鄧雯，周鑫，袁幼紅

（宜昌市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北 宜昌443100）

甲基丙二酸血癥（MMA）是我國(guó)最常見的器質(zhì)性酸尿癥，發(fā)病年齡不同，多為新生兒，其臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜，且缺乏特異性，易導(dǎo)致誤診或漏診，具有較高的致殘率和死亡率，如治療不及時(shí)會(huì)給臟器造成不可逆的損傷，因此，早期診斷和治療尤為重要[1]。長(zhǎng)期以來，MMA的早期篩選主要依靠串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血樣中丙?；鈮A（C3）和乙?；鈮A（C2），并計(jì)算其比值，具有檢測(cè)迅速、創(chuàng)傷小、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。然而，串聯(lián)質(zhì)譜篩查中最突出的問題是陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低、初篩陽(yáng)性率高并具有漏檢現(xiàn)象。因C3等指標(biāo)易受出生胎齡、體質(zhì)量、低血糖、感染、抗生素使用等因素干擾，或處于臨界值或稍有升高，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性狀況，反之，由于部分新生兒出生后72 h內(nèi)缺乏蛋白質(zhì)，處于疾病窗口期，C3等指標(biāo)會(huì)顯示正常，出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏檢，因此，探尋其他有效篩查方式具有重要意義[3-4]。本研究在串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的基礎(chǔ)上聯(lián)合高效液相色譜檢測(cè)，分析血片中C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平變化情況，旨在為新生兒MMA患兒的篩查提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年10月至2019年10月本院收治的55例新生兒MMA患兒作為研究組，另選取同期55名健康新生兒作為對(duì)照組。對(duì)照組男26例，女29例；胎齡38～42周，平均胎齡（40.24±1.27）周；日齡1～25 d，平均日齡（10.28±1.27）d；出生體質(zhì)量1～4 kg，平均體質(zhì)量（2.46±0.51）kg。研究組男25例，女30例；胎齡38～42周，平均胎齡（40.45±1.11）周；日齡1～24 d，平均日齡（10.39±1.40）d；出生體質(zhì)量2～4 kg，平均體質(zhì)量（2.54±0.37）kg。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有患兒家屬均對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書。本研究已通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒科學(xué)（第9版）》[5]中甲基丙二酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；均為足月患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肺功能障礙患兒；合并感染性疾病患兒；合并顱內(nèi)出血患兒；合并貧血患兒。

1.2 方法

1.2.1 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)將3 mm干濾紙（相當(dāng)于3.2 μL全血）放入96孔U形板中，在樣品測(cè)定試劑盒中設(shè)置質(zhì)量控制點(diǎn)，高、低濃度質(zhì)控血點(diǎn)每板設(shè)置2孔，以保證檢測(cè)質(zhì)量。串聯(lián)質(zhì)譜儀采用美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司生產(chǎn)的API 2000型/API4000型。靜脈抽血或手指采血，滴于采血濾紙上，晾干后送檢。采用非衍生化方法進(jìn)行處理，每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL萃取液和內(nèi)標(biāo)混合物（美國(guó)PE公司，非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒）。萃取液在45℃下密封，恒溫振蕩45 min，然后將提取液轉(zhuǎn)移到96孔U形板上檢測(cè)，用鋁膜覆蓋，室溫保存2 h，即可對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)采集采用電噴霧正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。樣本測(cè)定時(shí)間為3 min，進(jìn)樣量15 μL。檢測(cè)血液中C3及C3/C2水平。

1.2.2 高效液相色譜檢測(cè)靜脈抽血或手指采血，滴于采血濾紙上，晾干后送檢。用直徑為3 mm的穿孔機(jī)從初始血點(diǎn)樣本中取出3個(gè)血點(diǎn)，放入96孔U形板中，向每個(gè)孔中加入含內(nèi)標(biāo)甲醇和二硫蘇糖醇（DTT）溶液，室溫放置20 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至96孔V形板中，在55℃下干燥，加入鹽酸正丁醇，用聚四氟乙烯膜覆蓋，置于65℃恒溫箱中15 min，然再以55℃吹干，加入乙腈，用鋁膜覆蓋，即可進(jìn)行液相色譜檢測(cè)。采用日本島津公司生產(chǎn)的20ADXR型高效液相色譜儀，檢測(cè)血液中的甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平。

