陳利平，張東鵬，黃紫琪，田君瑞，王夢圓，韓亞偉?

（1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司駐馬店卷煙廠，河南 駐馬店 463000）

卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物，化學(xué)物質(zhì)種類繁多，其中大部分具有毒性作用，本實驗室利用活體小鼠探索建立了體內(nèi)安全評價方法[1]，獲得了很好的實驗效果。后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)這些煙氣成分中一部分具有氧化性，當(dāng)組織或細(xì)胞受到全煙氣暴露時，機(jī)體內(nèi)的氧化-抗氧化平衡被破壞，細(xì)胞會表現(xiàn)出氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，并且引發(fā)機(jī)理性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時，胞內(nèi)的活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）的活性增加，對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等造成不同程度的氧化損傷[2]?；钚匝跏侵笝C(jī)體內(nèi)或大自然中由氧組成，含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱，在正常的生命過程中，活性氧維持在一個正常水平，具有一定的免疫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，是機(jī)體的有效防御系統(tǒng)，但是在一定條件下，由于產(chǎn)生和清除的活性氧失去了正常平衡，通常會導(dǎo)致活性氧對機(jī)體的損傷。細(xì)胞遭受到氧化損傷后，會激活胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)[3]。機(jī)體存在的抗自由基抗氧化兩大防御體系：一類是酶性防御體系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等。另一類是非酶性防御體系，包括谷胱甘肽（GSH）、維生素E、維生素C等[4-5]。本文選取暴露時長1 h組，以SOD、活性氧（ROS）、CAT、GSH-Px、總抗氧化能力（T-AOC）為指標(biāo)，通過對細(xì)胞進(jìn)行卷煙全煙氣暴露處理，研究全煙氣對細(xì)胞抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

V79細(xì)胞株：中科院上海細(xì)胞資源中心；GSH-PX測試試劑、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試試劑盒、CAT測試試劑盒、蛋白定量測試試劑盒、T-AOC檢測試劑盒、ROS測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Pico 17 高速常溫離心機(jī)、NanoDrop2000微量紫外分光光度計：Thermo Scientific；QL-902漩渦混合器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；JS-680B水浴鍋：上海培清科技有限公司；F-7000熒光分光光度計：日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

將V79細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清（FBS）的高糖培養(yǎng)基DMEM中，在25 cm2的一次性培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置的環(huán)境為溫度37 ℃、二氧化碳濃度為 5%、濕度為 95%。生長良好的細(xì)胞呈單層貼壁生長，每2～3 d需要傳代一次，細(xì)胞生長到占瓶底約90%時進(jìn)行傳代，一般選取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗將細(xì)胞懸液用細(xì)胞計數(shù)儀測定濃度，加培養(yǎng)基調(diào)整至實驗需要的濃度，設(shè)置空白組、實驗組和對照組，每組6個重復(fù)，每孔 100 uL。需要在接種細(xì)胞的孔周圍加注100 uLPBS緩沖液，以防邊緣實驗孔的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中蒸發(fā)，影響實驗結(jié)果。

1.3.2 細(xì)胞全煙氣暴露

1.3.2.1 將細(xì)胞接種至微孔膜 取微孔膜一張，光滑面朝上放入培養(yǎng)皿中，加入 1 mLDMEM 培養(yǎng)基，浸潤20 min；將傳代后的細(xì)胞在37 ℃，二氧化碳濃度5%，95%濕度的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。倒出培養(yǎng)基，用 2 mL PBS清洗兩次，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，向培養(yǎng)瓶中加入 3 mLDMEM培養(yǎng)基吹散，向放有微孔膜的培養(yǎng)皿中加入1 mL細(xì)胞懸液，靜置10～20 min，小心轉(zhuǎn)移至二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，換液時，將培養(yǎng)皿傾斜，用移液槍緩慢吸出舊培養(yǎng)基，再緩慢加入 2 mL新培養(yǎng)基，然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱，再培養(yǎng)24 h待用。

1.3.2.2 細(xì)胞全煙氣暴露處理 將接種有細(xì)胞的微孔膜放入全煙氣暴露模型中，實驗組通入煙氣，對照組通入純凈空氣，對細(xì)胞進(jìn)行暴露處理。其中，實驗組設(shè)置0.5、1、1.5 h三個時間組，每個時間組設(shè)置3個濃度組，分別為4支煙/h、6支煙/h、8支煙/h，每支煙的整個燃吸過程大約持續(xù)5 min，均勻的分布于整個暴露過程，其余的時間通如等流量的純凈空氣。稀釋程度按煙氣 60%，空氣 40%。每個時間組設(shè)置一個對照，對細(xì)胞進(jìn)行同時長同流量的暴露處理。

