王雅慧，劉曉宏，雍明麗，熊愛生，蘇小俊

基于代謝組學(xué)分析絲瓜果肉褐變過程酚酸類物質(zhì)變化

王雅慧1,2，劉曉宏1，雍明麗1，熊愛生2，蘇小俊1

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095

【目的】褐變是影響絲瓜商品價(jià)值的主要因素，酚酸類物質(zhì)代謝是導(dǎo)致褐變的主要原因。研究絲瓜褐變過程酚酸類物質(zhì)變化有助于深入了解絲瓜褐變的生理機(jī)制，為絲瓜的貯藏和加工、品種選育和種質(zhì)資源利用提供依據(jù)?！痉椒ā恳阅秃肿兘z瓜品種‘2D-2’和易褐變絲瓜品種‘35D-7’為試驗(yàn)材料，測定其鮮切后放置不同時(shí)間的褐變程度、總酚含量和多酚氧化酶活性，并借助超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）聯(lián)用的方法對沸水浴褐變前后的絲瓜果肉樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析?！窘Y(jié)果】鮮切褐變處理后，2個(gè)品種絲瓜果肉中的多酚含量及多酚氧化酶活性均有所增加。與‘2D-2’相比，絲瓜品種‘35D-7’的褐變程度較重，放置24 h后的總酚含量約為‘2D-2’的3倍以上；多酚氧化酶活性在放置12 h時(shí)最高，達(dá)174.23 U·g-1·min-1。通過代謝組學(xué)對易褐變絲瓜品種‘35D-7’酶促褐變反應(yīng)底物及褐變前后的差異代謝物進(jìn)行分析，經(jīng)檢測共獲得420種代謝物，其中229種為差異代謝物。經(jīng)褐變處理后，140種差異代謝物含量顯著下降，89種升高。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，苯丙素類生物合成、脯氨酸代謝和類黃酮生物合成等代謝途徑中的代謝物含量發(fā)生了顯著變化。代謝組定性定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試樣品絲瓜果肉中鑒定出的酚酸類物質(zhì)中對香豆酸含量最高，其次是松柏苷和龍膽酸。經(jīng)褐變處理后，共有35種差異代謝物被鑒定為酚酸類代謝物。其中，松柏醛、3-氨基水楊酸和咖啡酸苯乙酯的含量下降最明顯。相反地，紫丁香苷、2,5-二羥基苯甲酸O-己糖苷和異綠原酸A的含量顯著提高，log2變化倍數(shù)達(dá)10以上。【結(jié)論】易褐變絲瓜品種‘35D-7’果肉中的主要酚類物質(zhì)為對香豆酸，參與絲瓜‘35D-7’果肉褐變過程的主要酚酸類代謝物有松柏醛、紫丁香苷和異綠原酸A等。

絲瓜；果肉；酶促褐變；代謝組；酚酸

0 引言

【研究意義】絲瓜（）是葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Mill.）一年生瓜類蔬菜作物。褐變是貯藏、加工和運(yùn)輸過程中影響絲瓜商品價(jià)值的一大障礙，探究絲瓜褐變生理及分子機(jī)制是開展絲瓜育種的重要研究方向[1]。開展絲瓜褐變過程代謝物變化研究，有助于深入了解絲瓜褐變過程的生理機(jī)制，進(jìn)一步為絲瓜的品種改良提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】按照機(jī)理的差異，褐變可以分為兩類：由氧化酶催化酚類物質(zhì)形成醌類化合物引起的酶促褐變和無氧化酶參與的非酶促褐變[2]。絲瓜的褐變主要由酶促褐變造成，當(dāng)絲瓜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)、氧化酶及氧氣3個(gè)條件同時(shí)存在，便會(huì)發(fā)生酶促褐變反應(yīng)[3]。目前我國學(xué)者已經(jīng)對耐褐變絲瓜種質(zhì)進(jìn)行了篩選，并在絲瓜褐變的生理機(jī)制方面進(jìn)行了初步的探究[4-6]。研究證明，絲瓜果實(shí)的多酚氧化酶活性、總酚類化合物含量與絲瓜褐化速率具有直接關(guān)系[7]。隨著組學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們開始從分子生物學(xué)層面上探究絲瓜褐變的機(jī)理[8-9]。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，、、等氧化酶基因?qū)z瓜褐變的調(diào)控作用逐步被鑒定[10-11]。利用代謝組學(xué)方法，Lee等[12]發(fā)現(xiàn)‘Braeburn’蘋果果實(shí)內(nèi)部褐變與乙醛、乙醇和乙酯的增加有關(guān)。研究人員還基于代謝組分析發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯中的內(nèi)源型抗褐變化合物，證實(shí)了黃嘌呤對褐變的抑制作用[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同植物中酚類物質(zhì)的組成和含量存在一定差異，作為酶促褐變的底物，酚類物質(zhì)的特性對褐變具有重要影響。溫文旭等[14]利用超高效液相色譜法基于14種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品對絲瓜酚類物質(zhì)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)龍膽酸是絲瓜中的主要酚類物質(zhì)，但受標(biāo)準(zhǔn)品的限制，所檢測到的酚類物質(zhì)種類有限。廣泛靶向代謝組具有高通量、超靈敏、廣覆蓋的特點(diǎn)，可以一次性定性定量檢測大量代謝物，目前已被廣泛應(yīng)用于代謝通路分析。借助代謝組學(xué)方法，有助于更好地分析絲瓜褐變過程的代謝物變化，探尋絲瓜褐變的發(fā)生機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選用兩個(gè)具有不同抗褐變能力的絲瓜品種，對其褐變水平進(jìn)行測定，并采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法對易褐變絲瓜品種褐變處理前后果肉中的代謝組學(xué)進(jìn)行分析，旨在鑒定絲瓜褐變過程中差異代謝物及相關(guān)代謝通路，為進(jìn)一步揭示絲瓜褐變的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

