張慶, 趙曉美, 王娉, 劉冰, 陳穎*

(1.天津科技大學食品科學與工程學院, 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室, 省部共建食品營養(yǎng)與安全重點實驗室, 天津 300457; 2.中國檢驗檢疫科學研究院農產品安全研究中心, 北京 100176)

產毒真菌主要是指曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鐮刀菌屬(Fusariumspp.)中能夠產生復雜有毒次級代謝產物的真菌，如黃曲霉(Aspergillusflavus)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、展青霉(Penicillumexpansum)、鐮刀菌屬(Fusariumspp.)等。它們能夠產生多種真菌毒素，如黃曲霉毒素(aflatoxin)B族和G族化合物具有強致癌、致畸作用，已被國際癌癥研究機構(International Agency for Reasearch on Cancer，IARC)列入Group1分組(對人類是致癌物)；赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)會侵害肝腎等器官；展青霉素(patulin)則會引起組織和器官病變、侵害神經系統(tǒng)；玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)主要對生殖系統(tǒng)產生危害，導致不孕、流產等病癥；T-2毒素是一種A型單端孢霉烯族化合物，具有免疫毒性，會抑制蛋白質合成。產毒真菌污染食品普遍發(fā)生在食品的加工、運輸、貯藏環(huán)節(jié)，其代謝產生的毒素會隨著食物進入人體，對健康造成很大威脅。目前國內外對于防控真菌污染食品的研究多是針對真菌毒素檢測，采用的技術主要有色譜技術、色譜質譜聯(lián)用技術、免疫分析技術和生物傳感器技術等[1]，雖然可以有效實現(xiàn)對食品中真菌毒素的定性或定量分析，但是這種針對已被污染食品中的毒素含量檢測難以挽回已造成的經濟損失。

相較于真菌毒素的檢測，直接對產毒真菌檢測能夠前置化干預其對食品的污染及對人類的危害，能夠在產毒真菌污染食品早期未產生毒素前發(fā)現(xiàn)問題，以便于及時采取措施。食品中產毒真菌鑒定方法有形態(tài)學觀察和生化鑒定[2]等，存在需要對真菌培養(yǎng)、實驗周期較長、操作步驟繁瑣、主觀依賴性強、靈敏度低等缺陷。也有學者使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)對絲狀真菌進行鑒定[3-4]，但是此技術依賴于完備的數(shù)據(jù)庫，而種類復雜且多樣化的真菌給數(shù)據(jù)庫建立帶來了非常大的挑戰(zhàn)。因此，亟需一種快速、高通量的產毒真菌檢測方法來保障食品真菌污染方面的質量與安全。

基于核酸的檢測方法可以有效解決上述問題，不僅實現(xiàn)直接對產毒真菌的檢測，也一定程度上解決了真菌鑒定需要培養(yǎng)的問題，彌補了傳統(tǒng)技術在真菌檢測中存在的缺陷，尤其是以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術為基礎發(fā)展而來的各種檢測方法。本文綜述了近年來基于核酸檢測方法在食品產毒真菌中的檢測鑒定及應用，探討了其優(yōu)缺點，并展望了產毒真菌檢測方法的未來發(fā)展趨勢。

