田 甜，裴鑫禮，劉海英?

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

膽固醇是動物組織細胞的重要組成部分，同時也是人體代謝不可或缺的原料。但當(dāng)其過量時便會導(dǎo)致高膽固醇血癥，對機體健康產(chǎn)生負面影響。引起心血管疾病的一個重要原因就是高膽固醇血癥。機體可在肝臟中自行合成膽固醇，也可以經(jīng)過腸道從食物中攝入膽固醇，其中跨膜蛋白質(zhì) NPC1L1（Niemalnn-Pick C1-Like 1）在膽固醇的吸收過程中起到關(guān)鍵作用[1]。而機體排出膽固醇主要依靠膽汁酸，受體 liver X receptor α（LXR-α）可以抑制膽汁酸吸收，增加膽固醇的排出[2]。而 ABCG5，ABCG8（ATP-binding cassette subfamily G5，G8）可以促進膽固醇排泄到膽汁中[3]。

腸道菌群是人體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，與人體是共生關(guān)系，對人體代謝、腸道健康都起著重要作用。高脂膳食不但會升高機體的膽固醇水平，還會迅速的改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，但是其機制仍然不清楚。Cani等[4]認為高脂膳食導(dǎo)致破壞腸道通透性，最終使有害菌大量進入。Allison等[5]認為高脂膳食后結(jié)腸總膽汁酸量上升，產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），破壞了腸道微環(huán)境。由于菌群對膽汁的耐受性存在差異，而最終導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)的失衡。

蕎麥是東亞地區(qū)的一種古老農(nóng)作物，其含有豐富的可溶性膳食纖維和微量元素。中醫(yī)學(xué)認為，蕎麥具有一定治療腸道疾病的功能?，F(xiàn)代研究表明，蕎麥具有一定降血壓和降血脂作用[6]。本研究制備了高膽固醇脂血癥小鼠模型，并利用高、低兩種劑量的蕎麥粉日糧飼喂小鼠，分析不同比例的蕎麥日糧對高膽固醇血癥小鼠腸道膽固醇吸收和菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蕎麥，產(chǎn)自甘肅：山東鶴來香食品有限公司；標準飼料（AIN-93M）、高膽固醇脂血癥模型飼料及蕎麥實驗組飼料：南通特洛菲飼料科技有限公司；Trizol裂解液、cDNA合成試劑盒、DEPC：上海生工生物工程有限公司；SYBR Green PCR試劑盒：QIAGEN公司；H&E染色試劑盒：碧云天生物試劑公司；剛果紅：上海遠航試劑廠；其他試劑：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

本實驗中所有實驗動物均為6～8周齡，雄性C57BL/6小鼠（SPF級），體重20～22 g，動物合格證書編號SCXK(SU)2013-0003，倫理審查號JN.No. 20170704-20171015 [88]：蘇州格瑞斯威生物科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

UV-2100紫外分光光度計：日本島津公司；全自動血液生化分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；F200酶標儀：瑞士恩科生物科技有限公司； 5424R高速臺式冷凍離心機：德國艾本德有限公司；組織包埋機、切片機：德國徠卡儀器有限公司；電泳儀：美國伯樂公司；7900HT Fast Real-Time PCR 儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；MISEQ 測序儀：美國 Illumina 公司；Agilent 2100 生物分析儀：美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)及分組

在 AIN-93M 標準飼料的基礎(chǔ)上，參考 De Sousa[7]飼料配方修改，用蕎麥分別代替模型飼料中一半和全部的碳水化合物供能原料（玉米淀粉和麥芽糊精），形成對應(yīng)的蕎麥低、高劑量飼料。使用維持性飼料適應(yīng)性飼喂一周后，將雄性C57BL/6小鼠隨機分配到各組，分別為空白對照組（N）、高膽固醇模型組（H）、模型+蕎麥低劑量組（F）和模型+蕎麥高劑量組（G）組，每組10只。小鼠同室分籠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度控制在22～26 ℃，相對濕度控制在50%～70%，12 h光明12 h黑暗交替照明，自由采食，分別飼喂12周。小鼠飼料配方見表1。