以易褐變的短棒肉絲瓜‘35D-7’及耐褐變的早熟絲瓜品種‘2D-2’為試驗(yàn)材料，2020年2月21日于20℃溫水中浸種8 h后，次日于電熱溫床穴盤中育苗。2020年3月20日，將幼苗定植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合科研基地（江蘇省南京市六合區(qū)竹鎮(zhèn)鎮(zhèn)金磁社區(qū)）6 m塑料大棚內(nèi)，大棚按2.5 m寬分成東西兩畦，定植前3 d提前鋪地膜。絲瓜采用吊蔓栽培，2020年5月20日進(jìn)行授粉，授粉后10 d的絲瓜果實(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。選取生長狀態(tài)一致的絲瓜果實(shí)，鮮切褐變處理試驗(yàn)將果實(shí)清洗后切割為厚0.5 cm左右的薄片，靜置于室溫（25±2℃）條件下，分別于處理后0、12和24 h對絲瓜果肉進(jìn)行取樣，取樣后立即進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。代謝組測定選用易褐變絲瓜品種‘35D-7’完成，以處理前絲瓜樣品為對照組，經(jīng)沸水浴5 min后的樣品為褐變處理組，樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱中備用。試驗(yàn)材料的處理共設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 生理指標(biāo)測定

1.2.1 總酚含量的測定 絲瓜果實(shí)中的總酚含量按照福林酚（Folin-Ciocalteu）法進(jìn)行測定[15]，稱取1 g絲瓜果肉，加入2 mL 80%的乙醇提取劑，在冰浴條件下研磨至勻漿，經(jīng)常溫離心后，上清液即為絲瓜多酚物質(zhì)粗提液。吸取1 mL粗提液，加入0.5 mol·L-1福林酚溶液1.5 mL，混勻后靜置5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液3 mL，加超純水定容至10 mL，在黑暗條件下反應(yīng)1 h后于750 nm下測定吸光值。利用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.2.2 多酚氧化酶活性的測定 多酚氧化酶活性的測定借助多酚氧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所，A136-1-1）完成，反應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行（http://www.njjcbio.com/products.asp?id=2617），以每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中，使420 nm處吸光度值變化0.01為一個(gè)酶活力單位計(jì)算多酚氧化酶活性。

1.3 代謝組測定與分析

1.3.1 代謝產(chǎn)物的提取 將絲瓜果實(shí)樣品置于凍干機(jī)Scientz-100F中進(jìn)行真空冷凍干燥，并借助研磨儀（MM400，Retsch）研磨至粉末狀，研磨條件為30 Hz、1.5 min。稱取100 mg粉末，溶解于600 μL 70%甲醇提取液中，于4℃冰箱保存過夜，其間進(jìn)行間斷渦旋，以提高提取效率。經(jīng)10 000×離心10 min后，吸取上清液，于0.22 μm的微孔濾膜過濾后保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.3.2 色譜及質(zhì)譜采集條件 超高效液相色譜UPLC于Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A完成，色譜柱選用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm×100 mm），流動(dòng)相為A相（超純水），B相（乙腈），A相和B相中均加入0.04%的乙酸。初始B相比例為5%，10 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持1 min，11—11.1 min時(shí)B相比例降為5%并平衡至14 min。流速為0.35 mL·min-1，柱溫40℃，進(jìn)樣體積為4 μL。

質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源溫度為550℃，質(zhì)譜電壓為5 500 V，簾氣30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。對每個(gè)離子對的掃描檢測在三重四級(jí)桿中根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能完成。

代謝組的測定由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成，基于邁維代謝自建數(shù)據(jù)庫MWDB根據(jù)二級(jí)譜信息對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果

