殷春雁，李燦鵬，劉自單?

（1. 紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 紅河 661199；2. 云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091）

辣木原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶，屬多年生木本植物[1]。廣東、廣西、海南，四川和云南省已從印度和緬甸引入種子和栽培技術(shù)，其種子富含油脂，蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)[2]。辣木具有一系列的營養(yǎng)價值和健康功效，例如抗氧化、抗炎、抗?jié)?、解熱、降壓、抗癲癇、抗糖尿病、降低膽固醇、保護(hù)肝臟、抗細(xì)菌和真菌等能力[3-5]。

環(huán)境壓力（如過熱或紫外線照射）增加機(jī)體內(nèi)活性氧水平，導(dǎo)致細(xì)胞成分（如核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)）的損傷，因此，機(jī)體的抗氧化能力對于維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用[6-7]。從動植物中尋找安全營養(yǎng)，并具有很好抗氧化性的功能成分用于食品、保健品等領(lǐng)域一直是研究的熱點(diǎn)。辣木的種子和葉是抗氧化劑的良好來源[8]，例如，辣木葉丙酮提取物[9]，辣木葉甲醇提取物[10]、辣木多酚[11]、黃酮[12]和多糖[13]等的體外抗氧化活性研究均有大量報道。

關(guān)于辣木籽蛋白抗氧化活性方面的研究較少，并且主要采用酶解法。Aderinola等研究顯示，辣木籽蛋白具有抗氧化活性[14]，尤其通過胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解之后，水解產(chǎn)物顯示了很好的體外抗高血壓和抗氧化活性[15-16]。然而，采用干燥加熱磷酸化法[17]研究辣木籽蛋白的體外抗氧化活性的文獻(xiàn)尚未報道。干燥加熱磷酸化法于1994年由Tarelli等[17]提出，是食品蛋白質(zhì)改性的常用方法，與食品蛋白改性的其它方法[18]比較，具有副反應(yīng)少，不易引起蛋白質(zhì)變性，有望應(yīng)用于食品工業(yè)[19]。有大量研究表明干燥加熱磷酸化法能提高食品蛋白的體外抗氧化活性[20-22]。因此，本研究采用辣木籽為材料，通過干燥加熱磷酸化法修飾辣木籽蛋白，旨在確定干燥加熱磷酸化修飾對辣木籽蛋白結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣木籽蛋白的制備參照孫坤來等[23]的方法略作修改。具體為：成熟果夾在室溫干燥去殼、皮，粉碎過篩，脫脂，過150目篩，往過篩后的粉末中加入三羥甲基氨基甲烷和蒸餾水，質(zhì)量比為 1∶4∶20，室溫攪拌 1 h，6 000 r/min 離心30 min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.8，取上清在10 kDa的透析袋透析 2 d，再在 6 000 r/min 離心 30 min，取出上清凍干后獲得辣木籽蛋白（N-MSP）樣品。

亞鐵嗪（Sigma）、2,2-二氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)-二銨鹽、乙二胺四乙酸二鈉：上海伊卡生物科技有限公司；重硫酸鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

PHS-25型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA 2004型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干燥加熱磷酸化辣木籽蛋白制備

PP-MSP的制備采用Li等[24]的方法。1 g N-MSP樣品溶于焦磷酸鈉溶液（100 mL, 0.1 mol/L），調(diào)節(jié)pH 為 4.0。凍干，然后干燥加熱（85 ℃, 5 d）。用透析袋去除樣品溶液中游離的焦磷酸鈉，冷凍干燥得到干燥加熱磷酸化辣木籽蛋白（PP-MSP）樣品。干燥加熱辣木籽蛋白（DH-MSP）樣品的制備除不加入焦磷酸鈉溶液外，同以上步驟。