1 基于PCR技術的產毒真菌檢測方法

1.1 常規(guī)PCR方法

PCR技術是1985年Mullis等[5]最先提出的一項DNA體外擴增專利技術，在產毒真菌檢測方面的應用原理是根據(jù)已經公布的能實現(xiàn)分類鑒定的DNA序列設計引物，使用常規(guī)PCR技術擴增出目的基因后進行瓊脂糖凝膠電泳，通過比對分析擴增的DNA片段實現(xiàn)真菌的檢測鑒別，通常針對具有產毒能力真菌的檢測會結合其已經公布的毒力基因。張健等[6]使用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4對72株曲霉屬真菌進行分類鑒定，結合OTA合成相關的聚酮合酶(PKS)的AT域序列設計特異性引物，使用單重PCR技術完成對產OTA黑曲霉(Aspergillusniger)的檢測，在基因組DNA濃度為12.5 pg·μL-1時可檢測到，雖然該方法產生了4%的假陽性結果，但是仍然可以作為產毒性黑曲霉的有效檢測方法。顧雙等[7]提取11種市售食品總DNA，使用ITS序列的引物pITS1和pITS4對其進行真菌鑒定，結合橘霉素生物合成相關基因pksCT的引物K和L，同樣使用單重PCR技術完成對食品中產橘霉素真菌的檢測，并對發(fā)酵前、發(fā)酵中及滅菌后的pksCT基因擴增情況進行了評價，結果表明，食品加工過程中各條件參數(shù)會影響目的基因的檢出率，紅曲霉發(fā)酵食品能夠擴增pksCT基因，而曲霉發(fā)酵食品未擴增pksCT基因。Gonzalez-Salgado等[8]采用曲霉rDNA的多拷貝內轉錄ITS區(qū)域引物ITS1和ITS4，結合單拷貝的黃曲霉毒素生物合成基因的特異性引物FLA1和FLA2，使用單重PCR技術實現(xiàn)對小麥粉中產黃曲霉毒素的黃曲霉及寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的檢測，結果表明，F(xiàn)LA1/FLA2的檢測可以有效避免假陰性的產生，檢出限(limit of detection，LOD)為10 pg·μL-1，但是該研究未能區(qū)分開黃曲霉和米曲霉(Aspergillusoryzae)。

以單重PCR技術為基礎，多重PCR技術是在同一個反應體系中加入2對或2對以上的引物，實現(xiàn)單體系同時擴增多個片段，進一步縮短了檢測時間，減少了工作量。李慧等[9]使用真菌鑒定通用引物ITS-600-F、ITS-600-R，結合依據(jù)國家標準中的aflR(產黃曲霉毒素調節(jié)基因，aflatoxin biosynthesis regulatory gene)、omt-1(柄曲霉素轉甲氧基酶基因，sterigmatocystin o-mcthyltransferase gene)、ver-1(雜色曲霉素A脫氫酶基因，versicolorin A dehydrogenase gene)設計3對引物，在單體系中同時進行4對特異性引物的多重PCR反應，快速高效地完成對產黃曲毒素真菌的檢測，在基因組DNA濃度為100 pg·μL-1時可被檢出。Sadhasivam等[10]首先使用4～5組種特異性引物建立了可檢測7個曲霉屬、9個鐮刀菌屬和5個青霉屬的5個多重PCR體系，然后使用根據(jù)真菌毒素生物合成相關基因設計的引物建立了檢測產黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A及鐮刀菌毒素真菌的3個多重PCR體系，其LOD也達到100 pg·μL-1，其多重PCR檢測結果與LC/MS/MS檢測真菌毒素結果之間具有很好的相關性。多個多重PCR聯(lián)用可能成為快速篩選大量樣本的可靠診斷手段，使真菌檢測工作更加便捷高效。但是從以上研究可以看出，多重PCR方法的靈敏度相較于單重PCR均較低，這可能是由于不同引物的特異性不同，存在底物競爭現(xiàn)象會降低體系的靈敏度。

PCR技術的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)方法中真菌檢測需要經過培養(yǎng)的問題，縮短了檢測所需時間，降低了檢測限，使產毒真菌的檢測技術從傳統(tǒng)形態(tài)學觀察及生化鑒定邁入了分子生物學技術的時代。常規(guī)PCR方法適用于擴增較長片段的真菌DNA，也是DNA指紋圖譜方法及DNA條形碼方法中的常用技術之一，但該方法不能對目標真菌實現(xiàn)定量檢測。

1.2 實時熒光定量PCR方法

實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)最早是Higuchi等[11]于1993年提出的可以實現(xiàn)定量的PCR方法，完成PCR技術從定性到定量的革命性跨越。該技術的原理是將具有熒光標記的核苷酸序列或熒光染料加入到反應體系中進行PCR反應，采集這些熒光信號后通過繪制擴增曲線即可實現(xiàn)對PCR反應過程的實時檢測，并且借助建立的標準曲線可以實現(xiàn)對未知樣品的絕對定量或相對定量。

