崔文婷，胡蘇，黃燕，歐陽鵬，馮波

（九江市第一人民醫(yī)院血液科，江西 九江332000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種臨床中常見的漿細(xì)胞惡性疾病，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未明確，分析可能與輻射、環(huán)境及年齡等因素密切相關(guān)[1]。若治療不及時(shí)，極有可能導(dǎo)致患者的骨骼和腎功能出現(xiàn)損傷，并出現(xiàn)高鈣血癥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者的身心健康。通常情況下，臨床多使用靶向分子藥物治療該病，雖能取得一定效果，但不能完全治愈，還需進(jìn)一步研究，以探尋更為合適的靶點(diǎn)進(jìn)行治療，從而達(dá)到治愈的目的[2]。鈣周期蛋白S100A6是細(xì)胞外功能-手形結(jié)構(gòu)的信號(hào)分子之一，在胃癌、肝癌、乳腺癌及多發(fā)性骨髓瘤中均呈高表達(dá)。c-MYC基因是一種擁有永生能力的基因，臨床研究[3]顯示，MM的發(fā)病原因和疾病進(jìn)展與c-MYC基因重排和突變密切相關(guān)，人體內(nèi)的大多數(shù)基因均能經(jīng)過c-MYC途徑對MM細(xì)胞造成影響，從而導(dǎo)致MM細(xì)胞凋零?；诖?，本研究旨在探究c-MYC蛋白及S100A6在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年1月至2020年1月本院收治的60例MM患者作為研究對象，其中男32例，女28例；年齡45～80歲，平均（65.14±3.21）歲；分型：IgG型31例，IgA型18例，輕鏈型8例，不分泌型3例；D-S分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期35例，Ⅲ期23例；髓外移者21例，無髓外移者39例。所有患者均對本研究知情同意并自愿簽署知情同意書。本研究已通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法采集標(biāo)本：于患者化療前及化療4～6個(gè)療程后取患者3 mL的骨髓（肝素抗凝），并以1∶1的比例添加至淋巴細(xì)胞分離液中，隨后采取離心的方式收集中間層細(xì)胞，800 r/min離心30 min，離心后使用RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行清洗，以分離單核細(xì)胞。

熒光定量PCR法檢測MM的c-myc蛋白及S100A6表達(dá)：采用TRIzol試劑提取分離獲得的化療前后患者的單核細(xì)胞總RNA，并使用蛋白核酸分析儀測量RNA的濃度和純度。使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA作為模板，使 用Real time PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒擴(kuò)增PCR后檢測c-myc蛋白及S100A6的表達(dá)。

細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)：血液科實(shí)驗(yàn)室將MM U266細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并保存，取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測S100A6 siRNA轉(zhuǎn)染后U266細(xì)胞中c-MYC、S100A6的表達(dá)：收集S100A6 siRNA轉(zhuǎn)染后的各組U266細(xì)胞，并嚴(yán)格按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞的c-MYC、S100A6表達(dá)水平。連續(xù)進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分期MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-myc、S100A6表達(dá)水平c-MYC、S100A6表達(dá)與MM臨床分期均存在相關(guān)性（P＜0.05），見表1。

表1 不同分期MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-MYC、S100A6表達(dá)水平[n（%）]

2.2 患者化療前后骨髓c-MYC和S100A6表達(dá)水平比較化療后，MM患者骨髓c-MYC、S100A6表達(dá)水平均明顯低于化療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 患者化療前后骨髓c-MYC和S100A6表達(dá)水平比較（±s）

表2 患者化療前后骨髓c-MYC和S100A6表達(dá)水平比較（±s）

注：c-MYC，c-MYC基因；S100A6，S100鈣結(jié)合蛋白A6

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2.3 髓外轉(zhuǎn)移MM患者c-MYC和S100A6的表達(dá)水平比較髓外轉(zhuǎn)移MM患者的單個(gè)核細(xì)胞S100A6、c-MYC表達(dá)水平均均明顯低于無髓外轉(zhuǎn)移MM患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 髓外轉(zhuǎn)移MM患者c-MYC和S100A6的表達(dá)水平比較（±s）

表3 髓外轉(zhuǎn)移MM患者c-MYC和S100A6的表達(dá)水平比較（±s）

注：c-MYC，c-MYC基因；S100A6，S100鈣結(jié)合蛋白A6

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3 討論

MM屬于血液系統(tǒng)疾病，在我國的發(fā)病率較高，較難治愈，且該病的病程較長，危害性較大。近年來，我國的檢測技術(shù)水平不斷提升，臨床也逐漸提高了對分子生物學(xué)研究的重視程度。腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程較為復(fù)雜，主要由多因素、多基因及多階段共同組成，其中還有大量的信號(hào)分子在該過程中發(fā)揮重要作用，但具體哪種作用尚無研究證實(shí)[4]。