表1 小鼠飼料配方Table 1 Ingredient composition of the diets fed to mice

1.3.2 動物檢測樣品的采集

實驗小鼠在12周的實驗結(jié)束后禁食不禁水，用乙醚麻醉，摘眼球取血。血漿靜置30 min，經(jīng)離心（4 ℃，3 000 r/min，10 min）后，取上清，-80 ℃保存，用于血清生化指標檢測。

取小鼠完整小腸，取出小腸中所有內(nèi)容物，移至凍存管中，立即轉(zhuǎn)至-80 ℃環(huán)境保存，用于小鼠腸道內(nèi)容物多樣性分析實驗。取近盲段的小段小腸放置于福爾馬林溶液固定，H&E染色觀察；取小段小腸放置于1 mL Trizol試劑中，用于小腸膽固醇代謝基因的表達水平測定。

1.3.3 小鼠小腸組織 DNA 提取及實時熒光定量PCR實驗

提取腸道組織RNA，參照試劑盒操作說明書進行。使用NanoDrop?ND-1000檢測260/280吸光度值（1.8～2.0之間）及其濃度，使用變性瓊脂糖電泳進行總RNA質(zhì)量鑒定。采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）檢測小腸中的膽固醇代謝相關(guān)基因。將SYBR Green Supermix染料、目的基因的特異性引物及模板DNA 置于 Bio-Rad CFX Connect實時體系中，反應(yīng)體系為 20 μL，包括 SYBR Green Supermix 染料10 μL，上、下游引物各 1 μL，稀釋至適宜濃度的模板DNA 8 μL。進行 qPCR反應(yīng)，將 cDNA所有樣品分別配至相關(guān)反應(yīng)體系，加樣后將載有樣品的PCR板置于PCR儀上進行反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，用 2-ΔΔCt方法對基因表達進行相對量化。具體引物序列如表2所示。引物合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表2 實時定量PCR使用引物列表Table 2 Real-time quantitative PCR using primer lists

1.3.4 高通量測序分析腸道內(nèi)容物菌群多樣性

小鼠腸道菌群組成分析采用 Illumina-MiSeq高通量測序技術(shù)進行。取出保存好的腸道內(nèi)容物，按1.3.3中的方式提取其中細菌的DNA，通過PCR引物擴增細菌16S rDNA的V3、V4區(qū)，用切膠回收試劑盒回收V3、V4區(qū)的PCR產(chǎn)物，采用Pico Green熒光染料法定量膠回收產(chǎn)物，樣品經(jīng)檢測合格后構(gòu)建文庫，隨后進行cluster的制備和測序，獲得下機數(shù)據(jù)后進行生物信息學(xué)分析。文庫構(gòu)建和生物信息學(xué)分析由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用 IBM SPSS 20和 GraphPad prism 6統(tǒng)計學(xué)軟件處理，結(jié)果以平均值±標準差的方式表示。多組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計分析采用one-way ANOVA方差分析（*P<0.05，**P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥對實驗小鼠血清脂代謝指標的影響

血清膽固醇水平是預(yù)測冠心病、動脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的主要指標[8]。當(dāng)血液中膽固醇水平出現(xiàn)異常，能夠較為直接反應(yīng)機體對于膽固醇代謝調(diào)節(jié)能力的變化。

