王慕華，麻 杰，曹 睿，彭曉光

（山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006）

益生菌是指一類活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且確切的功能性健康益處[1-2]，這與當(dāng)前通用的聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）對(duì)益生菌的定義相近[3]。2010年4月，衛(wèi)生部印發(fā)了初版可食用菌種名單，包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）在內(nèi)的三個(gè)菌屬大類的21種菌種，隨后對(duì)名單進(jìn)行了多次更新及豐富。截止2017年12月，明確可以用于食品的益生菌已有10個(gè)屬共計(jì)35種。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)益生菌菌株90%以上被國(guó)外公司所壟斷，國(guó)內(nèi)主要由江南大學(xué)的陳衛(wèi)院士和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的張和平老師團(tuán)隊(duì)進(jìn)行益生菌篩選，篩選菌株大多通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA測(cè)序、全基因測(cè)序來(lái)進(jìn)行鑒定，選育的益生菌多屬雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[4-5]。作為益生菌必須要滿足兩個(gè)條件，一是能夠在人體胃腸道內(nèi)存活，具有耐酸、耐膽鹽能力，以及分解膽固醇和抗氧化性等重要的益生功能[6]；二是可以高密度培養(yǎng)，收集大量菌體，益生菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)來(lái)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的控制。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性、厭氧或兼性厭氧、最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，常見(jiàn)于乳品、奶油、肉類、發(fā)酵果蔬中，也存在于人的腸道內(nèi)[7]。研究表明，植物乳桿菌（L.plantarum）具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善乳糖不耐受、提高免疫力、降低膽固醇、降低血壓、清除自由基抗氧化等功效[8-11]。于長(zhǎng)青等[12]對(duì)兩株植物乳桿菌進(jìn)行紫外線誘變處理后，得到了2株具有強(qiáng)降膽固醇能力同時(shí)性能較穩(wěn)定的突變菌株，膽固醇的降解率分別為48.7%和44.2%。張鳳敏等[13]從發(fā)酵食品中分離出2株能耐受1 mmol/L過(guò)氧化氫的植物乳桿菌，試驗(yàn)顯示細(xì)胞濃度為109CFU/mL的L1001完整細(xì)胞與無(wú)細(xì)胞提取物的DPPH自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH·）清除率分別為36.2%和37.9%。由于植物乳桿菌（L.plantarum）在調(diào)節(jié)腸道微生物、維護(hù)人體健康方面的影響，其在食品發(fā)酵、乳品工業(yè)、醫(yī)療保健等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[14-15]。本研究為獲得性能優(yōu)良的益生菌生產(chǎn)菌株，通過(guò)乳酸菌的溶鈣圈篩選，耐酸、耐膽鹽檢測(cè)及體外抗氧化和分解膽固醇能力測(cè)試進(jìn)行了菌株的選育；對(duì)篩選菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序及生理生化特性鑒定；采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，并對(duì)發(fā)酵特性研究，實(shí)現(xiàn)菌體高密度發(fā)酵，為其在益生菌產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：分離于山西維爾生物乳制品有限公司生牛乳儲(chǔ)藏罐中。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid polymerase，DNA）聚合酶、T4DNA連接酶、脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、MgCl2、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker、克隆載體pMD18-T、DNA膠回收試劑盒、DMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒：大連Takara公司；牛膽酸鈉（分析純）：北京Solarbio科技有限公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；MRS碳酸鈣培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基中加入20 g/L的碳酸鈣；高膽固醇MRS培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基中加入0.1 g/L的膽固醇及3 g/L的牛膽酸鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺(tái)、YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FE28-standard PH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；MTV-1漩渦振蕩器：杭州奧盛儀器有限公司；H1850R冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Minispin plus高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽：常州諾基儀器有限公司；UV-1500紫外分光光度計(jì)：上海美析儀器有限公司；Masterecycler nexus GX2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)艾本德股份公司；C-32 厭氧培養(yǎng)盒：日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌初篩

從山西維爾生物乳制品有限公司生牛乳儲(chǔ)藏罐中收集殘余牛乳于無(wú)菌三角瓶中，用滅菌生理鹽水將牛乳樣品稀釋至10-5，取原液、10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂布MRS碳酸鈣培養(yǎng)基平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)48 h，挑選溶鈣圈比較大的單菌落，重復(fù)劃線分離，挑選單菌落用200 mL/L甘油管-80 ℃保藏備用[16]。