S100蛋白家族是指存在EF-手形結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白信號(hào)分子，家族成員眾多，個(gè)別成員在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程均具有異常的表達(dá)，且該類信號(hào)分子還能在腫瘤細(xì)胞增生、凋零及遷移過程中發(fā)揮作用[5]。此外，S100蛋白家族還能通過不同成員配形的方式與RAGE、EGFR和TLR4等部分受體相互結(jié)合，從而起到介導(dǎo)腫瘤發(fā)展的作用，其中，RAGE是一種免疫球蛋白超家族的多配體信號(hào)受體，能在炎癥和腫瘤的發(fā)病過程中產(chǎn)生作用，而RAGE在激活后，轉(zhuǎn)錄因子NFKB、MAP及粘附分子在內(nèi)的各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子均能發(fā)生活化，該類分子會(huì)隨著RAGE配體的改變而改變。此外，S100蛋白家族中的部分成員還能通過自分泌及旁分泌的方式在細(xì)胞外釋放，釋放后可與S100A12、S100B等分子有機(jī)結(jié)合，從而發(fā)揮出更大的作用[6]。S100A6是S100蛋白家族中的一員，是一種位于細(xì)胞內(nèi)部的蛋白，其蛋白分子接近10 235分子量，其活性形式均為二聚體，在充分與鈣離子相互結(jié)合后，可完全暴露EF-手型經(jīng)典區(qū)，該區(qū)能充分與多樣性的靶蛋白有機(jī)結(jié)合，但主要作用尚無權(quán)威證實(shí)，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。據(jù)相關(guān)研究[7]顯示，S100A6能在肝細(xì)胞中提高表達(dá)，在促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤增生中發(fā)揮重要的作用。此外，還有研究[8]表明，與良性細(xì)胞相比，S100A6的表達(dá)水平在胰腺惡性細(xì)胞中較高，可見S100A6能對胰腺癌患者的預(yù)后因素產(chǎn)生影響。c-MYC屬于可易位基因，能調(diào)節(jié)多種物質(zhì)，在骨髓瘤發(fā)生及疾病進(jìn)展的過程中均能起促進(jìn)作用，因此，臨床可將該基因作為治療骨髓瘤的靶點(diǎn)。S100A6與Annexin 2一致，均屬于鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，這兩種蛋白在腫瘤中共同表達(dá)，能在一定程度上加快腫瘤的生長。臨床研究[9]顯示，S100A6與Annexin 2在胰腺癌共同表達(dá)，能加快胰腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中共同表達(dá)，能加快腫瘤細(xì)胞的增生和遷移。此外，Annexin 2還能經(jīng)c-MYC通路作用于惡性腫瘤中，但主要作用尚未明確。近年的研究結(jié)果[10]表明，c-MYC基因重排、突變及mRNA水平升高與MM發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，人體內(nèi)的大多基因均通過c-MYC途徑對MM細(xì)胞造成侵蝕，而S100A6與腫瘤增殖、浸潤及凋零中的關(guān)聯(lián)較為密切，因此，在各種實(shí)體腫瘤中均存在較為異常的表達(dá)，可見c-MYC與S100A6在MM患者中呈高表達(dá)。在使用熒光定量PCR法對患者進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，c-MYC、S100A6表達(dá)與MM臨床分期均存在相關(guān)性。由此可見，MM患者的c-MYC、S100A6表達(dá)水平較高。c-MYC基因是骨髓瘤和淋巴瘤研究領(lǐng)域的重點(diǎn)內(nèi)容，在骨髓瘤中，大部分與腫瘤相關(guān)的基因均能相互結(jié)合，使其作用獲得進(jìn)一步增強(qiáng)，有利于加快腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，而S100A6與c-MYC的表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，化療后，MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-MYC、S100A6表達(dá)水平均明顯低于化療前（P＜0.05）。表明c-MYC、S100A6在化療前的表達(dá)水平較高。c-MYC屬于原癌基因，其功能較為多樣，主要位于染色體8q24上，該基因不僅含有轉(zhuǎn)錄因子的功能，還能抑制細(xì)胞的分化、進(jìn)展及凋零。小鼠漿細(xì)胞瘤實(shí)驗(yàn)[11]證實(shí)，人類多發(fā)性骨髓瘤中存在c-MYC的重排和過度表達(dá)，是影響預(yù)后的不良因素之一。有報(bào)道[12]顯示，S100A6在骨髓瘤髓外轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)增高，且極有可能直接在骨髓遷移中發(fā)揮作用，可見S100A6可能參與骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的過程，但具體作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果還顯示，存在髓外轉(zhuǎn)移MM患者單個(gè)核細(xì)胞c-MYC、S100A6表達(dá)水平明顯高于無髓外轉(zhuǎn)移MM患者（P＜0.05）。表明存在髓外轉(zhuǎn)移的MM患者，c-MYC、S100A6表達(dá)水平較高。

綜上所述，使用熒光定量PCR法檢測MM患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-MYC、S100A6表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，c-MYC、S100A6在化療前及存在骨髓外轉(zhuǎn)移MM患者中的表達(dá)水平均較高，但c-MYC、S100A6在MM中的主要作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。