蕎麥對小鼠血清脂代謝指標的影響見圖1。由圖1(a)可知，經(jīng)過12周的高膽固醇日糧飼喂后，相較于空白組，高膽固醇模型組小鼠的血清總膽固醇（TC）含量極顯著性升高（P<0.01）。與高膽固醇模型組相比，模型+蕎麥兩劑量組小鼠血清TC含量極顯著性降低（P<0.01）。由圖1(b)可知，與空白組相比，高膽固醇模型組的小鼠血清甘油三酯（TG）含量無顯著性差異。而與高膽固醇模型組相比，模型+蕎麥兩劑量組血清TG顯著降低（P<0.01）。由圖1(c)可知，相較于空白組，高膽固醇模型組的小鼠血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量極顯著性降低（P<0.01）。與高膽固醇模型組相比，模型+蕎麥高劑量組可有效升高小鼠血清HDL-C含量（P<0.01），但是劑量蕎麥組的HDL-C含量升高不顯著。由圖1(d)可知，與空白組相比，高膽固醇模型組小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量極顯著性升高（P<0.01）。與高膽固醇模型組相比，模型+蕎麥兩劑量組小鼠血清 LDL-C含量極顯著降低（P<0.01）。

圖1 蕎麥對小鼠血清脂代謝指標的影響Fig.1 Effects of buckwheat on serum lipid metabolism of mice

研究表明，機體內(nèi)TC含量與心腦血管疾病的發(fā)病率緊密相關(guān)[9]。因此，嚴格控制膽固醇含量至關(guān)重要。上述結(jié)果表明，經(jīng)過12周的高膽固醇日糧飼喂后，模型飼料會誘導(dǎo)模型組小鼠血清TC、HDL-C和LDL-C含量極顯著發(fā)生變化，表明實驗造模成功。蕎麥日糧可有效的降低小鼠血清 TC、LDL-C含量，升高HDL-C含量，表明使用蕎麥日糧對小鼠血清膽固含量有非常有益的調(diào)節(jié)作用。

2.2 蕎麥對高膽固醇脂血癥小鼠腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響

腸道是機體最大的消化和免疫器官，小腸絨毛粘膜是吸收膽固醇的主要部位。小腸絨毛損傷會導(dǎo)致膽固醇吸收量增加，加大腸道消化吸收膽固醇的運轉(zhuǎn)負荷[10]。由圖2可知，空白組的小鼠小腸絨毛細長，排列有序且結(jié)構(gòu)完整。高膽固醇模型組腸壁變厚，小鼠腸黏膜絨毛的完整性被破壞，表現(xiàn)為小腸絨毛短粗，絨毛頂端上皮下間隙增大，上皮層與固有層分離。部分絨毛頂端上皮層破損明顯，縮短變粗，結(jié)構(gòu)完整性較差，上皮部分脫落現(xiàn)象。蕎麥兩劑量組小鼠的小腸絨毛排列恢復(fù)比較整齊，腫脹程度較輕，絨毛長度和粗細較模型組顯著變長變細。以上結(jié)果說明，低比例和高比例蕎麥日糧均能對由高膽固醇日糧所引起的小鼠小腸結(jié)構(gòu)損傷起到恢復(fù)作用。

圖2 蕎麥對小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)觀察的影響Fig.2 Effects of buckwheat on intestinal tissue morphology of mice

2.3 蕎麥對高膽固醇脂血癥小鼠腸道吸收膽固醇功能的影響

小腸上皮細胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體ABCG5/8作為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，負責(zé)使膽固醇在小腸的吸收減少，控制血漿中膽固醇水平。表達于小腸上皮細胞刷狀緣的ABCG5/ABCG8蛋白，二者同時表達，結(jié)合成二聚體時才能起作用，它們可以將小腸吸收的游離膽固醇逆轉(zhuǎn)運至腸腔隨糞便排出。有研究表明小鼠ABCG5和ABCG8 mRNA過表達則會降低膽固醇的吸收[11]。蕎麥對小鼠腸道 NPC1L1、ABCG5、ABCG8的mRNA相對表達量的影響見圖3。

圖3 蕎麥對小鼠腸道NPC1L1、ABCG5、ABCG8的mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effects of buckwheat on mRNA relative expression of NPC1L1，ABCG5 and ABCG8 in intestinal tract of mice