2.1 鮮切后不同時(shí)間絲瓜果肉褐變程度比較

對鮮切后室溫放置的不同品種絲瓜果實(shí)進(jìn)行比較可見，處理前兩個(gè)絲瓜品種‘2D-2’和‘35D-7’果肉均呈乳白色；室溫放置12 h后，兩個(gè)品種的絲瓜果肉均開始略微發(fā)黃，‘35D-7’的果肉上呈現(xiàn)出少量褐色斑點(diǎn)；鮮切放置24 h后，‘2D-2’絲瓜果肉與12 h相比無明顯變化，絲瓜‘35D-7’果肉的褐化面積增加（圖1）。

2.2 鮮切后不同時(shí)間絲瓜果肉總酚含量

對鮮切后放置不同時(shí)間的兩個(gè)絲瓜品種果肉總酚含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明（圖2）：鮮切放置初始時(shí)，兩個(gè)絲瓜品種的總酚含量均約為0.01 mg·g-1FW，‘35D-7’較低；室溫條件下放置12 h后，二者總酚含量均顯著上升，‘35D-7’果肉中的總酚含量相對較高，約為‘2D-2’的1.42倍；絲瓜‘35D-7’果肉中的總酚含量放置24 h時(shí)繼續(xù)升高，達(dá)0.0421 mg·g-1FW；相反地，‘2D-2’果肉中的總酚含量略微下降至初始水平。

標(biāo)尺為2 cm

不同小寫字母表示在P＜0.05水平上的顯著性差異。下同

2.3 鮮切后不同時(shí)間絲瓜果肉多酚氧化酶活性

在鮮切后放置不同時(shí)間條件下，絲瓜‘35D-7’果肉中的多酚氧化酶活性均顯著高于‘2D-2’，分別為‘2D-2’中多酚氧化酶活性的4.94、6.38和3.95倍。隨著放置時(shí)間的增加，絲瓜‘35D-7’果肉中多酚氧化酶的活性呈先升高后降低的趨勢，放置12 h時(shí)活性最高，達(dá)174.23 U·g-1·min-1；絲瓜‘2D-2’果肉中的多酚氧化酶活性逐漸上升，但變化幅度相對較小（圖3）。

2.4 絲瓜果肉褐變處理代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

為進(jìn)一步確定絲瓜褐變過程的代謝物變化，選取褐變程度較為明顯的易褐變品種‘35D-7’進(jìn)行代謝組學(xué)分析。由不同樣本提取物混合制備成質(zhì)控樣本，用于分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性，對不同質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測分析的重疊展示總離子流圖如圖4所示，可見代謝物檢測的總離子流曲線重疊性較高，保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明質(zhì)譜對樣品的分析信號(hào)穩(wěn)定性較好，可以保證數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性。

圖3 鮮切后不同放置時(shí)間絲瓜果肉多酚氧化酶活性

2.5 代謝物鑒定及聚類分析、差異代謝物的篩選

基于本地代謝組數(shù)據(jù)庫，從對照（CK）及褐變處理（BR）樣品中共鑒定獲得420種代謝物，主要注釋為脂質(zhì)、類黃酮、酚酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、生物堿、萜類、木脂素和香豆素類、單寧等10類物質(zhì)（圖5）。從整體上看，經(jīng)褐變處理后，絲瓜果肉中的代謝物含量主要以降低趨勢為主。

對各代謝物進(jìn)行定量分析，共有229種物質(zhì)被鑒定為差異代謝物，其中140種代謝物含量在褐變處理后顯著下降，89種升高。對所鑒定到的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）代謝通路富集分析，結(jié)果如圖6所示。共88種差異代謝物被注釋到42個(gè)代謝通路上（圖6-A），其中代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的合成和脯氨酸代謝包含最多的差異代謝物，分別占注釋的差異代謝物數(shù)目的51.14%、22.73%和10.23%；其次是苯丙素類生物合成、嘧啶代謝、類黃酮生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成。由圖6-B可得出絲瓜果肉褐變過程中關(guān)鍵代謝通路的變化程度。富集較為顯著的通路包括脯氨酸代謝、玉米素生物合成、苯丙素類生物合成、類黃酮生物合成以及不飽和脂肪酸合成。

圖4 樣本總離子流重疊展示圖

2.6 絲瓜果肉褐變過程差異代謝物分析

表1顯示了絲瓜果肉褐變過程部分差異代謝產(chǎn)物信息。在注釋為參與苯丙素生物合成途徑的代謝物中，大多數(shù)差異代謝物含量在褐變處理后顯著下降，松柏醛的倍數(shù)變化較為明顯，Log2變化倍數(shù)達(dá)-14.82。紫丁香苷的含量呈現(xiàn)了相反的趨勢，Log2變化倍數(shù)為17.56。沸水浴褐變還引起了大量脯氨酸代謝通路化合物含量的升高，包括腺苷-3′, 5′-環(huán)單磷酸水合物、2′-脫氧腺苷、腺苷等。類黃酮生物合成相關(guān)的芹菜素、木犀草素、短葉松素等化合物的含量也均呈現(xiàn)出