實時熒光定量PCR技術的出現(xiàn)不僅簡化了實驗操作流程，縮短PCR反應時間，閉管實驗降低氣溶膠污染的風險，而且提高了PCR反應的特異性和靈敏度。Mylroie等[12]對黃曲霉的rRNA基因間隔區(qū)(IGS)設計特異性引物，使用SYBR Green染料法的qPCR技術對人工混合的DNA樣品進行定量，定量限(Limit of quantity，LOQ)為2.9 pg·μL-1，相較于普通PCR的LOD，其靈敏度有所提高且實現(xiàn)了定量檢測。王香君等[13]使用真菌鑒定通用引物對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉、曲霉進行了SYBR Green染料法的qPCR檢測，通過對溶解曲線分析確定0817F/1196R為檢測用引物，建立了單一真菌菌種DNA的標準曲線實現(xiàn)定量，3種真菌的LOQ約為6.5×10-3pg·μL-1，定量的靈敏度大大提高。Kulik[14]使用TaqMan探針法的單重qPCR方法對鐮刀菌的3ADON、15ADON及NIV3種基因型的Tri12基因進行了檢測，確定3種基因型的檢出限分別為20、1、10 pg。

具有多個熒光通道的實時熒光PCR儀為多重qPCR的建立奠定了基礎，通過設計合成含有不同熒光標記的TaqMan探針可以實現(xiàn)在單個反應體系中進行多個片段同時擴增的多重qPCR。金燕等[15]根據(jù)真菌rRNA基因序列設計ASPP、PENP、FUSP 3種特異性探針，將多重qPCR技術與裸磁珠富集技術聯(lián)用建立了可對辣椒中曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬3種產毒真菌的快速定量檢測方法，LOD達到103CFU·g-1，包括DNA提取在內的檢測時間縮短至7 h。多重qPCR的檢出限有可能比單重qPCR低，會受反應體系使用的引物/探針等因素的影響。Vegi等[16]根據(jù)單端孢霉烯合酶基因(Tri5)、rRNA基因和聚酮化合物合酶基因(Pks)設計出了3組引物探針，使用多重qPCR技術開發(fā)了可同時對產真菌毒素的赭曲霉、疣狀青霉(Penicilliumverrucosum)及禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)快速定量的方法，對基因組DNA的最低檢測限達到3 pg，比Kulik[14]的檢測方法檢出限更低。

qPCR方法適用于擴增片段大小為100～300 bp的真菌DNA，并且既可以對真菌的基因組DNA進行定量，也可以對真菌菌體數(shù)量進行定量。其中，SYBR Green染料法定量較TaqMan探針法成本低，但是該方法存在與非特異擴增產物結合產生假陽性的問題，因此不能進行多重qPCR體系的建立。

2 基于DNA指紋圖譜技術的產毒真菌檢測方法

DNA指紋圖譜技術是利用不同物種DNA水平上的多態(tài)性差異，以現(xiàn)代分子生物學方法標記并建立可以有效鑒定或檢測物種圖譜的技術[17]。目前，較為常見的DNA指紋圖譜技術根據(jù)報道時間先后順序主要包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)、隨機擴增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified dragment length polymorphism，AFLP)等。

2.1 RFLP方法

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是Botstein等[18]于1980年提出的分子標記技術。其原理通常是使用合適的引物對特定區(qū)域擴增后，使用限制性內切酶酶切PCR產物并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過與已建立的PCR-RFLP圖譜比對達到鑒定或檢測的目的。隨著基因測序技術的普及和發(fā)展，也會將電泳產物純化后測序，結合序列同源性比對得到更加準確的結果。Bisbal等[19]通過對真菌ITS區(qū)域進行常規(guī)PCR擴增并使用限制性內切酶HhaⅠ、NlaⅢ和RsaⅠ對PCR產物酶切后電泳，將電泳圖與4種ITS-RFLP圖譜比對，結合測序結果的序列同源性比對完成對132株黑曲霉的分類學鑒定。王彩虹等[20]通過將RFLP指紋圖譜技術與真菌ITS基因文庫、測序和系統(tǒng)發(fā)育學分析相結合，對瀘州老窖高溫大曲和郎酒超高溫大曲的真菌菌落結構進行了研究，通過使用通用引物ITS1和ITS4對真菌ITS序列擴增并通過MspⅠ和HhaⅠ進行雙酶切構建酶切圖譜，與測序得到的基因文庫片段大小比對分析完成對真菌菌落結構的分析，此外通過ITS文庫法還發(fā)現(xiàn)了Xeromycesbisporus、Thermomucorindicaeseuda-ticae、Trichomonascusciferrii等相關研究中未曾報道的菌種。Kizis等[21]也使用相同的真菌通用引物對真菌ITS序列進行常規(guī)PCR擴增，并使用HinfⅠ、HhaⅠ、RsaⅠ 3種限制性內切酶酶切11種不同的RFLP片段，將124個分離株劃分為4個曲霉菌種，4個分離株劃分為黑曲霉菌株。孫長坡等[22]通過對黃曲霉毒素合成途徑調控基因aflR及其啟動子序列設計引物并進行常規(guī)PCR擴增，使用NheⅠ、PvuⅡ、HincⅡ3種限制內切酶酶切PCR產物后電泳，結合測序結果進行多態(tài)性及RFLP分析，結果表明，對aflR啟動子片段的NheⅠ位點分析可判別菌株的產黃曲霉毒素能力，對aflR基因的PvuⅡ和HincⅡ位點分析可以進一步實現(xiàn)黃曲霉和寄生曲霉的區(qū)分。根據(jù)ITS序列可以實現(xiàn)對產毒真菌的分類鑒別，根據(jù)毒力基因可以實現(xiàn)真菌產毒能力的評價，同時毒力基因也可能具有分類鑒別的功能；RFLP限制性內切酶需要根據(jù)真菌ITS序列或毒力基因的酶切位點來選擇。

