郭 超，韓 偉，任 菲，王 超?

（國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037）

根據(jù)FAO估計，每年至少有2%的糧食因霉變而不能食用。我國糧食每年因霉變造成的損失占總產(chǎn)量的 1.5%～3%[1]。真菌及其真菌毒素污染是威脅糧食儲藏運輸流通環(huán)節(jié)安全、造成糧食損失的主要因素之一，許多真菌能引起糧食變色、發(fā)熱，同時產(chǎn)生大量的真菌毒素。我國每年因真菌及真菌毒素污染造成的糧食減產(chǎn)、浪費和安全風(fēng)險，不僅使得國民的身體健康受到威脅，還直接影響我國的糧油食品安全[2-4]。目前解決糧食霉變的途徑可分為物理、化學(xué)、生物三類。物理方法主要包括氣調(diào)儲藏、低溫儲藏、微波以及納米氧化鋅、納米銀等的吸附作用；化學(xué)方法主要是利用丙酸、山梨酸、雙乙酸鈉、苯甲酸等酸類物質(zhì)及其鹽[1,5-7]。生物學(xué)方法主要有利用生物來源的具有防霉功能的活性物質(zhì)，如香辛料、中草藥等植物中提取的精油，具有抑菌性能的活性物質(zhì)主要為醛類、酚類、酯類和醇類[8-10]；來源于動物的殼聚糖、魚精蛋白等[11-12]；目前見報道的產(chǎn)生防霉活性物質(zhì)的微生物主要有鏈霉菌屬（Streptomyces)、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas putida）、根霉屬（Rhizopus）、木霉屬（Trichoderma）等[7]。

芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）于 1945年即被發(fā)現(xiàn)其代謝物具有抑菌活性[13]，因具有穩(wěn)定性好、抗逆性高、抑菌譜廣等優(yōu)點，其產(chǎn)生的大量抗菌化合物已應(yīng)用于食品加工和作物保護領(lǐng)域，如食品防腐劑、治療劑和生物農(nóng)藥[14]。有效成分包含芽孢桿菌的防霉菌劑產(chǎn)品有普濾仕日本九州的日本鬼粉、湖北省武漢天惠公司的枯草芽孢桿菌、山東泰諾藥業(yè)的木霉菌蠟質(zhì)芽孢桿菌泰諾-維克等[7]?？莶菅挎邨U菌類成員包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等。其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)根據(jù)其生物合成途徑和化學(xué)性質(zhì)可區(qū)分為非核糖體途徑合成的脂肽類抗菌肽、核糖體途徑合成的蛋白類抗菌物質(zhì)以及揮發(fā)性化合物[15-17]。

本研究以禾谷鐮刀菌（F. graminearum）為指示菌，篩選產(chǎn)防霉活性物質(zhì)微生物，得到防霉活性較高的7株芽孢桿菌，初步確定活性物質(zhì)為肽類，本研究結(jié)果為新型防霉劑開發(fā)提供了菌株來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

待篩菌種及常見指示霉菌：國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院篩選和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，115 ℃滅菌 25 min；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基）：馬鈴薯浸出粉 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，121 ℃滅菌 25 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

菌株活化：菌株接種于 LB液體培養(yǎng)基，接種量1‰，30 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)。

菌株培養(yǎng)：活化培養(yǎng)24 h后接種于LB液體培養(yǎng)基，接種量 1‰，30 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 防霉活性篩選

禾谷鐮刀菌菌塊放置于PDA固體平板中間，30 ℃培養(yǎng)24 h。平板上等距離放置3～4個圓形濾紙片，濾紙片滴加10 μL待測樣品后30 ℃培養(yǎng)。平板培養(yǎng)48～72 h后，采取十字交叉法測定抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑大于30 mm判定為防霉效果強，以抑菌圈直徑處于20～30 mm之間判定為防霉效果中等，以抑菌圈直徑處于10～20 mm之間判定為防霉效果弱，以抑菌圈直徑小于10 mm判定為沒有抑菌效果。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)觀察 LB平板上劃線分單菌落，觀察單菌落形態(tài)；取菌液制片，10×100倍鏡下觀察顯微形態(tài)。

1.2.3.2 生化反應(yīng)鑒定 采用梅里埃芽孢桿菌鑒定試劑盒進行生化反應(yīng)鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA 基因序列比對 測序結(jié)果由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站進行Blast比對，再使用MEGA5.1軟件，采取鄰接法（Neighbor-Joining法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可靠性檢驗bootstrap法。