1.3.3 細(xì)胞ROS含量檢測

采用DCF法檢測全煙氣暴露后，用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[6-7]。

將DCFH-DA配制成濃度為20 μM的溶液，避光放置。取新的培養(yǎng)皿，將全煙氣暴露處理后細(xì)胞連同微孔膜一起放置于培養(yǎng)皿中，將 1 mL DCFH-DA的培養(yǎng)基溶液加入培養(yǎng)皿，放入二氧化碳培養(yǎng)基孵育1 h。

將培養(yǎng)基小心吸棄，加入1 mL的0.25%胰酶消化 2 min 后，再直接加入 1 mL PBS，輕輕吹打，使微孔膜上的細(xì)胞脫落下來，收集細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 2 mL 離心管，1 000 r/min 離心 7 min。

將上清吸棄，用2 mL PBS清洗2次，離心收集細(xì)胞沉淀。

用PBS將細(xì)胞沉淀重懸，調(diào)整至1×106個/mL，上熒光分光光度計，激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm測吸光度。

1.3.4 細(xì)胞破碎

首先將細(xì)胞用胰酶消化下來，接著收集細(xì)胞懸液，然后 1 000 G 離心 7 min，棄上清。用 PBS小心清洗兩次，再次離心，用PBS重懸。本實驗中，把PBS重懸后細(xì)胞懸液濃度全部調(diào)整為1×105個/mL。取0.7 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中，將離心管放入液氮中冷凍30 s，取出后放入冰水混合物中解凍10 min，如此反復(fù)凍融3次，所得細(xì)胞破碎液可直接用于檢測。

1.3.5 全煙氣暴露后細(xì)胞的蛋白濃度測定

使用蛋白定量測試盒測定待測細(xì)胞的蛋白濃度。

1.3.6 全煙氣暴露后細(xì)胞的T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性檢測

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒，檢測待測細(xì)胞的 SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC活性，并根據(jù)說明所給的公式計算結(jié)果。實驗進(jìn)行三次重復(fù)，取平均值，并計算偏差。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用平行試驗的平均值，試驗結(jié)果用 Microsoft Office Excel 2016 對其進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全煙氣暴露處理對V79細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

在真核細(xì)胞的有氧呼吸過程中，有一部分氧沒有被完全還原，生成具有較強(qiáng)氧化作用的ROS，包括羥自由基過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子、（HO-）等[8]。正常條件下，生命過程中所產(chǎn)生的活性氧會維持在一個正常的水平，本身具有一定的免疫以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，屬于機(jī)體有效防御系統(tǒng)的一部分，但是過多的活性氧會對細(xì)胞和機(jī)體造成損傷，由于性質(zhì)活潑，它會與蛋白質(zhì)、核酸和脂肪發(fā)生反應(yīng)，破壞這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，擾亂細(xì)胞的正常功能[9-10]。

實驗分別對各組細(xì)胞進(jìn)行一小時的空氣暴露和4、6、8支煙/h濃度的煙氣暴露處理，然后用熒光分光光度計分別檢測各組的吸光度。結(jié)果顯示，同時長條件下，V79細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨著煙氣濃度的提高而上升，各濃度組與對照組比較皆有顯著性差異（P<0.05）。當(dāng)全煙氣濃度為8支煙/h，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平為對照組的近2.5倍，說明全煙氣對V79細(xì)胞內(nèi)的ROS水平影響很大，V79細(xì)胞內(nèi)的ROS水平迅速升高，是細(xì)胞大量死亡的原因之一。結(jié)果見圖1。

圖1 全煙氣暴露處理后細(xì)胞內(nèi)ROS相對含量Fig.1 Relative content of ROS in cells after whole smoke exposure treatment

2.2 全煙氣暴露處理對V79細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響

SOD是機(jī)體對抗氧自由基的酶促防御體系中重要的組成部分。SOD能催化機(jī)體內(nèi)的超氧化物歧化反應(yīng)，在抗氧化酶中處于至關(guān)重要的地位。在活性氧清除系統(tǒng)里，它是抗氧化酶中第一個發(fā)揮作用的[11]。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基（O2-）保護(hù)細(xì)胞免受損傷[12]。因此，細(xì)胞內(nèi)的SOD的含量能夠反映細(xì)胞的抗氧化能力。本試驗中，對V79細(xì)胞進(jìn)行全煙氣暴露后，4支煙/h濃度下，細(xì)胞內(nèi)的SOD活性較對照組略有提升，而隨著煙氣濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的 SOD活性明顯降低,詳見表1，圖2。SOD是已知的機(jī)體中，目前惟一能夠特異性地清除體內(nèi)超氧自由基的抗氧化酶，SOD可以把機(jī)體內(nèi)過量的超氧自由基歧化成過氧化氫，然后在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為水，防止細(xì)胞被自由基傷害[13]。實驗結(jié)果表明，低劑量的煙氣刺激下，SOD活性出現(xiàn)了短暫的提升，來消除細(xì)胞因煙氣刺激產(chǎn)生的過量活性氧。而隨著煙氣劑量的增高，SOD會因消除自由基造成自身的損耗，這直接反映于細(xì)胞內(nèi)SOD活性的降低，細(xì)胞對超氧化物的還原能力也隨之弱化，無法抵御煙氣刺激對細(xì)胞的損傷。

