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用WPS軟件整理數(shù)據(jù)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌株篩選

將從白蓮蒿內(nèi)生菌中優(yōu)選的8株內(nèi)生菌并進(jìn)行活性測(cè)試，研究發(fā)現(xiàn)菌株（No：20202707）發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌抑制率最好，抑制率達(dá)到65.27%（表1）。選擇該菌株為測(cè)試菌株。

表1 白蓮蒿內(nèi)生真菌來(lái)源及拮抗效果Table 1 Sources of endophytic fungi from Artemisia Sacrorum Ledeb and antagonistic effects %

續(xù)表1

2.2 植物內(nèi)生菌鑒定

將純化好內(nèi)生菌接種PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落長(zhǎng)滿全皿，白色，質(zhì)地絲絨狀；反面淺黃色；無(wú)滲出液產(chǎn)生，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生（圖1）。菌絲壁平滑、透明，具分隔；分生孢子梗分枝明顯；瓶梗單生或2～3個(gè)輪生，長(zhǎng)12～30 μm；分生孢子梭形或橢圓形，兩端尖細(xì)，大?。?～15）×（2.5～4.5）μm，壁平滑；未見大分生孢子（圖2）。將該菌測(cè)試序列與NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，取相似度較高的序列，利用MEGA 5.0軟件和鄰位連接法（neighbor-joining methods）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株（No：20202707）鑒定為 Fusarium redolens。

圖1 宏觀形態(tài)Fig.1 Macro morphology

圖2 微觀形態(tài)Fig.2 Micro morphology

圖3 內(nèi)生真菌（No：20202707）的TIS的序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Sequence phylogenetic tree of TIS of endophytic fungi (No: 20202707)

2.3 質(zhì)譜分析

使用 Compound Discoverer 3.1 進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、等工作，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜信息利用 Thermo mzCloud在線數(shù)據(jù)庫(kù)，Thermo mzValut本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)等，對(duì)內(nèi)生菌株（No：20202707）發(fā)酵液進(jìn)行物質(zhì)鑒定，分析結(jié)果（表2），代謝產(chǎn)物共有178個(gè)，經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)類型產(chǎn)物有43種。菌株Fusarium redolens代謝產(chǎn)物在陽(yáng)離子模式下總離子流圖（圖4）。

表2 白蓮蒿內(nèi)生菌（No：20202707）代謝物定性分析結(jié)果Table 2 Qualitative analysis results of MS from metabolites of endophytic fungi (No: 20202707) from Artemisia Sacrorum Ledeb

圖4 菌株Fusarium redolens代謝產(chǎn)物在陽(yáng)離子模式下總離子流圖Fig.4 Complete ion chromatogram of extracts of Fusarium redolens in positive ion mode

3 結(jié)論

本文首次分離報(bào)道了白蓮蒿內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物抗菌活性和分析主要代謝產(chǎn)物，通過(guò)生長(zhǎng)速率法測(cè)試研究發(fā)現(xiàn)，白蓮蒿內(nèi)生真菌（No：20202707）對(duì)小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌率在65.27%，經(jīng)鑒定該菌株為芳香鐮刀菌真菌；并利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和Compound Discoverer 3.1數(shù)據(jù)處理軟件和結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)，研究其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息，該菌株具有豐富代謝產(chǎn)物，主要有3,4-二氫香豆素、5′脫氧核糖核苷、Harmala生物堿、苯并呋喃和苯并噻唑等43種類別。另外，發(fā)現(xiàn)菌株具有很好抗小麥赤霉病活性，是開展生物防治理想菌株，可做為新型綠色農(nóng)藥來(lái)源之一，為高效、低毒的新型抗糧食病原菌藥物的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。