張陽(yáng)陽(yáng)，侯賀麗，王榮榮，李建芳，郝晨暉

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

桂花是信陽(yáng)市的市花，含有多種重要的生物活性物質(zhì)，其中黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)等活性物質(zhì)含量很高，且對(duì)人體內(nèi)各種自由基有一定抑制作用[1-4]。桂花酒歷史悠久，古人認(rèn)為桂為百藥之長(zhǎng)，用桂花來(lái)釀酒可以達(dá)到“飲之壽千歲”的功效，該酒香甜醇厚，有開(kāi)胃醒神、健脾補(bǔ)虛的功效[5-7]。桂花酒對(duì)女士特別適用，被贊譽(yù)為“婦女幸福酒”[8]。目前對(duì)于桂花酒的研究主要集中在浸提制取工藝、香氣成分分析與抗氧化研究等方面，如黃夢(mèng)明等[9]對(duì)新型桂花酒的浸提工藝進(jìn)行研究及抗氧化評(píng)價(jià)，結(jié)果表明浸提工藝生產(chǎn)的新型桂花酒，總黃酮提取率可達(dá)到91.34%，并具有較強(qiáng)的抗氧化能力；楊淇等[10]研究了桂花酒的制備與其香氣成分分析，結(jié)果表明以浸泡法制備的桂花酒，香氣成分檢測(cè)出24種可揮發(fā)性成分，香氣濃郁，但在發(fā)酵桂花酒方面研究較少。

因此本試驗(yàn)以信陽(yáng)本地的大米和桂花為原料，以黃酒發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)制作桂花酒并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬開(kāi)發(fā)一種新型發(fā)酵型桂花酒。首先利用植物乳桿菌（Lactobacil-lus plantarum）對(duì)大米進(jìn)行酸化，其次以安琪酵母和麥曲共同發(fā)酵消除生物胺對(duì)酒口感和飲后舒適度的不良影響，以期提高酯類(lèi)物質(zhì)使酒更加綿柔，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：信陽(yáng)香絲苗米；桂花：信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院校園桂花自采自曬；安琪耐高糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌凍干粉（食品級(jí)）：鄭州百益生物技術(shù)有限公司；麥曲：老河口市任家米酒黃酒加工廠；無(wú)水乙醇（體積分?jǐn)?shù)98%）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；冰乙酸（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-80L-Ⅲ立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)：上海分析儀器制造有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SPX-150-BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桂花酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

大米預(yù)處理：選取優(yōu)良大米，清洗后置于容器中，加入植物乳桿菌于培養(yǎng)箱中進(jìn)行生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發(fā)酵[14-17]。

植物乳桿菌按0.1%（以干米500 g為基準(zhǔn)）添加，在18 ℃培養(yǎng)至pH值達(dá)4.2左右停止，確定浸米時(shí)間，以縮短傳統(tǒng)浸泡浸米時(shí)間。

蒸飯：處理后的大米淘洗干凈放到鍋中蒸70～90 min，蒸至無(wú)夾心、不沾粘、顆粒（較）松散。

淋飯、冷卻：用預(yù)先準(zhǔn)備好的冷卻水少量多次對(duì)其進(jìn)行降溫，冷卻至30 ℃左右。

糖漬桂花：干桂花放入質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的鹽水中浸泡5 min，然后控干水分。再大火蒸10 min。將等質(zhì)量的冰糖（食品級(jí)）加適量的水熬制成糖漿，將桂花倒入進(jìn)行翻拌。冷卻后裝罐并用蜂蜜封頂，放入冰箱冷藏7 d后使用。

接種：麥曲粉碎，將干米質(zhì)量2%～6%的麥曲及0.2%的酵母菌一同拌入米中，搭窩后，在其表面撒入2%～6%糖漬桂花[8，13，18]。

前發(fā)酵：糖化24 h后進(jìn)行翻拌，72 h后加入50%干米質(zhì)量的冷卻水，發(fā)酵結(jié)束的前24 h加入40%干米質(zhì)量的冷卻水，開(kāi)始密封產(chǎn)醇，12 h后再加入40%干米質(zhì)量的冷卻水，共計(jì)加入130%干米質(zhì)量的冷卻水[8]，然后進(jìn)行過(guò)濾。