1.2.4 抑菌譜的測定

采用打孔法，指示菌禾谷鐮刀菌菌塊放置于平板中間，30 ℃培養(yǎng)24 h，其余霉菌（灰綠曲霉Aspergullus glaucus、黃曲霉A. flavus、亮白曲霉Aspergillus candidus、黑曲霉A. nige、赭曲霉A.ochraceus、青霉Penicilliumsp.和產(chǎn)黃青霉P.Chrysogenum）調(diào)整孢子液濃度約為107cfu/mL后吸取 100 μL 涂布于打孔平板上。將菌液 4 000 r/min離心10 min，向孔中加入100 μL上清液后靜置，直至上清液被吸收，30 ℃培養(yǎng)。平板培養(yǎng)48～72 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 培養(yǎng)時間對防霉活性的影響

菌株按照方法1.2.1進行培養(yǎng)，不同時間段取樣測量 OD600吸光度值并以禾谷鐮刀菌為指示菌，查看抑菌效果。

1.2.6 活性物質(zhì)分析

菌株按照方法1.2.1培養(yǎng)后，離心取上清液分別進行熱處理、蛋白酶K處理及耐酸堿性實驗，采用打孔法查看防霉效果，指示菌選用禾谷鐮刀菌。熱處理：在2 mL離心管中加入1 mL上清液，于50、75和100 ℃處理60 min，對照為未經(jīng)處理的上清液；蛋白酶K處理：在2 mL離心管中加入900 μL上清液和100 μL 10 mg/mL蛋白酶 K，37 ℃處理60 min，對照為未經(jīng)處理的上清液和以同樣方法處理的蛋白酶K；耐酸堿性：取10 mL上清液分別調(diào)節(jié) pH至 2、4、6、10、12，30 ℃靜置 1 h 后 4 000 r/min 離心 10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH至8.6，用0.22 μm濾器過濾，對照為未調(diào)節(jié)pH的過膜上清液。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用 Origin 2018、Mega5.1、Excel等軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株防霉效果篩選

對菌種庫中自酸菜、青貯飼料、老面饅頭、玉米種植田地土壤等環(huán)境分離保存的364株細(xì)菌進行防霉效果篩選（見表1）。由表1可知，近50%的菌株具有防霉活性，其中抑菌圈直徑大于20 mm的菌株占 38.47%。將初篩防霉活性強的 33株菌進行復(fù)篩驗證后選取活性較高且穩(wěn)定的7株菌，編號分別為 ASAG 62、ASAG 112、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8、ASAG 2MD10、ASAG M6 和 ASAG M9。

2.2 菌種鑒定

所選菌株在LB平板上培養(yǎng)24 h后菌落形態(tài)如圖1所示。ASAG 62菌落直徑2 mm左右，菌落整體表面光滑，凸起；ASAG 112菌落較小，直徑1～1.5 mm左右，邊緣不規(guī)則，整個菌落表面有褶皺狀凸起；ASAG M6、ASAG M9和 ASAG 2MD10形態(tài)相近，菌落直徑2～3 mm，邊緣清晰光滑，邊緣有環(huán)狀凸起，環(huán)狀凸起中間凹陷；ASAG 2MF8菌落直徑2～3 mm，邊緣不規(guī)則，表面不光滑有黏液，菌落中間有少許褶皺狀凸起；ASAG 2ME6菌落直徑1～1.5 mm，中間有凸起，表面不光滑有黏液。在10×100倍下觀察7株菌均為短桿菌。

圖1 菌落形態(tài)（A）和顯微形態(tài)（10×100倍，B）Fig.1 Colony morphology (A) and microscopic morphology (10×100 times, B)

采用梅里埃芽孢桿菌鑒定試劑盒對 7株菌進行生化反應(yīng)鑒定，部分結(jié)果如表2所示。7株菌的%ID接近100，T值大于0.4，有意義的分類單位均被歸類為枯草/解淀粉芽孢桿菌。區(qū)別主要集中于能否利用D-木糖、D-蜜二糖、D-棉子糖、淀粉與糖原。

表2 生化反應(yīng)鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of biochemical reactions

為進一步確定種屬，將7株菌16s rDNA序列經(jīng) Blast比對。結(jié)果顯示，其與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、解淀粉芽孢桿菌等芽孢桿菌屬菌株Query covery達到 99%以上。選取芽孢桿菌屬模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，該 7株益生菌與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌在同一分支上，與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌也具有極高的親緣性（見圖2）。貝萊斯芽孢桿菌因與解淀粉芽孢桿菌具有極高的相似性而被認(rèn)為是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，于2016年由Dunlap等[16]認(rèn)定其在細(xì)菌命名法中的分類地位。暹羅芽孢桿菌又譯為西姆芽孢桿菌，于2010年被收錄為有效種名[17]。

圖2 菌株與芽孢桿菌屬模式菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the screening strains and type strains of Bacillus sp.

