張曉瑩，朱英霞 綜述 孫慎俠 審校

大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622

深部真菌感染是指致病真菌侵入機體內(nèi)臟、皮下組織、皮膚角質(zhì)層以下和黏膜所致的感染，嚴(yán)重時甚至可導(dǎo)致全身性感染[1]。據(jù)統(tǒng)計，人類的主要深部真菌病原體(白色念珠菌、煙曲霉和新型隱球菌)每年導(dǎo)致超過200萬人感染，150萬人死亡[2]。且深部真菌感染的發(fā)生率及死亡率仍呈逐年上升的趨勢[3]。

對于許多淺表真菌病，在過去的一個世紀(jì)里已經(jīng)研發(fā)了一系列的局部藥物，在控制常見感染方面取得了一定的成功。相比之下，對于需要全身抗真菌治療的深部真菌病，可用的抗真菌藥物種類很少，目前主要有多烯類、嘧啶類似物、唑類和棘白菌素等。但這些藥物存在著靶點少、抗菌譜窄、耐藥性嚴(yán)重、副作用比較大等[4]問題。除此之外，抗真菌藥物研發(fā)的進(jìn)程比較緩慢。例如，從2000年到2015年，有18種首創(chuàng)藥物被批準(zhǔn)用于實體腫瘤癌癥[5]。然而只有一種新的抗真菌藥物—棘白菌素被引入。盡管一些廣泛使用的高通量篩選平臺可能會加強藥物篩選進(jìn)程，但它們的成本較高且無法準(zhǔn)確模擬細(xì)胞藥物間的相互作用，很難準(zhǔn)確預(yù)測候選藥物對人體的療效和毒性。因此，構(gòu)建一種既能模擬體內(nèi)環(huán)境并且重復(fù)性高的體外藥物高通量篩選模型具有十分重要的意義。

微流控芯片技術(shù)作為21世紀(jì)最先進(jìn)的分析技術(shù)之一，已經(jīng)成為目前藥物篩選的有力工具。該技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離、檢測等操作均集成在微米級的芯片上，可以到代替?zhèn)鹘y(tǒng)生物化學(xué)實驗室的許多功能[6]。近年來，該技術(shù)不斷趨于微型化、自動化和集成化，并不斷提高分辨率和靈敏度[7]。因此，該技術(shù)的通用性完全符合藥物合成、篩選和測試的要求[8]。本文就近年來微流控芯片技術(shù)的發(fā)展及其在抗深部真菌感染藥物篩選中的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景做一綜述。

1 微流控芯片技術(shù)簡介

微流控芯片分析技術(shù)最早由TERRY等[9]于1979年提出，他利用光刻技術(shù)和化學(xué)蝕刻技術(shù)在硅片上制造了微型氣體分析系統(tǒng)。1990年，MANZ等[10]將高效液相色譜技術(shù)集成在一張微小芯片上，將實驗室常規(guī)分析方法集成到一個微型化操作系統(tǒng)中，使得多單元技術(shù)可以在微平臺上靈活組合、大規(guī)模集成。與此同時，它可以創(chuàng)造可控的微環(huán)境，準(zhǔn)確驅(qū)動和控制微流體在微通道中的流動，增加檢測靈敏度，提高檢測效率[7]。此外，微流控技術(shù)提供了在動態(tài)和明確的環(huán)境中研究單個微生物的方法，并在微生物的檢測與抗感染方面得到應(yīng)用[11]。因此，利用微流控芯片技術(shù)可以實現(xiàn)對真菌的深入研究，以達(dá)到更高的效率和精度。

2 傳統(tǒng)抗深部真菌感染藥物篩選方法

目前，常見的抗深部真菌藥物篩選方法主要有體外和體內(nèi)兩種篩選方法。體外篩選實驗以藥敏試驗最常用。體內(nèi)篩選實驗主要采用動物實驗法—以動物為模型，預(yù)測候選藥物對人體的細(xì)胞毒性、藥代動力學(xué)及抗菌效果。

