鄧雯，周鑫，袁幼紅

（宜昌市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北 宜昌443100）

甲基丙二酸血癥（MMA）是我國最常見的器質(zhì)性酸尿癥，發(fā)病年齡不同，多為新生兒，其臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜，且缺乏特異性，易導(dǎo)致誤診或漏診，具有較高的致殘率和死亡率，如治療不及時(shí)會(huì)給臟器造成不可逆的損傷，因此，早期診斷和治療尤為重要[1]。長期以來，MMA的早期篩選主要依靠串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血樣中丙?；鈮A（C3）和乙?；鈮A（C2），并計(jì)算其比值，具有檢測迅速、創(chuàng)傷小、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。然而，串聯(lián)質(zhì)譜篩查中最突出的問題是陽性預(yù)測值低、初篩陽性率高并具有漏檢現(xiàn)象。因C3等指標(biāo)易受出生胎齡、體質(zhì)量、低血糖、感染、抗生素使用等因素干擾，或處于臨界值或稍有升高，會(huì)出現(xiàn)假陽性狀況，反之，由于部分新生兒出生后72 h內(nèi)缺乏蛋白質(zhì)，處于疾病窗口期，C3等指標(biāo)會(huì)顯示正常，出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏檢，因此，探尋其他有效篩查方式具有重要意義[3-4]。本研究在串聯(lián)質(zhì)譜檢測的基礎(chǔ)上聯(lián)合高效液相色譜檢測，分析血片中C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平變化情況，旨在為新生兒MMA患兒的篩查提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年10月至2019年10月本院收治的55例新生兒MMA患兒作為研究組，另選取同期55名健康新生兒作為對(duì)照組。對(duì)照組男26例，女29例；胎齡38～42周，平均胎齡（40.24±1.27）周；日齡1～25 d，平均日齡（10.28±1.27）d；出生體質(zhì)量1～4 kg，平均體質(zhì)量（2.46±0.51）kg。研究組男25例，女30例；胎齡38～42周，平均胎齡（40.45±1.11）周；日齡1～24 d，平均日齡（10.39±1.40）d；出生體質(zhì)量2～4 kg，平均體質(zhì)量（2.54±0.37）kg。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有患兒家屬均對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書。本研究已通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒科學(xué)（第9版）》[5]中甲基丙二酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；均為足月患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肺功能障礙患兒；合并感染性疾病患兒；合并顱內(nèi)出血患兒；合并貧血患兒。

1.2 方法

1.2.1 串聯(lián)質(zhì)譜檢測將3 mm干濾紙（相當(dāng)于3.2 μL全血）放入96孔U形板中，在樣品測定試劑盒中設(shè)置質(zhì)量控制點(diǎn)，高、低濃度質(zhì)控血點(diǎn)每板設(shè)置2孔，以保證檢測質(zhì)量。串聯(lián)質(zhì)譜儀采用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司生產(chǎn)的API 2000型/API4000型。靜脈抽血或手指采血，滴于采血濾紙上，晾干后送檢。采用非衍生化方法進(jìn)行處理，每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL萃取液和內(nèi)標(biāo)混合物（美國PE公司，非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測試劑盒）。萃取液在45℃下密封，恒溫振蕩45 min，然后將提取液轉(zhuǎn)移到96孔U形板上檢測，用鋁膜覆蓋，室溫保存2 h，即可對(duì)樣品進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)采集采用電噴霧正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測模式。樣本測定時(shí)間為3 min，進(jìn)樣量15 μL。檢測血液中C3及C3/C2水平。

1.2.2 高效液相色譜檢測靜脈抽血或手指采血，滴于采血濾紙上，晾干后送檢。用直徑為3 mm的穿孔機(jī)從初始血點(diǎn)樣本中取出3個(gè)血點(diǎn)，放入96孔U形板中，向每個(gè)孔中加入含內(nèi)標(biāo)甲醇和二硫蘇糖醇（DTT）溶液，室溫放置20 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至96孔V形板中，在55℃下干燥，加入鹽酸正丁醇，用聚四氟乙烯膜覆蓋，置于65℃恒溫箱中15 min，然再以55℃吹干，加入乙腈，用鋁膜覆蓋，即可進(jìn)行液相色譜檢測。采用日本島津公司生產(chǎn)的20ADXR型高效液相色譜儀，檢測血液中的甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平。

1.3 觀察指標(biāo)正常人血液中C3及C3/C2的參考值為0.50～4.00 μmol/L、0.04～0.25；正常人血液中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸的含量為0.2～3.6、0.0～1.1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC）值，AUC值＞0.90表示診斷性能較高，0.71～0.90表示診斷性能較為理想，0.50～0.70表示診斷性能較差，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較研究組C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

表1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

注：C3，丙?；鈮A，C2，乙酰基肉堿

?

2.2 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值分析繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，串聯(lián)質(zhì)譜中C3及C3/C2對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積分別為0.790、0.883，高效液相色譜中甲基丙二酸及甲基枸櫞酸對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積分別為0.889、0.992，診斷效能較理想；聯(lián)合診斷對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積為0.997，診斷效能較高，見表2、圖1。

圖1 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值ROC曲線圖Figure 1 ROC curve of the evaluation value of tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

表2 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值Table 2 Evaluation value of combined tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

3 討論

MMA是臨床常見的有機(jī)酸血癥，因其甲基丙二酰輔酶A變位酶及其輔酶鈷胺（cobalamin，CBL）的缺陷，甲基丙二酰輔酶A在纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和奇碳脂肪酸的分解代謝過程中不能轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，且旁路代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致甲基丙二酸、甲基枸櫞酸及丙酸的異常積累，引起臟器多處損傷，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷。體內(nèi)積聚的有機(jī)酸與CO結(jié)合，轉(zhuǎn)化為?；鈮A代謝，因此，MMA患兒體內(nèi)中C3、甲基丙二酸和甲基枸櫞酸含量增加[6-7]。MMA患者的主要臨床表現(xiàn)為嗜睡、抽搐、反復(fù)嘔吐、呼吸困難、肌張力減退、運(yùn)動(dòng)障礙和代謝性酸中毒，如不及時(shí)診治，死亡率可高達(dá)80%，即便幸存也多會(huì)有智力低下、生長發(fā)育遲緩等后遺癥，因此，早期篩查尤為重要[8]。

串聯(lián)質(zhì)譜檢測血C3、C3/C2水平和高效液相色譜檢測血甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平是診斷新生兒MMA的有效檢測方法，同時(shí)伴有其他有機(jī)酸或?；鈮A的變化。高效液相色譜可檢測多種有機(jī)酸水平，其中甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平升高是診斷新生兒MMA的特異性指標(biāo)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，研究組C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積為0.997，診斷效能高于串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜單獨(dú)檢測，證實(shí)甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平診斷新生兒MMA的可靠性，但在其他疾病繼發(fā)性酸中毒或慢性病引起維生素B12吸收障礙時(shí)，甲基丙二酸排出量也可能略有增加，而血C3水平和C3/C2通常維持正常水平[11]。因此，對(duì)于甲基丙二酸水平稍有升高的患者，需聯(lián)合血液串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行綜合分析。串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血液中C3和C3/C2對(duì)該病的診斷具有重要意義，有研究結(jié)果證實(shí)，綜合分析血液中C3和C3/C2水平可使診斷的特異性提高至99.903%[12-13]。因此，聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜診斷新生兒MMA診斷效能較高。

綜上所述，C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸在新生兒MMA患兒中明顯升高，聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜應(yīng)用具有較高的診斷效能。