下降的趨勢。

2.7 絲瓜果肉褐變過程酚酸類代謝物分析

基于對絲瓜果肉代謝物的質(zhì)譜定性定量分析，共有59代謝物被鑒定為酚酸類物質(zhì)。根據(jù)對照絲瓜樣品中的代謝物含量，鑒定獲得了絲瓜果肉中的主要酚酸類化合物，含量排名前10位的酚酸類物質(zhì)及其相對含量如圖7所示。樣品絲瓜果肉中含量最高的酚酸類物質(zhì)為對香豆酸，其次是松柏苷、龍膽酸、咖啡酸以及阿魏酸，含量分別為對香豆酸含量的0.50、0.37、0.30和0.30倍。

圖5 絲瓜褐變處理代謝物含量變化聚類熱圖

在篩選獲得的差異代謝物中，共有35種代謝物被鑒定為酚酸類代謝物，為了進(jìn)一步鑒定不同種類酚類物質(zhì)在絲瓜果肉褐變過程中含量的變化規(guī)律，篩選了變化倍數(shù)差異最大的10種酚酸類差異代謝物，結(jié)果如圖8所示。含量下降最為明顯的酚酸類化合物分別為松柏醛、3-氨基水楊酸、咖啡酸苯乙酯、1-（4-甲氧苯基）-1-丙醇和3, 4-二甲氧基肉桂酸。相反地，經(jīng)沸水浴褐變處理后，絲瓜果肉中的紫丁香苷、2, 5-二羥基苯甲酸O-己糖苷、異綠原酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯和4-咖啡?？鼘幩峋写罅糠e累，前4種物質(zhì)的Log2變化倍數(shù)均達(dá)到了10以上。

3 討論

酶促褐變是影響果實(shí)風(fēng)味、降低其營養(yǎng)價(jià)值的重要破壞性反應(yīng)之一，通常認(rèn)為是造成蔬菜質(zhì)量損失的第二大原因[16]。代謝組學(xué)將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，可以精準(zhǔn)地對復(fù)雜的混合物進(jìn)行分離、定性和定量分析，獲得生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化[17]。在絲瓜運(yùn)輸和加工過程中，果實(shí)的褐變嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

前人研究表明，絲瓜的褐變主要與總酚類化合物、多酚氧化酶活性有關(guān)[18]。在本研究中，隨著褐變過程的發(fā)生，兩個(gè)品種絲瓜果肉中的總酚含量和多酚氧化酶活性均呈現(xiàn)升高的趨勢。在酶促反應(yīng)中，醌類物質(zhì)作為反應(yīng)底物可以在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為醌類。在此之后，醌類會(huì)與一些具有還原能力的酚類或非酚類物質(zhì)發(fā)生耦合氧化反應(yīng)，酚類物質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)成聚合物，發(fā)生累積并繼續(xù)參加酶促反應(yīng)[19]。放置12 h后，絲瓜果肉中多酚氧化酶活性上升，這可能與酚類化合物濃度的提高有關(guān)。隨著底物酚類物質(zhì)濃度的升高，酶活性也相應(yīng)提升。放置24 h后，耐褐變絲瓜品種‘2D-2’中的總酚含量略有下降。類似地，絲瓜‘35D-7’果肉的多酚氧化酶含量也在放置24 h時(shí)有所降低，這一現(xiàn)象可能是由于多酚的代謝達(dá)到峰值后啟動(dòng)了反饋抑制機(jī)制，酶促反應(yīng)的底物被不斷消耗，逐步造成酶促反應(yīng)效率下降，其他在絲瓜類似的研究中也有此現(xiàn)象發(fā)生[20]。與耐褐變品種相比，絲瓜‘35D-7’的多酚氧化酶活性在放置不同時(shí)間均較高，這與筆者之前對多酚氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄組分析及熒光定量結(jié)果均表明易褐變絲瓜品種的多酚氧化酶活性較高，導(dǎo)致了絲瓜褐化速率的提高[9]。