2.1 體外藥敏試驗篩選方法 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)藥敏試驗(AST)標(biāo)準(zhǔn)，AST可分為瓊脂擴散法和稀釋法[12]。通過這兩種方法可以測定抗菌素的抑菌圈大小和最小抑菌濃度(MIC)，根據(jù)藥敏分界點判定標(biāo)準(zhǔn)[13]判斷菌株對抗菌素的敏感性。瓊脂擴散法是一種半定量檢測方法，通過抑菌圈的直徑來判定藥物敏感性。與其他方法相比，瓊脂擴散法操作簡單，成本低廉，無需特殊設(shè)備。但此試驗僅限于半定量，時間長，不能及時報出藥敏結(jié)果[13]；藥物濃度、培養(yǎng)基類型、溫度、pH值等都對抑菌圈有一定的影響[14]。稀釋法是一種定量的檢測方法,分為瓊脂稀釋法和宏量、微量肉湯稀釋法。其中微量肉湯稀釋法被稱為藥敏試驗的金標(biāo)準(zhǔn)[14]，其操作步驟已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，能夠經(jīng)濟、有效、準(zhǔn)確地定量測定出待檢菌株的MIC。但該方法篩選速度極慢，手工步驟多、試劑消耗大，篩選效率達(dá)不到高通量篩選的要求。除了上述兩種傳統(tǒng)方法外，流式細(xì)胞術(shù)在抗真菌藥物的高通量篩選中發(fā)揮著重要作用[15]，流式細(xì)胞術(shù)是一種對溶液中單個細(xì)胞進(jìn)行快速多參數(shù)分析的技術(shù)。其作用原理是使用細(xì)胞活性標(biāo)記物或熒光染料處理藥物作用后的真菌細(xì)胞，如碘化丙錠(PI)，若細(xì)胞受損而死亡，PI可以進(jìn)入細(xì)胞膜破壞的細(xì)胞，與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀可以檢測熒光信號從而判斷細(xì)胞密度和損傷情況。流式細(xì)胞術(shù)操作簡便、分析迅速，可用于高通量藥物篩選，然而由于侵襲性霉菌菌絲在流式細(xì)胞儀中不易流動，故很難用于侵襲性霉菌藥物篩選，常用于酵母型真菌尤其是念珠菌的藥物篩選。以上幾種體外藥敏試驗很難滿足對于嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的藥物篩選，主要原因是這類藥物篩選需要考慮突破血腦屏障，有時通過體外藥物篩選是有效的，但一旦進(jìn)入臨床體內(nèi)藥效試驗就會出現(xiàn)療效甚微或無效。

2.2 體內(nèi)動物試驗篩選方法 動物試驗作為抗深部真菌感染藥物發(fā)現(xiàn)的臨床前試驗，在預(yù)測藥代動力學(xué)方面起著非常重要的作用。然而，嚙齒動物、狗、猴等與人類存在底物特異性、組織分布和轉(zhuǎn)運蛋白的相對豐富度等方面的差異，這往往導(dǎo)致藥物-藥物相互作用(DDIs)的風(fēng)險評估不準(zhǔn)確或藥代動力學(xué)預(yù)測錯誤，因此一些候選化合物在臨床試驗之前就被放棄，大大影響了新藥研發(fā)的效率及成本[16]。此外，整體的動物病理模型通常需要手工構(gòu)建，對技術(shù)的要求較高，這使得動物試驗周期較長，只適合低通量藥物篩選。微流控芯片在藥物研發(fā)中可以模擬人體體內(nèi)組織、器官的生理功能，可以很好地避免動物試驗帶來的諸多問題，具有極好的重復(fù)性、較高的效率[17-18]。

3 微流控芯片在抗深部真菌感染藥物篩選中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的抗深部真菌藥物篩選方法存在成本高、效率低下等問題。盡管一些廣泛使用的高通量篩選平臺可能會加強藥物篩選進(jìn)程，但它們的成本較高且無法準(zhǔn)確模擬細(xì)胞-藥物間的相互作用，因此很難準(zhǔn)確預(yù)測候選藥物對人體的療效和毒性。近年來，微流控技術(shù)的引入大大提高了臨床醫(yī)學(xué)的藥敏試驗和耐藥檢測效率。微流控芯片的抗深部真菌藥物篩選系統(tǒng)主要用于篩選治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的藥物。尤其是新型隱球菌感染引起的腦膜炎。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特殊的血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)會阻礙大部分藥物由血液滲透進(jìn)入腦部。且復(fù)雜的大腦組織結(jié)構(gòu)易結(jié)合藥物，使得許多藥物難以到達(dá)靶向腦組織，極大地削弱了抗真菌藥物的抗菌效果[19]。因此，在抗深部真菌藥物研發(fā)的早期階段就對藥效指標(biāo)進(jìn)行評估至關(guān)重要，特別是評價其血腦屏障滲透率和對靶向腦細(xì)胞的藥效。

近些年來，一些血腦屏障微流控芯片藥物篩選模型逐漸被研發(fā)出來，此類模型能夠逼真地模擬人體的血液流動、血管結(jié)構(gòu)和共培養(yǎng)等生理微環(huán)境[20-21]。實現(xiàn)檢測治療CNS疾病的藥物對血腦屏障的滲透率以及分析藥物對靶向腦細(xì)胞的毒性。例如，KIM等[22]設(shè)計了一種BBB芯片用來測定某些藥物的血腦屏障滲透率，其結(jié)果與體內(nèi)藥物動力學(xué)結(jié)果呈現(xiàn)出相關(guān)性。YEON等[23]為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在芯片上形成緊密的內(nèi)皮單層，應(yīng)用具有多孔結(jié)構(gòu)的柵欄結(jié)構(gòu)捕捉內(nèi)皮細(xì)胞，并以星形膠質(zhì)細(xì)胞處理過的培養(yǎng)基孵育，藥物滲透性試驗表明，該模型測得的滲透性系數(shù)與體內(nèi)模型測得的腦攝取指數(shù)有一定的相關(guān)性。邵曉劍[24]構(gòu)建的BBB微流控芯片藥物篩選模型主要由BBB模型、三維細(xì)胞培養(yǎng)室、微固相萃取柱芯片組成，結(jié)果表明模型藥物的BBB滲透率以及藥物在腦部組織中的擴散和作用效果與體內(nèi)數(shù)據(jù)相似，且整個試驗過程只需30 min，樣品量為5μL。這對研究藥物的滲透率和藥物對靶向腦細(xì)胞的毒性分析具有重要意義。