1.3.2 磷含量測定

樣品中磷含量采用 Chen等[25]的方法。用高氯酸分解磷酸化辣木籽蛋白 PP-DEWP樣品，分解液中的磷作為總磷。為了測定無機(jī)磷含量，用5 mL10%TCA 溶解 20 mg PP-DEWP 樣品，溶液離心 2 h（3 000 r/min），上清液中的磷作為無機(jī)磷。分別取2 mL不同濃度的磷標(biāo)液和PP-DEWP樣品稀釋液，加入等體積的混合液，混勻后在50 ℃水浴中加熱1 h，冷卻后在820 nm處測定吸光度值。

有機(jī)磷含量（Po）：Po = Pt- Pi 。Po代表磷酸化修飾后樣品中的磷含量，Pt代表樣品中總磷含量，Pi代表樣品中無機(jī)磷含量。

1.3.3 溶解性測定

將辣木籽蛋白N-MSP、干燥加熱辣木籽蛋白DH-MSP和干燥加熱磷酸化辣木籽蛋白 PP-MSP樣品分別溶解在 Tris-HCl（50 mmol/L，pH=7.0）的緩沖溶液中，調(diào)節(jié)濃度為 1 mg/mL。3 000 rpm離心30 min得上清。采用Lowry法[26]測定上清液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3.4 表面巰基含量測定

采用Ellman等[27]的方法測定。1.0 mL 0.1 mol/L Tris-甘氨酸（pH=8.0）緩沖液（含0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液）加入到1.0 mL 0.1%的樣品溶液，在 40 ℃孵化 30 min，加入 50 μL 5,5′-二硫代雙（二硝基苯甲酸）溶液（5,5′-二硫代雙（二硝基苯甲酸）溶液濃度為1 mol/L），25 ℃孵化 10 min，在 412 nm 處測定其吸光度。計算公式：SH =A×1.9539。

1.3.5 濁度和吸光度測定

濁度測定采用 Li[28]等的方法。樣品溶于50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=7.0），濃度為2 mg/mL。

在595 nm處測定吸光度即為濁度。同理配制1 mg/mL的樣品溶液，測定280 nm處的吸光度。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力

根據(jù) Zhang等[29]的方法測定。80 μL的樣品溶液（濃度為 0.1～10.0 mg/mL）和 4.0 mL ABTS試劑（734 nm的吸收度為0.6）混合，37 ℃水浴放置 10 min，測定 734 nm 處的吸光度。平行 3次，空白不加樣品，以等量的磷酸鹽緩沖液代替，樣品抗氧化率計算如下：

其中As代表樣品的吸光度，A代表空白的吸光度。

1.3.7 超氧陰離子自由基清除能力

根據(jù) Zhang等[30]的方法測定。用 50 mmol/L pH 8.2 Tris-鹽酸溶液緩沖液溶解樣品，使蛋白濃度為 1 mg/mL。25 ℃水浴中恒溫的 0.14 mL 5 mmol/L 鄰苯三酚溶液（用 10 mmol/L 鹽酸溶液配制）中加入3 mL樣品溶液，混勻，每30 s測定325 nm處的吸光度，測定時長為4 min。對照組中用 3 mL去離子水代替樣品，空白組中用0.14 mL 10 mmol/L 鹽酸代替鄰苯三酚。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作曲線回歸方程，斜率代表樣品組對鄰苯三酚的自氧化速率和鄰苯三酚的自氧化速率。樣品組對鄰苯三酚的自氧化速率設(shè)為V樣品，鄰苯三酚的自氧化速率設(shè)為V對照。計算如下：

1.3.8 二價鐵離子的螯合能力

采用Wu等[31]的方法測定。樣品或EDTA溶液（1.0 mL, 0.1～10.0 mg/mL）和 0.1 mL 2 mmol/L的FeSO4·7H2O，加入3.7 mL去離子水，混勻，25 ℃下水浴 60 min。加入 0.2 mL 5 mmol/L 的亞鐵嗪溶液，混勻，在25 ℃水浴中放置10 min，測定562 nm處的吸光度。3次平行實(shí)驗，空白以等量的去離子水代替樣品，蛋白對二價鐵離子的螯合能力計算如下：