圖6 絲瓜褐變處理差異代謝物通路富集

表1 絲瓜褐變處理部分差異代謝產(chǎn)物

圖7 絲瓜果肉酚酸類代謝物相對含量（前10位）

酚類物質(zhì)是酶促褐變的底物，但不同物種褐變的主要酚類物質(zhì)的組成和含量不同。本研究中，共有59種代謝物被鑒定為酚酸類物質(zhì)，其中對香豆酸、松柏苷和龍膽酸的含量相對較高。不同品種絲瓜中酚類物質(zhì)的種類和含量存在一定差異，推測這幾種酚類物質(zhì)在絲瓜‘35D-7’果肉褐變過程中可能起主要作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)沸水浴褐變后，含量下降倍數(shù)最明顯的酚酸類代謝物為松柏醛、3-氨基水楊酸和咖啡酸苯乙酯，表明這幾種代謝物可能在酶促褐變反應(yīng)中被消耗。松柏醛是木質(zhì)素合成的前體，是過氧化物酶（peroxidase，POD）的重要底物。在豆薯中的研究表明，豆薯切片的褐變與木質(zhì)化過程有關(guān)[21]。在植物體內(nèi)存在H2O2時(shí)，POD也可以催化酚類物質(zhì)氧化導(dǎo)致褐變[22]。褐變后絲瓜果肉中含量上升倍數(shù)最高的酚酸類代謝物為紫丁香苷、2, 5-二羥基苯甲酸O-己糖苷和異綠原酸A。紫丁香苷通常存在于被子植物的形成層組織中，被認(rèn)為是木質(zhì)素合成的前體[23]。FRANZISKA等[24]結(jié)合核磁共振、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)首次從萵苣中鑒定到紫丁香苷的存在，并探究了其與褐變過程的關(guān)系。2, 5-二羥基苯甲酸O-己糖苷是龍膽酸的衍生物，龍膽酸是絲瓜中主要的酚酸物質(zhì)[14]。異綠原酸A是一種綠原酸的異構(gòu)體。在芋艿、馬鈴薯、梨等植物中的研究均表明，多酚氧化酶對綠原酸的親和力較強(qiáng)，在褐變過程中綠原酸含量顯著上升[25-27]。本研究結(jié)果表明絲瓜果肉褐變后總酚類物質(zhì)含量的提高可能主要與這些物質(zhì)的含量變化有關(guān)。

圖8 絲瓜褐變處理差異倍數(shù)前10的酚酸類差異代謝物

在所鑒定到的差異代謝物中，除了參與苯丙素代謝途徑的酚酸類物質(zhì)外，脯氨酸代謝及類黃酮生物合成途徑的多種代謝物含量也表現(xiàn)出了明顯的差異。脯氨酸是植物遭受脅迫時(shí)調(diào)節(jié)滲透平衡，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，清除活性氧的重要有機(jī)分子[28-29]。本研究采用沸水浴對絲瓜果肉進(jìn)行褐變處理，對絲瓜造成了高溫脅迫，因此導(dǎo)致了大量脯氨酸代謝途徑中化合物含量的增加。類黃酮也是一類與果實(shí)褐變相關(guān)的酚類物質(zhì)[30]，與李（）、大蕉（）等植物褐變相關(guān)的表兒茶素、沒食子酸等均屬于黃酮類代謝物[31-32]。本研究中，褐變處理后的芹菜素、木犀草素等類黃酮代謝物含量顯著下降，表明類黃酮類物質(zhì)也作為底物參與了絲瓜果肉的酶促褐變反應(yīng)。

4 結(jié)論

絲瓜中含有對香豆酸、松柏苷、龍膽酸等酚酸類物質(zhì)，這些酚酸類物質(zhì)含量的變化與絲瓜的褐變相關(guān)。本研究鑒定獲得絲瓜果肉中的主要酚類物質(zhì)種類及其褐變前后的含量變化，發(fā)現(xiàn)松柏醛、紫丁香苷等代謝物可能為導(dǎo)致絲瓜褐變的主要酚酸類代謝物。研究結(jié)果為揭示絲瓜褐變生理機(jī)制及培育優(yōu)良抗褐變絲瓜品種的選育提供了理論依據(jù)。

[1] 朱海生, 康娟, 劉建汀, 陳敏氡, 李永平, 王彬, 林碧英, 溫慶放. 絲瓜多酚氧化酶基因家族的克隆與表達(dá)分析. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2018(8): 1502-1512.

ZHU H S, KANG J, LIU J T, CHEN M D, LI Y P, WANG B, LIN B Y, WEN Q F. Cloning and expression analysis of polyphenol oxidasegene family fromcylindrical. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2018(8): 1502-1512. (in Chinese)

[2] 李京贊, 劉玉德, 石文天, 陶春生. 植物果蔬的褐變及抑制的研究. 包裝與食品機(jī)械, 2019, 37(1): 63-68.

LI J Z, LIU Y D, SHI W T, TAO C S. Advances in research on browning and inhibition of plant fruits and vegetables. Packaging and Food Machinery, 2019, 37(1): 63-68. (in Chinese)

[3] 花秀鳳, 陳銑, 黃斌斌. 普通絲瓜果肉褐變的變異及低褐變品種的篩選. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29(19): 103-106.