表1 全煙氣對V79細(xì)胞SOD活性的影響Table 1 Effect of whole smoke on SOD activity of V79 cells

圖2 全煙氣對V79細(xì)胞SOD的影響結(jié)果圖Fig.2 Results of the effect of whole smoke on V79 cell SOD

2.3 全煙氣暴露處理對 V79細(xì)胞內(nèi)GSH-PX活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。對于單個細(xì)胞，細(xì)胞膜的完整性是保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保障各項生理活動有序進(jìn)行的重要基礎(chǔ)[14]。每當(dāng)細(xì)胞受到外援化合物的攻擊時，細(xì)胞膜是最先受到損傷的，而細(xì)胞膜損傷會導(dǎo)致膜內(nèi)物質(zhì)的外逸，致使細(xì)胞死亡。在細(xì)胞的生命活動中，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)過量的自由基時，超氧自由基被SOD歧化成H2O2，然后在GSH-PX和過氧化氫酶的催化作用下，將其轉(zhuǎn)化為水，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。對于經(jīng)煙氣暴露的 V79細(xì)胞，同時間下，GSH-PX的活力隨著煙氣濃度的升高而降低，結(jié)果具有顯著性（P<0.05），詳見表2，圖3。結(jié)果說明，全煙氣可能會抑制細(xì)胞內(nèi)GSH-PX的活性，同時，為了清除細(xì)胞內(nèi)由煙氣刺激產(chǎn)生的過量自由基，也消耗了不少GSH-PX，造成機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的降低。

表2 全煙氣對V79細(xì)胞GSH-PX活性的影響Table 2 Effect of whole smoke on GSH-PX activity of V79 cells

圖3 全煙氣對V79細(xì)胞GSH-PX活力的影響結(jié)果圖Fig.3 Effect of whole smoke on the vitality of GSH-PX in V79 cells

2.4 全煙氣暴露處理對V79細(xì)胞內(nèi)CAT活力的影響

CAT是一類末端氧化酶，是生物防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一[15]。CAT在細(xì)胞中與GSH-PX一起清除代謝產(chǎn)生的過氧化氫，使細(xì)胞免受過氧化物的毒害[16]。本實驗中，經(jīng)煙氣暴露處理的V79細(xì)胞中，CAT的活力值隨著煙氣濃度的升高而降低。實驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果具有顯著性（P<0.05），詳見表3，圖4。

表3 全煙氣對V79細(xì)胞CAT活性的影響Table 3 Effect of whole smoke on the activity of V79 cell CAT

圖4 全煙氣對V79細(xì)胞CAT活力的影響結(jié)果圖Fig.4 The effect of whole smoke on the vitality of V79 cell CAT

2.5 全煙氣暴露處理對V79細(xì)胞內(nèi)T-AOC活力的影響

目前的研究中，T-AOC是常用來反映機(jī)體抗氧化功能情況的一個重要的綜合性指標(biāo)，它可以顯示機(jī)體中非酶促系統(tǒng)以及抗氧化酶系統(tǒng)應(yīng)對外來刺激的代償能力和機(jī)體內(nèi)自由基的代謝情況[17]。T-AOC衡量機(jī)體具有的總的抗氧化能力，當(dāng)檢測到機(jī)體T-AOC活力顯著降低時，說明機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)受到了大量消耗，間接反映了機(jī)體內(nèi)有過量的自由基產(chǎn)生，這在研究機(jī)體是否受到氧化損傷時，是某些特定的單項抗氧化劑指標(biāo)所無法替代的[18-19]。本實驗中，當(dāng)V79細(xì)胞受到1 h不同濃度的煙氣暴露后，T-AOC活力較對照組顯著下降（P<0.05），詳見表4，圖5。而且隨著濃度的增加，T-AOC的活性下降的更快，這說明煙氣使得細(xì)胞整體的抗氧化能力下降，細(xì)胞內(nèi)的自由基無法及時被清除，對細(xì)胞造成了一定的氧化損傷。

表4 全煙氣對V79細(xì)胞T-AOC活性的影響Table 4 Effect of whole smoke on the activity of T-AOC in V79 cells

圖5 全煙氣對V79細(xì)胞T-AOC活力的影響結(jié)果圖Fig.5 The effect of whole smoke on the vitality of V79 cell T-AOC

3 結(jié)論

通過對 V79細(xì)胞進(jìn)行1 h不同濃度4、6、8支煙/h的全煙氣暴露，選取 ROS、SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC為指標(biāo)，研究全煙氣對細(xì)胞抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，全煙氣會對細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生消耗和抑制，導(dǎo)致胞內(nèi)的活性氧自由基含量增加，抑制的效果隨煙氣濃度的增加而愈加顯著。過量的活性氧會導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。