2.2 SSCP方法

單鏈構象多態(tài)性(SSCP)是Orita等[23]于1989年提出的一種單核苷酸鏈多態(tài)性分析技術，其原理是常規(guī)PCR擴增后的特定雙鏈DNA片段經變性解旋后變成單鏈，變性后的單鏈核苷酸并不是保持一條直鏈，而是在氫鍵等分子作用力下形成具有一定空間三維構象的核苷酸鏈，導致單鏈核苷酸在電泳中具有不同的遷移速度，通過分析在電泳時由于單核苷酸差異所呈現(xiàn)的不同條帶實現(xiàn)鑒定的目的[24-25]。陳娟等[26]采用基于β-tubulin基因片段的PCR-SSCP技術檢測藥材六神曲中含有3屬5種真菌，但是基于β-tubulin基因設計的引物在擴增復雜DNA樣品時存在擴增效率低的問題，導致該方法覆蓋面較小。Susca等[27]對鈣調蛋白基因種特異區(qū)域設計通用引物SSCPCL1和SSCPCL2，通過對50株曲霉屬真菌進行PCR擴增，配合高靈敏度特性的毛細管電泳完成對黑曲霉的檢測，使用SSCP技術準確鑒定出屬于16個黑曲霉中的所有39個基因型，說明SSCP在結合高靈敏度的電泳時,其檢測靈敏度也會大大提高。Dong等[28]使用真菌鑒定通用引物ITS4和ITS5擴增目的基因，通過PCR-SSCP技術結合低溫時pH可變電泳基質的高分辨率特性完成從土壤中分離出尖孢鐮刀菌的鑒定，并進行DNA測序、序列同源性比對驗證了試驗結果，同時該研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈DNA在變性過程中含有未完全變性的雙鏈DNA，從而形成更加復雜的構象。

2.3 RAPD方法

隨機擴增多態(tài)性(RAPD)是Williams等[29]和Welsh等[30]提出的一種通過分析隨機引物經PCR擴增出的DNA片段多態(tài)性來鑒定物種或探索基因表達規(guī)律的技術。其原理是使用人工合成的多條隨機寡核苷酸(10 nt左右)對基因組DNA進行常規(guī)PCR擴增，通過分析含有不同大小片段的隨機PCR產物的電泳圖，并與指紋圖譜比對后達到鑒定或檢測的目的[31]。Khodadadi等[32]通過隨機擴增多態(tài)性DNA標記確定了產毒性和非產毒性黃曲霉與寄生曲霉之間的遺傳關系，從開心果中分離出17株黃曲霉和34株寄生曲霉，通過高效液相色譜法測定了其產毒能力，并隨機選擇6株黃曲霉和13株寄生曲霉，使用5個隨機引物進行PCR擴增，分析其多態(tài)性，結果表明，RAPD技術雖然無法鑒別產毒性能，但能夠區(qū)分開黃曲霉與寄生曲霉。Fungaro等[33]使用10個隨機引物擴增出95個RAPD位點，與指紋圖譜對比，將25株菌株分為兩組，結果顯示，RAPD基因型與OTA的產生能力沒有明顯的相關性，在結合ITS區(qū)域測序結果與GenBank提供的數(shù)據(jù)建立了適應性更廣泛的系統(tǒng)發(fā)育樹后，不僅能夠完成赭曲霉的檢測，同時也研究了其產毒性能，為赭曲霉的檢測工作奠定了理論基礎。RAPD可以實現(xiàn)不同真菌的分類，但當利用條帶強弱證明菌株之間差異時，很難比較和解釋圖譜。此外，某些產物可能代表擴增效率相對低的反應，技術因素的微小變動可能導致不同擴增反應中特定菌株產生的實際片段差異很大[34]。