1.3 觀察指標(biāo)正常人血液中C3及C3/C2的參考值為0.50～4.00 μmol/L、0.04～0.25；正常人血液中甲基丙二酸、甲基枸櫞酸的含量為0.2～3.6、0.0～1.1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC）值，AUC值＞0.90表示診斷性能較高，0.71～0.90表示診斷性能較為理想，0.50～0.70表示診斷性能較差，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較研究組C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

表1 兩組C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸水平比較（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

注：C3，丙?；鈮A，C2，乙?；鈮A

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2.2 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測(cè)對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值分析繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，串聯(lián)質(zhì)譜中C3及C3/C2對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積分別為0.790、0.883，高效液相色譜中甲基丙二酸及甲基枸櫞酸對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積分別為0.889、0.992，診斷效能較理想；聯(lián)合診斷對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積為0.997，診斷效能較高，見表2、圖1。

圖1 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測(cè)對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值ROC曲線圖Figure 1 ROC curve of the evaluation value of tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

表2 串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜聯(lián)合檢測(cè)對(duì)新生兒MMA的評(píng)估價(jià)值Table 2 Evaluation value of combined tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

3 討論

MMA是臨床常見的有機(jī)酸血癥，因其甲基丙二酰輔酶A變位酶及其輔酶鈷胺（cobalamin，CBL）的缺陷，甲基丙二酰輔酶A在纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和奇碳脂肪酸的分解代謝過程中不能轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，且旁路代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致甲基丙二酸、甲基枸櫞酸及丙酸的異常積累，引起臟器多處損傷，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷。體內(nèi)積聚的有機(jī)酸與CO結(jié)合，轉(zhuǎn)化為?；鈮A代謝，因此，MMA患兒體內(nèi)中C3、甲基丙二酸和甲基枸櫞酸含量增加[6-7]。MMA患者的主要臨床表現(xiàn)為嗜睡、抽搐、反復(fù)嘔吐、呼吸困難、肌張力減退、運(yùn)動(dòng)障礙和代謝性酸中毒，如不及時(shí)診治，死亡率可高達(dá)80%，即便幸存也多會(huì)有智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等后遺癥，因此，早期篩查尤為重要[8]。

串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血C3、C3/C2水平和高效液相色譜檢測(cè)血甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平是診斷新生兒MMA的有效檢測(cè)方法，同時(shí)伴有其他有機(jī)酸或?；鈮A的變化。高效液相色譜可檢測(cè)多種有機(jī)酸水平，其中甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平升高是診斷新生兒MMA的特異性指標(biāo)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，研究組C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷對(duì)新生兒MMA診斷的曲線下面積為0.997，診斷效能高于串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜單獨(dú)檢測(cè)，證實(shí)甲基丙二酸及甲基枸櫞酸水平診斷新生兒MMA的可靠性，但在其他疾病繼發(fā)性酸中毒或慢性病引起維生素B12吸收障礙時(shí)，甲基丙二酸排出量也可能略有增加，而血C3水平和C3/C2通常維持正常水平[11]。因此，對(duì)于甲基丙二酸水平稍有升高的患者，需聯(lián)合血液串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行綜合分析。串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血液中C3和C3/C2對(duì)該病的診斷具有重要意義，有研究結(jié)果證實(shí)，綜合分析血液中C3和C3/C2水平可使診斷的特異性提高至99.903%[12-13]。因此，聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜診斷新生兒MMA診斷效能較高。

綜上所述，C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸櫞酸在新生兒MMA患兒中明顯升高，聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜應(yīng)用具有較高的診斷效能。