1.3.2 耐酸菌株篩選

將初篩的菌株按活菌數(shù)2×1010CFU/mL的接種量接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h，6000r/min離心8 min，收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌3次，最后懸浮為108CFU/mL的菌懸液。調(diào)滅菌MRS液體培養(yǎng)基pH值為2.5，取10 mL分裝試管。將調(diào)好菌濃度的菌懸液按1%（V/V）的量加入其中，混勻，37 ℃水浴放置。分別于0、2 h取1 mL用生理鹽水做系列10倍稀釋，取10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂MRS 瓊脂平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株耐酸生長(zhǎng)率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 耐膽鹽菌株篩選

分別配制含有0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L牛膽酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基，將各菌株以活菌數(shù)2×1010CFU/mL的接種量依次接入以上培養(yǎng)基中35 ℃、16 h傳代培養(yǎng)馴化，最后再接入MRS液體培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h，6 000 r/mim離心8 min，收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌3次，最后懸浮為108CFU/mL的菌懸液，取1 mL用生理鹽水做系列10倍稀釋，取10-1、10-3、10-5各0.1 mL涂布含有3.0 g/L牛膽酸鈉和不含牛膽酸鈉的MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株耐膽鹽生長(zhǎng)率，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 抗氧化能力測(cè)試

（1）清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基能力的測(cè)定

分別取1×108CFU/mL、1×109CFU/mL、1×1010CFU/mL的細(xì)胞懸液2 mL，加入1 mL DPPH·溶液（0.2 mmol/L，以無(wú)水乙醇溶解），混合均勻，置于室溫下避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心8 min，取上清，測(cè)定樣品在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值A(chǔ)i，測(cè)3次取平均值。對(duì)照組樣品以等體積蒸餾水代替細(xì)胞懸液，以等體積蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液作參比[17-18]。DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為對(duì)照組吸光度值；Ai為樣品組吸光度值。

（2）清除羥自由基能力的測(cè)定

在10 mL具塞試管中依次加入1 mL FeSO4水溶液（5 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L）、1mL H2O2水溶液（3 mmol/L），混合均勻后向上述體系中加入1×108、1×109、1×1010CFU/mL的細(xì)胞懸液2 mL，用雙蒸水補(bǔ)齊至刻度，37 ℃水浴15 min，6 000 r/min離心8 min，以雙蒸水作參比，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A值，吸光度值數(shù)據(jù)平行測(cè)定3 次[13]。·OH清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為對(duì)照樣品的吸光度值，Ax為加入待測(cè)乳酸菌細(xì)胞懸液的吸光度值。

1.3.5 分解膽固醇能力測(cè)試

挑選菌株經(jīng)MRS培養(yǎng)基活化后，以活菌數(shù)5×1010CFU/mL的接種量接種于高膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液6 000 r/min 離心8 min，取上清液，采用鄰苯二甲醛比色法測(cè)定膽固醇含量[12，19]。膽固醇分解率計(jì)算公式如下：

式中：A0為未接菌對(duì)照的吸光度值，A為菌體培養(yǎng)后培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.6 乳酸菌鑒定

乳酸菌的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)：菌株的生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》，觀察各菌株的形態(tài)特征，并對(duì)菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選菌株進(jìn)行初步的分類鑒定[20]。

公司技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，注重研發(fā)投入，致力于為客戶提供技術(shù)領(lǐng)先的系列化產(chǎn)品。2015年至2017年，公司研發(fā)投入從970.51萬(wàn)元激增至2515.12萬(wàn)元，增幅達(dá)159.15%。2009年以來(lái)，上機(jī)數(shù)控連續(xù)多次被評(píng)為高新技術(shù)企業(yè)，并且擁有市級(jí)企業(yè)技術(shù)中心。公司的研發(fā)能力主要體現(xiàn)在強(qiáng)大的整機(jī)設(shè)計(jì)能力、一流的數(shù)控技術(shù)開(kāi)發(fā)能力、先進(jìn)的核心精密部件制造技術(shù)和豐富的新品研發(fā)經(jīng)驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：使用OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)培養(yǎng)菌株進(jìn)行DNA提取，使用細(xì)菌16S rRNA通用引物F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），純化后的PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，質(zhì)粒提取后由金唯智公司進(jìn)行DNA序列的測(cè)定。將測(cè)得的DNA序列提交到GenBank美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進(jìn)行基本局部比對(duì)，搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序?qū)π蛄羞M(jìn)行聚類、應(yīng)用Mega軟件做基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.7 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