其中As代表樣品的吸光度，A代表空白的吸光度。

1.3.9 色氨酸的熒光強(qiáng)度

采用 Li等[32]的方法測定。用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH=7.0）配置濃度為 1.5 mg/mL 的樣品溶液。離心后取上清，用Lowry法準(zhǔn)確測定上層液中樣品的濃度，然后用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）稀釋為 0.1 g/L。在激發(fā)波長為 280 nm，測定波長為300～450 nm的條件下，用熒光光度計（F4500型）測定色氨酸的熒光強(qiáng)度。

1.3.10 圓二色譜測定

參照 Wu等[33]的方法。用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH=7.0）配制 1 mg/mL 的樣品溶液，采用0.45 μm的濾頭過濾，樣品的準(zhǔn)確濃度用Lowry法測定，最終調(diào)節(jié)為0.1 mg/mL。20 ℃下掃描，掃描的相關(guān)參數(shù)如下：波長范圍：190 nm～250 nm；譜帶寬度：1 nm。

1.3.11 紅外光譜

參照Wu等[33]的方法。取適量樣品粉末（加入一定量的KBr晶體以便充分研磨），然后壓片，采用傅立葉紅外光譜儀（Nicolet AVATAR 360 FT-IR）測定紅外光譜。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析。實(shí)驗結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥加熱磷酸化辣木籽蛋白的特性

2.1.1 磷酸化辣木籽蛋白中的磷含量

磷含量是干燥加熱磷酸化后接在蛋白質(zhì)上的有機(jī)磷含量，即有機(jī)磷含量=總磷含量－無機(jī)磷含量。磷含量與pH、干燥加熱時間和溫度等因素有關(guān)，本實(shí)驗采用Li等的方法成功制備磷酸化辣木籽蛋白樣品[24]。pH為4.0、85 ℃干燥加熱5 d獲得的樣品有機(jī)磷含量達(dá)到 1.32%，磷酸化辣木籽蛋白中的磷含量見圖1。

圖1 磷酸化辣木籽蛋白中的磷含量Fig.1 Effect of pH on the phosphorus content in MSP protein phosphorylated by dry-heating in the presence of pyrophosphate(PP-MSP)

2.1.2 磷酸化辣木籽蛋白溶解度測定

本實(shí)驗采用Lowry法[26]測定樣品溶解度。蛋白質(zhì)的溶解度對食品的粘度、凝膠性、起泡性、乳化性等功能特性有直接影響，這些特性是創(chuàng)制新型食品的基礎(chǔ)。如表1所示，與未經(jīng)過任何處理的辣木籽蛋白（N-MSP）相比，未加入焦磷酸鹽干燥加熱的辣木籽蛋白（DH-MSP）溶解度有所下降。但在焦磷酸鹽存在條件下干燥加熱的辣木籽蛋白（PP-MSP）溶解度達(dá)到99.4%，與N-MSP溶解度相當(dāng)。表明干燥加熱磷酸化改善了辣木籽蛋白的溶解性。有研究表明干燥加熱磷酸化修飾能改善蛋清蛋白[28]，牛血清蛋白[34]，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白[35]的溶解性。另有研究表明a-乳白蛋白（a-la）、β-乳球蛋白（β-lg）、牛血清蛋白（BSA）[36]，乳清分離蛋白（WPI）[37]，乳清水解蛋白（WPA）[37]經(jīng)過糖基化修飾，其溶解度提高，其原因可能是由于糖基化作用在蛋白質(zhì)表面引入了羥基基團(tuán)，致使蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)降低。本研究中干燥加熱磷酸化修飾使辣木籽蛋白溶解度增高可能是由于引入的磷酸基團(tuán)親水作用的結(jié)果[22]。