2.4 AFLP方法

擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)是Zabeau等[35]以專利的形式發(fā)明并發(fā)展出來的一種DNA多態(tài)性檢測方法，其原理是根據(jù)基因組DNA堿基發(fā)生的插入、缺失、重復及酶切位點堿基突變等情況，對其進行雙酶切產生隨機大小的片段，通過設計AFLP的引物序列進行常規(guī)PCR擴增并進行變性聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳，最后在膠塊上會形成不同分子量大小、不同條帶數(shù)指紋圖譜，通過指紋圖譜的比對實現(xiàn)鑒定或檢測的目的[36]。AFLP技術是在RFLP技術基礎上進行的優(yōu)化與改進，提高了試驗結果的可重復性和穩(wěn)定性。Schmidt等[37]從食品中分離出70株真菌并進行了分類學及產毒能力鑒定，使用pre-EcoRⅠ primer、pre-MseⅠ primer、pre-BfaⅠ primer 3條AFLP引物對其基因組DNA進行了常規(guī)PCR擴增并對赭曲霉AFLP圖譜進行聚類分析，結合基因測序技術對結果進行驗證，最終建立了一套適用于赭曲霉鑒定的AFLP方法，相較于Kizis等[21]的黑曲霉鑒定的RFLP方法，其試驗結果可重復性更好。Botton等[38]對兩株炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)進行RNA提取并反轉錄出雙鏈cDNA，使用AFLP技術對雙鏈cDNA酶切后進行常規(guī)PCR擴增，分析試驗結果中119個OTA生物合成及調節(jié)的差異表達基因的PAGE條帶指紋圖譜，結合從電泳條帶純化出的DNA測序結果分析，為產OTA真菌的檢測提供了一套方法，相較于Fungaro等[33]針對赭曲霉產毒性能的RAPD研究方法，其試驗結果穩(wěn)定性更好。

總之，不同DNA指紋圖譜方法具有各自的優(yōu)缺點，RFLP方法可以實現(xiàn)對產毒真菌的檢測但靈敏度較低；SSCP方法適用于高通量食品樣本的篩查，對DNA樣品要求不高；RAPD方法不需要專門設計引物即可進行檢測，適用于未知真菌序列的樣品檢測；AFLP方法相較于RFLP酶切的目的性更強，電泳分辨率更高，可用于構建真菌基因組高密度連鎖圖譜，適用于產毒真菌單一菌種的檢測。但是，目前真菌DNA指紋圖譜檢測方法在產毒真菌檢測中存在的問題是沒有完整的指紋圖譜庫，不同實驗室之間很難進行比較。

3 基于DNA條形碼技術的產毒真菌檢測方法

DNA條形碼技術(DNA barcode)是Hebert等[39]于2003年提出的一種使用常規(guī)PCR技術及基因測序技術，利用短DNA片段進行物種鑒定或檢測的技術。其中，短DNA片段通常是在物種中具有一定保守性的序列，比如線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(mitochondrial gene cytochrome coxidase I，COI)的特定DNA片段可以完成動物界中除刺胞動物門外的物種鑒定；葉綠體核糖激酶1，5-二磷酸羧化酶基因(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase，rbcL)和蛋白成熟酶K基因(maturase K，matK)以及核基因片段(internal transcribed spacer，ITS)可完成植物界的物種鑒定[40-41]等。