相對于對照組，模型組小鼠腸道的 ABCG8 mRNA表達極顯著下降。相對于模型組，蕎麥組ABCG8的mRNA表達量無明顯變化。相對于對照組，模型組的ABCG5 mRNA表達極顯著下降。相對于模型組，蕎麥組小鼠腸道中ABCG5 mRNA的表達量都極顯著上升。實驗結(jié)果表明，蕎麥日糧提高了小腸的 ABCG5/ABCG8蛋白表mRNA達量，進而可以減少小腸對膽固醇的吸收。

相對于對照組，模型組腸道的 NPC1L1的mRNA表達極顯著上升。相對于模型組，蕎麥的低劑量和高劑量組的 NPC1L1 的 mRNA表達極顯著下降。NPC1L1蛋白主要在小腸上皮細胞刷狀緣高度表達，是參與小腸膽固醇吸收的重要蛋白，主要介導(dǎo)小腸從飲食和膽汁中吸收游離的膽固醇進入腸粘膜[12]。而膽固醇在體內(nèi)的主要吸收部位是靠近空腸的小腸部分，不僅吸收膳食中的膽固醇，也吸收膽汁膽固醇。NPC1L1的 mRNA表達量降低，則從腸道中吸收的膽固醇會減少。實驗結(jié)果表明，相對于模型組，不同比例的蕎麥日糧會降低減少NPC1L1的mRNA表達量，進而減少腸道對膽固醇的吸收。

高密度脂蛋白（HDL）通過多種機制發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用，其中最重要的是參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運（Reverse cholesterol transport，CT），防止膽固醇在動脈壁沉積，并將膽固醇從血管壁運送至肝臟被清除。細胞游離膽固醇的單向轉(zhuǎn)運無脂或貧脂載脂蛋白與 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子 A1（ABCA1）[13]，形成新的HDL。ABCA1是HDL形成的關(guān)鍵蛋白。清道夫受體B類I型（SR-B I）是一種多配體膜受體蛋白質(zhì)，也是目前唯一公認的HDL受體，在膽固醇RCT的最后一步與HDL發(fā)生反應(yīng)[14]。此外，血漿中的膽固醇也會由 SR-B I介導(dǎo)，轉(zhuǎn)運到肝臟，用于膽汁酸的生產(chǎn)。蕎麥對小鼠腸道SR-B I、ABCA1的mRNA相對表達量的影響見圖4，由圖4結(jié)果可知，空白組小鼠腸道ABCA1和SR-B I的基因表達均極顯著高于模型組（P<0.01）；蕎麥低、高劑量組小鼠腸ABCA1、SR-B I基因均與模型組有極顯著性差異（P<0.01）。這表明相對于模型組，蕎麥低、高劑量組的RCT作用有極顯著提升。上述結(jié)果表明，蕎麥日糧使高膽固醇脂血癥小鼠腸道對膽固醇的吸收作用極顯著降低，而膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運作用顯著提升。

圖4 蕎麥對小鼠腸道SR-B I、ABCA1的mRNA相對表達量的影響Fig.4 Effects of buckwheat on mRNA relative expression of SR-B I and ABCA1in intestinal tract of mice

2.4 蕎麥對高膽固醇脂血癥小鼠腸道內(nèi)容物菌群多樣性影響

單一樣品的復(fù)雜程度一般采用 Alpha多樣性來分析。常見的 Alpha多樣性參數(shù)是指 ACE、Chao1、Shannon和Simpson。ACE和Chao1指數(shù)是根據(jù)所測得的 OTU值來預(yù)測樣本中微生物的豐度，數(shù)值越大，物種越豐富。Shannon和Simpson指數(shù)反映腸道菌群中所有物種數(shù)及每個物種數(shù)占總體的比例，Shannon越大，Simpson越小，物種越豐富。Coverage是指覆蓋程度，數(shù)值越大，表明準確性越高。蕎麥飼喂的實驗小鼠腸道細菌菌群多樣性指數(shù)分析見表3。

表3 蕎麥飼喂的實驗小鼠腸道細菌菌群多樣性指數(shù)分析Fig.3 Analysis on the diversity index of intestinal microflora of buckwheat of coarse cereals