表1 磷酸化辣木籽蛋白的特性Table 1 Characteristics of MSPs

2.1.3 磷酸化辣木籽蛋白巰基含量測定

表面巰基含量的測定采用 Ellman等[27]的方法。如表1所示，未加入焦磷酸鹽干燥加熱能使辣木籽蛋白的表面巰基含量增加，在焦磷酸鹽存在條件下干燥加熱使辣木籽蛋白表面巰基含量進(jìn)一步增加。這一結(jié)果與Li等用鴨蛋清蛋白[22]和雞蛋清蛋白[27]研究的結(jié)果一致。研究表明干燥加熱或磷酸化修飾能使蛋白質(zhì)表面巰基含量增加可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開有關(guān)[38-39]。有趣的是，另有研究表明蛋白質(zhì)表面巰基含量的增加能使其抗氧化性提高[40-41]。?ili?等[42]以玉米蛋白為樣品確定了表面巰基的含量和抗氧化性存在正相關(guān)。

2.1.4 渾濁度和吸光度值

未經(jīng)干燥加熱或磷酸化修飾的辣木籽蛋白（濃度為 2 mg/mL）在 595 nm處的吸光度值為0.131，此時溶液為澄清透明。辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱后，其渾濁度明顯升高。然而，在焦磷酸鹽存在的情況下干燥加熱的辣木籽蛋白，其溶液透明度與未經(jīng)任何修飾的辣木籽蛋白溶液接近。表明磷酸化修飾能夠抑制由于干燥加熱引起的渾濁增加。有研究表明磷酸化修飾能使蛋白質(zhì)溶解度增加，這可能與磷酸基團(tuán)的引入增加了分子的靜電排斥力有關(guān)[39]。同時，各樣品溶液（蛋白濃度為1 mg/mL）在280 nm處的吸光度也證明了這一結(jié)論。

2.2 磷酸化對辣木籽蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 色氨酸的熒光強(qiáng)度

蛋白質(zhì)的熒光主要來源于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，其中色氨酸熒光最強(qiáng)。蛋白質(zhì)與其它分子相互作用會引起熒光強(qiáng)度降低，稱為熒光猝滅。本實(shí)驗中，磷酸基團(tuán)作為猝滅劑。如圖2所示，辣木籽蛋白經(jīng)過干燥加熱磷酸化修飾之后，其色氨酸熒光強(qiáng)度有所降低，可能是由于磷酸基團(tuán)在色氨酸殘基附近形成結(jié)合位點(diǎn)，阻礙了色氨酸熒光的展現(xiàn)[43]。

圖2 N-MSP、DH-MSP和PP-MSP的色氨酸熒光光譜Fig.2 Tryptophan (Trp) fluorescence spectra of N-MSP, DH-MSP and PP-MSP

2.2.2 圓二色譜（CD）測定

蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)在208 nm和222 nm處有兩個特征性的肩峰，因此可以利用 CD圖譜判斷蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。如圖3所示，經(jīng)干燥加熱或磷酸化修飾的辣木籽蛋白在 222 nm 處的特征值略微升高，表明辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾，其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變[39]。

圖3 干燥加熱磷酸化修飾對N-MSP、DH-MSP和PP-MSP二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of phosphorylation on the secondary structure of N-MSP, DH-MSP and PP-MSP

2.2.3 紅外光譜

在蛋白質(zhì)的紅外光譜中有兩個主要的特征吸收帶，即酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶。酰胺Ⅰ帶在1 600～1 700 cm-1處有吸收（主要是C=O的伸縮振動），酰胺Ⅱ帶在1540 cm-1處有吸收，酰胺Ⅰ帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變比酰胺Ⅱ帶更敏感[33]。如圖4所示，經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾的辣木籽蛋白的酰胺Ⅰ帶從 1 639.8 cm-1移動到 1 618.3 cm-1，酰胺Ⅱ帶從 1 540.4 cm-1移動到 1 539.7 cm-1，表明辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾，其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的改變。

圖4 N-MSP、DH-MSP和PP-MSP的紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of N-MSP, DH-MSP and PP-MSP