以MRS培養(yǎng)基為種子液，在MRS培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，以磷酸氫二鉀（A），檸檬酸氫二胺（B），乙酸鈉（C），葡萄糖（D）添加量作為影響因素，在MRS原有添加量的基礎(chǔ)上，上下浮動(dòng)設(shè)定不同的水平，以生物量（OD600nm值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，20 mL/L接種量，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方[21]。

1.3.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

以MRS培養(yǎng)基為種子液，以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵液，以接種量（E）、發(fā)酵溫度（F）、起始pH值（G）、溶氧量（H）作為影響因素，在植物乳桿菌常規(guī)培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，上下浮動(dòng)設(shè)定不同的水平，以生物量（OD600nm值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初篩

使用MRS碳酸鈣培養(yǎng)基，從生牛乳儲(chǔ)罐殘余牛乳中分離出88株乳酸菌，編號(hào)為SX1～SX88，其中溶鈣圈較大的乳酸菌菌株，純化后用20%的甘油管保存，進(jìn)行下一步的篩選，部分菌株的溶鈣圈情況見(jiàn)圖1。

圖1 篩選乳酸菌的溶鈣圈Fig.1 Calcium dissolving circle of screened lactic acid bacteria

2.2 耐酸菌株篩選

作為益生菌菌株，要能夠耐胃酸，才能進(jìn)一步到達(dá)腸道起到益生作用，通常胃液pH值為1.3～1.8，飯后由于食物中和、稀釋，胃內(nèi)pH值會(huì)達(dá)到3.5，因此通過(guò)耐酸實(shí)驗(yàn)，篩選耐酸菌株。88株菌中，在pH 2.5的培養(yǎng)液中處理2 h，稀釋到10-5仍可在MRS 瓊脂平板生長(zhǎng)的菌株共12株，其耐酸生長(zhǎng)率見(jiàn)表1。

表1 篩選菌株的耐酸生長(zhǎng)率Table 1 Acid resistant growth rate of screened strains

由表1可知，篩選到的12株產(chǎn)酸菌株耐酸生長(zhǎng)率都在30%以上，其中菌株SX36、SX44、SX68、SX80的耐酸生長(zhǎng)率最高，為58.72%～66%.20。因此，選擇耐酸比較好的4株菌SX36、SX44、SX68、SX80進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.3 耐膽鹽菌株篩選

對(duì)其中耐酸比較好的4株菌SX36、SX44、SX68、SX80進(jìn)行耐膽鹽篩選，4株菌的耐膽鹽生長(zhǎng)率見(jiàn)表2。由表2可知，菌株SX36的耐膽鹽生長(zhǎng)率為20.56%，菌株SX44、SX68、SX80的耐膽鹽生長(zhǎng)率在37.85%～48.72%。因此，選擇耐膽鹽比較好的3株菌SSX44、SX68、SX80進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

表2 篩選菌株的耐膽鹽生長(zhǎng)率Table 2 Bile salt tolerance growth rate of screened strains

2.4 抗氧化能力測(cè)定

對(duì)其中耐酸、耐膽鹽比較好的3株菌SX44、SX68、SX80進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定，3株菌的抗氧化能力見(jiàn)圖2。

圖2 篩選菌株對(duì)DPPH·（A）及·OH（B）的清除率Fig.2 Scavenging rates of screened strains on DPPH·(A) and·OH (B)

由圖2可知，3株菌在菌體濃度達(dá)到1010CFU/mL的情況下，DPPH·清除率可以達(dá)到32.7%以上，·OH清除率可以達(dá)到73.8%以上，其中菌株SX68的DPPH·清除率為41.3%，·OH清除率為83.0%。提高菌體濃度，DPPH·和·OH的清除率有可能會(huì)再提高，考慮到實(shí)際應(yīng)用中菌體在體內(nèi)濃度，確定以1010CFU/mL菌體濃度下菌株SX68的抗氧化能力最強(qiáng)。

2.5 分解膽固醇能力測(cè)定

對(duì)其中耐酸、耐膽鹽比較好的3株菌SX44、SX68、SX80進(jìn)行分解膽固醇能力測(cè)定，3株菌的分解膽固醇能力見(jiàn)圖3。

由圖3可知，菌株SX68的膽固醇分解能力最強(qiáng)，可以達(dá)到45.7%，菌株為初篩獲得，如經(jīng)過(guò)菌株馴化和誘變選育，分解膽固醇能力可能會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。綜合上述試驗(yàn)對(duì)篩選到的SX68菌株進(jìn)行菌種鑒定。