DNA條形碼技術在真菌鑒定時是將ITS確定為真菌的通用條形碼[42]，配合其基因組其他DNA序列實現(xiàn)對真菌的分類學鑒定或者產毒性能檢測[43]。DNA條形碼在生物物種鑒定方面逐漸得到了廣泛應用。如Geiser等[44]結合β-tubulin(微管蛋白基因)、CAL(鈣調蛋白基因)實現(xiàn)對曲霉屬的分類學鑒定；Seifert等[45]使用COI基因實現(xiàn)對青霉亞屬的鑒定；Panelli等[46]擴增包括核糖體ITS1、ITS2和26SrRNA基因的D1/D2區(qū)域和非核糖體的β-tubulin、EF-1α基因的DNA條碼，通過基因測序及序列比對，鑒定出了3株尖孢枝孢菌屬(Cladosporiumoxysporum)的真菌及2株新菌種。Chen等[47]在Seifert研究的基礎上研制了COX1條碼寡核苷酸陣列，實現(xiàn)了對青霉亞屬真菌的高通量檢測，但是由于真菌種類復雜，其青霉亞屬之間的COX1基因序列相似性很高，導致容易出現(xiàn)交叉反應，需要更多的實驗來優(yōu)化此檢測方法。

DNA條碼的選取是真菌分類鑒定的關鍵，由于目前在研究真菌的DNA條碼時不能做到全部取樣，僅用幾個代表屬種來驗證此條碼，具有一定的不合理性[48]。運用DNA條形碼技術對真菌進行鑒別時，重點在于真菌種間和種內差異的界定，對于一些半知菌而言，無法明確其分類學地位，在應用該技術對半知菌進行鑒別時會有一定困難。隨著DNA條碼技術及真菌分類學的發(fā)展，對真菌種水平以下細分化的DNA條碼也許會在實現(xiàn)真菌分類的同時,能預測其產毒性能。

4 展望

基于核酸的產毒真菌檢測方法使用的技術雖然不同，但其原理相通，通常使用通用引物結合毒力基因或生化合成途徑關鍵調控基因的特異性引物可實現(xiàn)對真菌分類及產毒性能鑒別。其中，真菌分類鑒定通用引物所選取的區(qū)域通常是多拷貝的核糖體DNA(rDNA)，包括18S小亞基單元、ITS1區(qū)、5.8S區(qū)、ITS2區(qū)和大亞基單元28S的序列[49]，并且不同產毒真菌可能攜帶相同或不同的毒力基因[50]。因此可以在毒力基因上提高檢測的特異性，當對一種產毒真菌的多個毒力基因同時鑒別時，其鑒別特異性越強，檢測結果越可靠。例如我國現(xiàn)行標準SN/T 2582—2010中對產黃曲霉毒素真菌的檢測使用ITS序列引物結合黃曲霉毒素調節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉甲氧基酶基因omt-1、雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-13種基因，實現(xiàn)了對產黃曲霉毒素真菌的高特異性檢測。

隨著核酸技術的快速革新，其在食品中產毒真菌鑒定的應用上也發(fā)生著日新月異的變化，對真菌的鑒定也變得更加多元化。目前，核酸檢測方法在產毒真菌方法檢測中存在的技術難點是：在真菌污染食品的早期潛藏的菌體量非常少，需要對真菌進行富集，對核酸提取的方法要求高，否則達不到核酸檢測方法的最低檢測限，導致無法實現(xiàn)檢測。數(shù)字PCR技術(digital PCR，dPCR)是[51]在常規(guī)PCR技術和qPCR技術的基礎上發(fā)展起來的第三代PCR技術，其原理是通過一種技術方案將帶有熒光探針的PCR反應體系稀釋至單分子水平，并分配到幾十至上千萬個單元再進行常規(guī)PCR反應，最后通過對熒光單元進行讀取計數(shù)分析計算，從而實現(xiàn)對樣品拷貝數(shù)的絕對定量。數(shù)字PCR的技術方案主要分為微孔式、微腔式、微滴式等。其中，微滴式數(shù)字PCR技術(droplet digital PCR, ddPCR)以操作較簡便、成本較低的優(yōu)勢得到了更廣泛的應用[52]。ddPCR目前在微生物檢測、肉制品摻假成分檢測、產前診斷等領域取得了很大的進展，由于DNA被稀釋成單分子并在單個反應室內進行，所以ddPCR具有很高的靈敏度并且可以降低復雜食品基質抑制因子的干擾，能夠滿足微生物快檢的快速、高通量的要求，未來在產毒真菌快速檢測中會有巨大的發(fā)展前景。