HUA X F, CHEN X, HUANG B B.roem flesh browning variation and low browning varieties selection. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(19): 103-106. (in Chinese)

[4] 王輝, 王成, 婁麗娜, 蘇小俊. 絲瓜果肉耐褐變種質(zhì)資源的篩選及初步應(yīng)用. 長江蔬菜, 2013(14): 20-21, 22.

WANG H, WANG C, LOU L N, SU X J. Selection and preliminary application of anti-browninggermplasm resources. Journal of Changjiang Vegetables, 2013(14): 20-21, 22. (in Chinese)

[5] 黃樹蘋, 張敏, 談杰, 王春麗, 陳霞, 張洪源, 談太明. 普通絲瓜果肉褐變程度的主基因+多基因遺傳模型分析. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2018, 34(19): 50-56.

HUANG S P, ZHANG M, TAN J, WANG C L, CHEN X, ZHANG H Y, TAN T M. Genetic model analysis of major gene + polygene of flesh browning in. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2018, 34(19): 50-56. (in Chinese)

[6] 康玉妹, 薛珠政, 劉建汀. 18個(gè)絲瓜新組合主要農(nóng)藝性狀聚類分析及褐變度鑒定. 福建農(nóng)業(yè)科技, 2020(5): 20-26.

KANG Y M, XUE Z Z, LIU J T. Clustering analysis on the agronomic characters of 18 new combinations ofand the identification of browning degree. Fujian Agricultural Science and Technology, 2020(5): 20-26. (in Chinese)

[7] 周向軍, 高義霞, 袁毅君, 張志昌, 張繼. 絲瓜過氧化物酶的特性和抑制作用研究. 中國釀造, 2011, 30(10): 81-85.

ZHOU X J, GAO Y X, YUAN Y J, ZHANG Z C, ZHANG J. Study on characteristics and inhibition effects ofperoxidase from(Linn.)Roem. China Brewing, 2011, 30(10): 81-85. (in Chinese)

[8] ZHU H S, LIU J T, WEN Q F, CHEN M D, WANG B, ZHANG Q R, XUE Z Z. De novo sequencing and analysis of the transcriptome during the browning of fresh-cut‘-3’ fruits. PLoS ONE, 2017, 12(11): e0187117.

[9] WANG Y H, LIU X H, ZHANG R R, YAN Z M, XIONG A S, SU X J. Sequencing, assembly, annotation, and gene expression: novel insights into browning-resistant. PeerJ, 2020, 8: e9661.

[10] 朱海生, 溫文旭, 劉建汀, 葉新如, 陳敏氡, 王彬, 張前榮, 李永平, 溫慶放. 絲瓜苯丙氨酸解氨酶基因克隆及表達(dá)分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2018, 19(2): 305-313.

ZHU H S, WEN W X, LIU J T, YE X R, CHEN M D, WANG B, ZHANG Q R, LI Y P, WEN Q F. Cloning and expression analysis of phenylalanine ammonia-lyasegene fromcylindrical. Journal of Plant Genetic Resources, 2018, 19(2): 305-313. (in Chinese)

[11] 朱海生, 劉建汀, 王彬, 陳敏氡, 張前榮, 葉新如, 林琿, 李永平, 溫慶放. 絲瓜過氧化物酶基因的克隆及其在果實(shí)褐變中的表達(dá)分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2018, 26(1): 43-52.

ZHU H S, LIU J T, WANG B, CHEN M D, ZHANG Q R, YE X R, LIN H, LI Y P, WEN Q F. Cloning of peroxidase gene from(cylindrical) and its expression analysis in fruit browning. Journal of Agricultural Biotechnology, 2018, 26(1): 43-52. (in Chinese)

[12] LEE J, MATTHEIS J P, RUDELL D R. Antioxidant treatment alters metabolism associated with internal browning in ‘Braeburn’ apples during controlled atmosphere storage. Postharvest Biology and Technology, 2012, 68: 32-42.

[13] TAO N, WANG R H, XU X, DONG T T, ZHANG S, LIANG M, WANG Q G. Xanthosine is a novel anti-browning compound in potato identified by widely targeted metabolomic analysis andtest. Postharvest Biology and Technology, 2021, 171: 111367.

[14] 溫文旭, 朱海生, 溫慶放, 陳敏氡, 林碧英, 薛珠政. 超高效液相色譜法分析絲瓜酚類物質(zhì)組分及其含量. 園藝學(xué)報(bào), 2016, 43(7): 1391-1401.