2.3 磷酸化對辣木籽蛋白抗氧化活性的影響

2.3.1 ABTS+自由基清除能力

ABTS法最是一種用于體外測定物質(zhì)總抗氧化能力的方法。ABTS（全名為 2,2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）經(jīng)過氧化生成一種穩(wěn)定的陽離子自由基ABTS+·，可以在734 nm的最大吸收峰處形成一個藍(lán)綠的發(fā)色團(tuán)。在該反應(yīng)體系中，溶液退色程度越明顯則表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)[44]。如圖5所示，在同一濃度下，PP-MSP對 ABTS自由基的清除能力顯著高于N-MSP和DH-MSP。表明辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾，ABTS+自由基的清除能力顯著提高。YIN等[20,22]利用ABTS法評價磷酸化修飾的雞蛋清蛋白和鴨蛋清蛋白的抗氧化性也得到同樣的結(jié)果。暗示蛋白質(zhì)抗氧化能力的提高歸因于磷酸基團(tuán)的引入。

圖5 N-MSP、DH-MSP和PP-MSP對ABTS+自由基的清除能力Fig.5 ABTS+ free radical scavenging effects of N-MSP,DH-MSP, and PP-MSP at concentrations of 0.1-10.0 mg/mL

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子也是在正常生理情況下產(chǎn)生的一類具有高反應(yīng)活性的自由基，它能氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物分子。如圖6所示，PP-MSP的超氧陰離子自由基清除能力（20.15%）高于 N-MSP（11.02%）和DH-MSP（13.32%）。表明辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱后，對超氧陰離子自由基清除能力有所提高，辣木籽蛋白經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾，對超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)一步提高。前期研究磷酸化修飾的雞蛋清蛋白[20]和鴨蛋清蛋白[22]的抗氧化性也得到相似的結(jié)果。

圖6 N-MSP、DH-MSP和PP-MSP對超氧陰離子的清除能力Fig.6 Superoxide anion scavenging activity of N-MSP,DH-MSP, and PP-MSP at concentrations of 1.0 mg/mL

2.3.3 二價鐵離子的螯合能力

過渡金屬（二價鐵離子）能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生活性氧，某些蛋白質(zhì)螯合劑可以通過改變過渡金屬的物理位置形成不溶性金屬配合物，降低過渡金屬的化學(xué)反應(yīng)活性[45]。如圖7所示，辣木籽蛋白經(jīng)過干燥加熱磷酸化修飾，對二價鐵離子螯合能力顯著提高。眾所周知，EDTA是很好的螯合劑，被廣泛用于食品中。在本實(shí)驗中，當(dāng)PP-MSP的濃度大于1 mg/mL時，螯合能力與EDTA相當(dāng)。表明經(jīng)干燥加熱磷酸化修飾的辣木籽蛋白是一種很好的抗氧化劑，有望應(yīng)用于食品工業(yè)。

圖7 N-MSP、DH-MSP和PP-MSP對二價鐵離子的螯合能力Fig.7 Chelating capacity of N-MSP, DH-MSP, and PP-MSP

3 結(jié)論

本文采用干燥加熱磷酸化法成功制備干燥加熱磷酸化辣木籽蛋白（PP-MSP），干燥加熱磷酸化修飾使其抗氧化性顯著提高，尤其是螯合能力與EDTA基本相等。通過磷酸化修飾，辣木籽蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，表面巰基含量增加且蛋白質(zhì)的溶解性、渾濁度基本未受影響?？寡趸燥@著提高可能是因為：①帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的引入使辣木籽蛋白的靜電相互作用增強(qiáng)。②干燥加熱磷酸化修飾增加了辣木籽蛋白的表面巰基含量。

綜上所述，干燥加熱磷酸化法可作為一種很好的提高蛋白質(zhì)抗氧化特性的方法。此法能在溫和條件下完成，副反應(yīng)少，蛋白質(zhì)變性程度??；同時，采用焦磷酸鹽作為磷酸化試劑，反應(yīng)試劑易于通過透析去除，這為食品添加劑中添加抗氧化劑的創(chuàng)制提供了可能。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。