圖3 篩選菌株的膽固醇分解率Fig.3 Cholesterol decomposition rate of screened strains

2.6 菌株SX68的鑒定

2.6.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株SX68的菌落及菌體形態(tài)見(jiàn)圖4。由圖4a可知，菌株SX68的菌落直徑約1～3 mm左右，凸起，呈圓形，表面光滑，細(xì)密，白色。由圖4b可知，菌株SX68的菌體形態(tài)呈短桿狀、成短鏈，革蘭氏染色為陽(yáng)性，無(wú)芽孢，產(chǎn)酸，兼性厭氧。從菌落及細(xì)胞形態(tài)初步判斷菌株SX68為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

圖4 菌株SX68的菌落（a）及菌體（b）形態(tài)Fig.4 Colony (a) and cell (b) morphology of strain SX68

2.6.2 生理生化特性

由表3可知，菌株SX68過(guò)氧化氫酶、氧化酶、淀粉水解、明膠液化試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，以及甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了菌株SX68為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

表3 菌株SX68的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain SX68

2.6.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株SX68的16S rRNA基因測(cè)序后在GenBank（NCBI）的16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，序列相似性在98.65%以上的菌株有6株，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表4。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST工具尋找相似菌株，并通過(guò)BLAST程序?qū)π蛄羞M(jìn)行聚類、應(yīng)用Mega軟件做基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖5。

表4 菌株SX68的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果Table 4 16S rRNA gene sequence alignment results of strain SX68

圖5 菌株SX68基于16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain SX68 based on 16S rRNA gene sequence

由表4可知，菌株SX68 與Lactobacillus plantarum模式株JCM 1149序列相似性99.58%，親緣關(guān)系密切。由圖5可知，菌株SX68屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes），和植物乳桿菌Zhang-LL、9714等親緣關(guān)系密切，親緣距離差異在0.000 4以內(nèi)。結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA 基因序列分析，將菌株SX68鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.7 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

在MRS培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，以生物量（OD600nm值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以磷酸氫二鉀（A），檸檬酸氫二胺（B），乙酸鈉（C），葡萄糖（D）添加量為影響因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定菌株SX68的發(fā)酵液配方，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，不同因素對(duì)菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為：磷酸氫二鉀＞葡萄糖＞檸檬酸氫二胺＞蛋白胨，其最佳添加量為磷酸氫二鉀3.0 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，蛋白胨10 g/L。確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方組合為A2B2C2D2，即最佳添加量為磷酸氫二鉀3.0 g/L，葡萄糖30 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，蛋白胨10 g/L。培養(yǎng)基組成為蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO43 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，吐溫80 1 mL/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4。用此培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，最高OD600nm值可達(dá)14.13，平板活菌計(jì)數(shù)，活菌量可達(dá)1.5×1012CFU/mL。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

2.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

在10 L發(fā)酵罐單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以生物量（OD600nm值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以接種量（E）、發(fā)酵溫度（F）、起始pH值（G）、溶氧量（H）作為影響因素，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表6。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

由表6可知，不同因素對(duì)菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為：起始pH值＞發(fā)酵溫度＞接種量＞溶氧量，其最佳發(fā)酵條件組合為E2F2G2H1，即起始pH值6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，最高OD600nm值可達(dá)15.68，活菌數(shù)可達(dá)9.6×1012CFU/mL。

3 結(jié)論

本研究篩選到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SX68，pH 2.5條件下處理2 h耐酸生長(zhǎng)率可達(dá)60.27%，耐3 g/L膽鹽生長(zhǎng)率可達(dá)48.72%；在菌體濃度達(dá)到1010CFU/mL的情況下，DPPH·清除率可達(dá)41.3%，羥自由基清除率可達(dá)83.0%，膽固醇分解能力可達(dá)45.7%。具有很好的耐酸、耐膽鹽脅迫能力和較強(qiáng)的抗氧化、分解膽固醇益生功效。

菌株SX68優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4；優(yōu)化發(fā)酵條件為：起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量＜100 mL/L，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。此優(yōu)化條件下，最高發(fā)酵生物量（OD600nm值）可達(dá)15.68，活菌數(shù)可達(dá)9.6×1012CFU/mL，較文獻(xiàn)報(bào)道的109CFU/mL提高了1 000倍[24-26]，較王秋萍[27]報(bào)道的1.92×1012CFU/mL提高了5倍。本研究為菌株SX68用于益生菌生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。