WEN W X, ZHU H S, WEN Q F, CHEN M D, LIN B Y, XUE Z Z. Determination of polyphenols inby ultra performance liquid chromatography. Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(7): 1391-1401. (in Chinese)

[15] 朱海生, 莊尹宏, 劉建汀, 王彬, 陳敏氡, 張前榮, 溫慶放, 李大忠, 薛珠政. 絲瓜總酚提取和測定方法的優(yōu)化. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 31(11): 1204-1209.

ZHU H S, ZHUANG Y H, LIU J T, WANG B, CHEN M D, ZHANG Q R, WEN Q F, LI D Z, XUE Z Z. Extraction and determination of total phenol in Luffa (Roem.), Fujian Journal of Agricultural Science, 2016, 31(11): 1204-1209. (in Chinese)

[16] LIM W Y, CHEUN C F, WONG C W. Inhibition of enzymatic browning in sweet potato ((L.)) with chemical and natural anti-browning agents. Journal of Food Processing and Preservation, 2019, 43: e14195.

[17] 李思源, 李培瑜, 劉奕彤, 劉海杰, 張澤俊, 沙坤. 代謝組學(xué)在食品科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展.食品與發(fā)酵工業(yè), 2021, 47(5): 252-258.

LI S Y, LI P Y, LIU Y T, LIU H J, ZHANG Z J, SHA K. Application progress of metabolomics in food science. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(5): 252-258. (in Chinese)

[18] 婁麗娜, 劉哲, 蘇小俊. 普通絲瓜耐褐變研究進(jìn)展. 長江蔬菜, 2015(4): 1-4.

LOU L N, LIU Z, SU X J. Research progress of flesh browning resistance in(L.). Journal of Changjiang Vegetables, 2015(4): 1-4. (in Chinese)

[19] 郝英超, 羅磊, 劉云宏, 周燕燕. 酶促褐變中酚類化合物代謝機(jī)理研究進(jìn)展. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊, 2013(5): 55-58, 66.

HAO Y C, LUO L, LIU Y H, ZHOU Y Y. Metabolic mechanism of phenolic compounds in enzymatic browning. Aem Roducts Rocessing, 2013(5): 55-58, 66. (in Chinese)

[20] 溫文旭. 絲瓜褐變過程酚類物質(zhì)的分析與研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2017.

WEN W X. Study and analysis of polyphenols in luffa browning [D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2017. (in Chinese)

[21] ELIA N A, EDMUNDO M. Effects of polyphenol oxidase and peroxidase activity, phenolics and lignin content on the browning of cut jicama. Postharvest Biology and Technology, 2004, 33(3): 275-283.

[22] 康娟, 莊尹宏, 林碧英, 溫慶放, 溫文旭, 朱海生. 絲瓜多酚氧化酶及過氧化物酶酶學(xué)特性的研究. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 32(8): 854-858.

KANG J, ZHUANG Y H, LIN B Y, WEN Q F, WEN W X, ZHU H S. Polyphenol oxidase and peroxidase in. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2017, 32(8): 854-858. (in Chinese)

[23] 王叢巧. 溫差對鐵皮石斛松柏苷、紫丁香苷影響及相關(guān)基因表達(dá)分析[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2019.

WANG C Q. Temperature difference on syringin and coniferin contain inand related gene expression [D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2019. (in Chinese)

[24] MAI F, GLOMB M A. Isolation of phenolic compounds from iceberg lettuce and impact on enzymatic browning. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(11): 2868-2874.

[25] 王佳宏, 郁志芳, 杜傳來. 芋艿褐變底物及多酚氧化酶特性研究. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(2): 141-145.

WANG J H, YU Z F, DU C L. Browning substrates and characterization of polyphenol oxidase from taro. Science and Technology of Food Industry, 2008, 29(2): 141-145. (in Chinese)

[26] 袁江, 張紹鈴, 曹玉芬, 吳俊, 田路明, 陶書田, 董星光. 梨果實(shí)酚類物質(zhì)與酶促褐變底物的研究. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(1): 7-14.

YUAN J, ZHANG S L, CAO Y F, WU J, TIAN L M, TAO S T, DONG X G. Polyphenolic compound and substances determination of enzymatic browning in pear. Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(1): 7-14. (in Chinese)

[27] 程麗林, 張長峰, 王慶國. 高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸和原兒茶酸. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(13): 299-303.

CHENG L L, ZHANG C F, WANG Q G. Determination of chlorogenic acid and protocatechuic acid in potatoes by HPLC. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(13): 299-303. (in Chinese)

[28] 全先慶, 張渝潔, 單雷, 畢玉平. 高等植物脯氨酸代謝研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2007(1): 14-18.

QUAN X Q, ZHANG Y J, SHAN L, BI Y P. Advances in proline metabolism researches of higher plants. Biotechnology Bulletin, 2007(1): 14-18. (in Chinese)

[29] 王麗媛, 丁國華, 黎莉. 脯氨酸代謝的研究進(jìn)展. 哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(2): 84-89.