與傳統(tǒng)藥物篩選方法相比，微流控芯片中進(jìn)行的藥物處理更敏感，因為芯片內(nèi)經(jīng)常補充新鮮介質(zhì)和藥物溶液，此外，同一芯片可設(shè)計不同孔道，實現(xiàn)不同濃度藥物的同時給藥。例如，QIANG等[25]設(shè)計微流控芯片包含成千上萬的平行式微通道，微通道寬度從3μL到5μL不等。他們對50 520種新藥進(jìn)行了篩選，最終發(fā)現(xiàn)10種小分子化合物可以使兩性霉素B對持久性白色念珠菌的抗感染作用增強30%以上[26-27]。這一發(fā)現(xiàn)可能為臨床治療難治性復(fù)發(fā)的白色念珠菌感染開辟了一條新的途徑。BALTEKIN等[28]使用狹窄的微流控阱研究AST，能夠在30 min內(nèi)提供結(jié)果，該方法可以達(dá)到與標(biāo)準(zhǔn)方法相同的效果，但比傳統(tǒng)方法快很多。因此，將微流控技術(shù)引入到臨床醫(yī)學(xué)的藥敏試驗和耐藥檢測中，可以大大提高檢測效率。

此外，在微流控芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展出了一種新型的液滴微流控藥物篩選平臺，該技術(shù)采用非連續(xù)流動技術(shù)，使不相溶的水油兩相相互作用，快速生成高度單分散的液滴。每個液滴都可以作為液滴微反應(yīng)器[29]，可同時開展成千上萬的反應(yīng)。液滴大小與細(xì)胞大小相似，提供了更生理的、高生物相容性的微環(huán)境[30]。與連續(xù)流微流控芯片相比，液滴微流控芯片可增加通量，易混合，不易交叉污染。與傳統(tǒng)孔板法相比，液滴微流控芯片以液滴包裹真菌作為微反應(yīng)器，不僅可獲得較高的菌落濃度，還大大縮短了真菌的培養(yǎng)時間[31]。

用液滴微流控芯片篩選抗真菌藥物的基本過程為：將菌液、藥物、熒光指示劑(在活細(xì)胞中能顯示熒光信號)等一起包裹在液滴中，不同液滴所含藥物濃度不同。通過檢測不同液滴內(nèi)的熒光信號，從而獲得該藥的抗真菌活性[31]。鄭振[29]設(shè)計了一種液滴微流控芯片用于篩選抗白色念珠菌藥物。他們選取4種抗真菌藥物作為模型藥物，以在活細(xì)胞中具有特殊熒光特性的阿爾瑪藍(lán)作為指示劑，采用96孔微孔板法驗證液滴微流控芯片的可行性。結(jié)果表明,液滴微流控芯片平臺可在2 h內(nèi)準(zhǔn)確、高效地完成抗真菌敏感性測試。在液滴微流控芯片的基礎(chǔ)上，蔡穎[32]構(gòu)建的濃度梯度液滴微流控芯片，該方法采用液滴微流控技術(shù)結(jié)合濃度梯度生成包裹白色念珠菌的芯片，分別測試了8種臨床常用抗白色念珠菌藥物的MIC范圍。與普通液滴微流控芯片相比，濃度梯度液滴微流控芯片的優(yōu)勢在于，一次實驗可以考察多種實驗條件，進(jìn)一步提高了藥物的通量。

4 展望

本文綜述了近年來用于抗深部真菌感染藥物篩選的微流控芯片研究進(jìn)展。微流控芯片技術(shù)可以實現(xiàn)細(xì)胞和真菌共培養(yǎng)，構(gòu)建高通量、低成本的基于細(xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng)，能夠很好地解決傳統(tǒng)藥物篩選方法帶來的諸多問題。液滴微流控芯片技術(shù)進(jìn)一步發(fā)揮了傳統(tǒng)微流控芯片的優(yōu)勢，這為抗深部真菌藥物篩選提供了新的試驗平臺。然而目前開展的基于液滴微流控芯片的藥物篩選試驗尚處于初級階段，且該技術(shù)在液滴分選、后續(xù)檢測等方面還存在著一定的局限性。但隨著液滴生成和操控技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來的液滴微流控技術(shù)必將成為篩選抗深部真菌藥物的有力工具，從而加快藥物研發(fā)進(jìn)程。