2.3 培養(yǎng)時間對防霉活性的影響

通過繪制生長曲線可知：7株菌在培養(yǎng) 17 h后進入對數(shù)期，29～41 h時菌株濃度達到最大值，其中 ASAG 62、ASAG 112、ASAG M6和 ASAG 2MD10生長較快，菌株濃度于培養(yǎng)29 h達到最大值且 OD600均高于 3.0；ASAG M9、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8 相對緩慢，培養(yǎng) 41 h OD600最高，其中ASAG 2ME6與ASAG 2MF8菌株濃度相對較小，OD600低于 2.5（圖3A）。以禾谷鐮刀菌為指示菌，測定不同培養(yǎng)時間菌液上清的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)進入對數(shù)期后抑菌效果顯著增加，而菌株濃度達到最大值后，抑菌效果基本保持穩(wěn)定，因此采用培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液進行防霉實驗（圖3B）。

圖3 培養(yǎng)時間對防霉活性的影響Fig.3 Effect of culture time on bacteriostasis of F. graminearum

2.4 菌株對糧油食品中常見霉菌的抑菌效果

取 7株高防霉活性菌株上清液采用打孔法對8種糧食中常見霉菌進行防霉實驗，如表3所示。7株菌的活性物質(zhì)對亮白曲霉和禾谷鐮刀菌抑制效果最顯著，能夠完全抑制亮白曲霉的生長；ASAG 2MD10對青霉、禾谷鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌直徑分別為19.0 mm和35.0 mm；ASAG 62對產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、赭曲霉、黃曲霉抑制效果最好，對黃黃曲霉的抑菌直徑為15 mm；ASAG 2ME6對灰綠曲霉抑制效果最好。

表3 篩選菌株對常見霉菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of screening strains on common molds mm

2.5 防霉活性物質(zhì)初步分析

貝萊斯芽孢桿菌與暹羅芽孢桿菌均為枯草芽孢桿菌的近緣種，同樣具有廣譜抗菌性和高穩(wěn)定性，主要抗菌活性物質(zhì)為非核糖體合成的脂肽類抗生素[18-19]。通過對篩選所得7株菌上清液進行蛋白酶K處理后其防霉效果基本沒有變化，而對照蛋白酶 K溶液對禾谷鐮刀菌完全沒有抑菌效果；進行不同溫度處理發(fā)現(xiàn)100 ℃高溫處理使防霉活性明顯降低甚至消失，說明活性物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定；經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)上清液pH位于8.4～8.8之間，酸性環(huán)境下上清液產(chǎn)生沉淀，離心后調(diào)節(jié)pH至8.6，通過防霉實驗發(fā)現(xiàn)在pH6～10之間除ASAG 112外其它6株菌具有防霉活性，初始pH條件下防霉活性最高，酸堿度影響防霉活性，初步推測其活性物質(zhì)為肽類物質(zhì)（見圖4）。

圖4 蛋白酶K、溫度及pH對防霉活性的影響Fig.4 Effect of different treatment (A Proteinase K, B Temperature, C pH) on anti-mold activity

3 結(jié)論

本研究通過對大量菌株進行篩選得到7株防霉活性較強的菌株，均與貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌具有較近的親緣關(guān)系，初步歸屬為芽孢桿菌屬。繪制生長曲線并測定不同時間上清液的抑菌活性，確定培養(yǎng)時間為48 h?；钚晕镔|(zhì)不易被蛋白酶K分解，不耐高溫，耐受pH范圍為6～10，初步分析為肽類物質(zhì)。其中ASAG 62對常見霉菌，尤其是高毒霉菌黃曲霉具有一定抑菌活性。下一步擬對 ASAG 62、ASAG 2MD10 和 ASAG 2ME6菌株進行發(fā)酵液的復(fù)配研究，進一步提高防霉效果、擴大抑菌譜，尋找新的推廣途徑。

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