WANG L Y, DING G H, LI L. Progress in synthesis and metabolism of proline. Natural Science Journal of Harbin Normal University, 2010, 26(2): 84-89. (in Chinese)

[30] 鄭潔, 趙其陽, 張耀海, 焦必寧. 超高效液相色譜法同時(shí)測定柑橘中主要酚酸和類黃酮物質(zhì). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(23): 4676-4687.

ZHENG J E, ZHAO Q Y, ZHANG Y H, JIAO B N. Simultaneous determination of main flavonoids and phenolic acids inby ultra performance liquid chromatography. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(23): 4676-4687. (in Chinese)

[31] 白永亮, 余銘, 袁根良, 杜冰, 魯旺旺, 黃守耀, 楊公明. 大蕉后熟期的褐變相關(guān)性及褐變底物鑒定. 食品科學(xué), 2012, 33(4): 271-275.

BAI Y L, YU M, YUAN G L, DU B, LU W W, HUANG S Y, YANG G M. Correlations between browning degree and PPO or POD activity of Dajiao banana (ABB cv. Dajiao) and preliminary identification of browning substrates during postharvest ripening. Food Science, 2012, 33(4): 271-275. (in Chinese)

[32] 孫海龍, 張靜茹, 陸致成, 魯曉峰, 吳強(qiáng), 于潞. 李果實(shí)酚類物質(zhì)及其生物活性研究進(jìn)展. 果樹學(xué)報(bào), 2018, 35(2): 1541-1550.

SUN H L, ZHANG J R, LU Z C, LU X F, WU Q, YU L. Advances in the research of phenolic compounds and their bioactivities in plum fruits. Journal of Fruit Science, 2018, 35(2): 1541-1550. (in Chinese)

Analysis of Changes in Phenolic Acids ofPulp During Browning Based on Metabolomics

WANG YaHui1, 2, LIU XiaoHong1, YONG MingLi1, XIONG AiSheng2, SU XiaoJun1

1Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014;2College of Horticulture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Nanjing 210095

【Objective】Browning is the main element affecting the commercial value of. The principal consideration of browning is linked to the metabolism of phenolic acids. Studying the changes of phenolic acid during the browning process ofis helpful to understand the physiological mechanism of browning, so as to provide the basis for the storage and processing, breed selection and utilization of germplasm resources of. 【Method】Browning-resistantcultivar 2D-2 and browning-prone cultivar 35D-7 were used as experiment materials. Their browning degree, total phenol content and polyphenol oxidase activity after fresh cutting for different time were measured. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) was utilized to analyze the metabolomic ofpulp before and after browning in boiling water bath. 【Result】After fresh-cut browning treatment, the content of polyphenols and the polyphenol oxidase activity in the flesh of both twocultivars were increased.35D-7 had severer browning degree. The total phenol content after 24 h storage was much more than 3 times of that of 2D-2, and the polyphenol oxidase activity achieved the top at 12 h, reaching 174.23 U·g-1·min-1.Based on metabolomics, the substrate of enzymatic browning reaction and the difference of metabolites in browning-prone35D-7 before and after browning were analyzed. A total of 420 metabolites were detected, 229 of which were differential metabolites. After browning, the contents of 140 kinds of differential metabolites were substantially decreased, while 89 kinds were increased. KEGG pathway enrichment analysis demonstrated that metabolites related to phenylpropanoid biosynthesis, proline metabolism and flavonoid biosynthesis displayed significant changes. The results of qualitative and quantitative analysis of metabolomics suggested the content of-coumaric acid was the highest in the phenolic acids identified in the flesh of the testedfollowed by coniferin and gentisic acid. After browning treatment, 35 different metabolites were classified as phenolic acid metabolites. Among them, the content of coniferaldehyde, 3-aminosalicylic acid and phenethyl caffeate decreased most obviously, while the content of syringin, 2 ,5-dihydroxy benzoic acid O-hexside and isochlorogenic acid A increased significantly, and the log2 fold change was more than 10. 【Conclusion】The main phenolic substances in the flesh of 35D-7 were-coumaric, and the main phenolic acid metabolites involved in the browning process of 35D-7 were coniferaldehyde, syringin and isochlorogenic acid A etc. The results could help further reveal the physiological mechanism ofbrowning and provide basis for the improvement ofvariety.

; pulp; enzymatic browning; metabolomics; phenolic acids

2021-01-28；

2021-03-24

蘇州市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（農(nóng)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用研究）（SNG2018061）、江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科（PAPD）

王雅慧，E-mail：2019204036@njau.edu.cn。通信作者蘇小俊，E-mail：xiaojunsu@jaas.ac.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）