由表3可知，ACE和Chao1參數(shù)數(shù)據(jù)相近，Shannon參數(shù)的趨勢與 ACE和 Chao1兩參數(shù)一致。模型組ACE和Chao1、Shannon指數(shù)顯著性低于空白組，表明高脂日糧會減少小鼠腸道微生物的豐度。蕎麥低劑量組的小鼠腸道菌群豐度降低，與其他組顯示出顯著差異，表明低劑量蕎麥的食用可能對腸道菌群的穩(wěn)定產(chǎn)生負面影響。但是蕎麥高劑量組對豐度的提升有明顯的促進效果，顯示大量食用蕎麥有益于腸道菌群的穩(wěn)定和豐富。

經(jīng)過注釋，共有擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（firmicutes）、變形菌門（proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Epsilonbacteraeota、Actinobacteria、Cyanobacteria、Patescibacteria、Deferribacteres等12個門被鑒定。如圖5結(jié)果顯示，各實驗組小鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌群均以擬桿菌門、疣微菌門、厚壁菌門和變形菌門4個菌門為主，所占比例均在95%以上?？瞻捉M中擬桿菌門相對豐度最高，達到50%。與空白組相比，高膽固醇組的小鼠腸道菌群中擬桿菌門仍為優(yōu)勢菌群，但相對豐度顯著性降低（P<0.05），約為25%。厚壁菌門比重增加，這與Jorge[15]等的研究結(jié)果相似。蕎麥低劑量組的小鼠擬桿菌門含量極低，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，所占比重較高，達到70%。但是，蕎麥高劑量組的小鼠擬桿菌門比重較高，達到30%。

圖5 門和種屬水平上小鼠腸道菌群相對分布Fig.5 The relative abundance of intestinal microbes distributed on phylum and species level

經(jīng)過物種注釋，脫硫弧菌屬（Desulfovibrionaceae、Bacteroides、阿克曼菌屬（Akkermansia）、另枝菌屬（Alistipes）、Muribaculaceae、Unclassified、Helicobacter、Alloprevotella、Coprostanoligenes等72個屬被注釋。

空白組中Desulfovibrionaceae，Bacteroides，Akkermansia和Alistipes為主要優(yōu)勢菌群，相對豐富為 53.4%。在高膽固醇誘導(dǎo)干預(yù)后，模型組小鼠腸道菌群的脫硫弧菌屬無明顯變化，擬桿菌屬顯著降低，阿克曼菌屬豐度升高，另枝菌屬豐度顯著降低。與高膽固醇模型組相比，模型+蕎麥低劑量組優(yōu)勢菌為糞桿菌屬（Faecalibaculum）和毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）屬。蕎麥高劑量組的優(yōu)勢菌群主要為脫硫弧菌、擬桿菌屬和另枝菌屬。蕎麥低劑量組小鼠腸道菌群中擬桿菌屬相

對豐度極低（< 0.1%），其主要優(yōu)勢菌群中Faecalibaculum相對豐度較模型組顯著升高（0.2% vs 16.1%，P<0.01），與空白組差異不大；較模型組降低（9.1% vs 1.2%，P<0.01），模型組與空白組小鼠腸道菌群的Lachnospiraceae相對豐度無顯著差異。蕎麥高劑量組的擬桿菌屬與模型組相比略有升高（11.9% vs 18.9%）；脫硫弧菌屬較模型組有顯著升高（8.2% vs 23.2%，P<0.01），另枝菌屬較模型組有顯著升高（1.8% vs 8.6%，P<0.01）。

3 結(jié)論

本文研究了不同比例的蕎麥日糧對膽固醇脂血癥小鼠的腸道膽固醇吸收、排出功能和腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，無論是低比例還是高比例的蕎麥攝入都可降低膽固醇的腸道吸收，提高膽固醇的腸道排出。但是，低比例的蕎麥攝入對腸道菌群的豐度不利，而高比例的蕎麥攝入可以顯著改善腸道菌群的穩(wěn)定性和豐度。本研究可以為小宗谷物的應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。