后發(fā)酵：撒入少量2%糖漬桂花，以增加酒中桂花的色、香、味，然后轉(zhuǎn)入18 ℃條件下發(fā)酵72 h[15]。

壓榨：用四層紗布過(guò)濾出酒體，裝入滅菌玻璃罐中。

澄清：將盛有酒的玻璃罐密封保存，并置于陰涼干燥處放置24 h。

煎酒：將盛有酒的玻璃罐用保鮮膜密封好，放入水浴鍋中加熱至90 ℃，并保溫20 min，即得桂花酒成品。

1.3.2 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以干米500 g為基準(zhǔn)，固定酵母添加量0.2%，以感官評(píng)價(jià)和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在麥曲添加量為0.4%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h條件下考察糖漬桂花添加量（2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發(fā)酵時(shí)間192 h條件下考察發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發(fā)酵溫度25 ℃，探究發(fā)酵時(shí)間（144 h、168 h、192 h、216 h、240 h）對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量為4%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h，探究麥曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對(duì)桂花酒品質(zhì)影響。

1.3.3 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Box-Behnken中心原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以糖漬桂花添加量（A）、麥曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為4個(gè)因素，桂花酒酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)考察各因素交互作用對(duì)桂花酒酒精度和感官評(píng)分的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

1.3.4 測(cè)定方法

pH值：pH計(jì)測(cè)定；還原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》中直接滴定法測(cè)定[19]；酒精度：按照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中酒精計(jì)法測(cè)定[20]；總酸：按照GB 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》中酸堿指示劑滴定法[21]。

感官評(píng)定：邀請(qǐng)10位具有食品專(zhuān)業(yè)背景人員，參照GB/T 27588—2011《露酒》的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)酵桂花酒進(jìn)行感官評(píng)分（總分100分），取10人的平均分[22]，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 桂花酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory score criteria of Osmanthus fragrans wine

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌干預(yù)對(duì)浸米時(shí)間的影響

浸米是黃酒制作的前端工藝，將此程序應(yīng)用于桂花酒中，加快了大米的酸化過(guò)程，使大米膨脹，蒸煮縮短了工藝時(shí)間，而且降低桂花酒中的生物胺含量，提高飲后舒適感[17]。在浸泡大米的過(guò)程中，添加植物乳桿菌，其菌種快速繁殖以達(dá)到生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發(fā)酵[18]。由圖1可知，在18 ℃條件下，當(dāng)浸米時(shí)間60 h時(shí)漿水pH值接近4.2。因此，確定浸米的最佳時(shí)間是60 h。

圖1 植物乳桿菌干預(yù)對(duì)浸米時(shí)間的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum intervention on rice soaking time

2.2 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 糖漬桂花添加量對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，桂花酒酒精度、感官評(píng)分隨糖漬桂花添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，糖漬桂花添加量為4%時(shí)桂花酒酒精度最高，為13.8% vol，此時(shí)感官評(píng)分為73.1分；糖漬桂花添加量為5%時(shí)桂花酒感官評(píng)分最高，為75.1分，此時(shí)酒精度為12.9% vol。當(dāng)糖漬桂花添加量＜4%時(shí)，可發(fā)酵糖量減少，桂花酒的酒精度和感官評(píng)分均較低；當(dāng)添加量＞4%時(shí)，可發(fā)酵糖量較多，酵母菌營(yíng)養(yǎng)豐富迅速生長(zhǎng)同時(shí)也快速衰亡[23]，致使酒精度和感官評(píng)分較低。因此，確定糖漬桂花添加量4%為最佳添加量。

2.2.2 麥曲添加量對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，桂花酒酒精度和感官評(píng)分隨著麥曲添加量的增加呈先升高后又略降低的趨勢(shì)。在麥曲添加量為0.4%時(shí)桂花酒感官評(píng)分、酒精度均最高，分別為74.9分、13.7% vol。當(dāng)麥曲添加量＜0.4%時(shí)，麥曲添加較少易被雜菌污染而發(fā)生變質(zhì)，當(dāng)添加量＞0.4%時(shí)，麥曲中的根霉菌快速生長(zhǎng)而發(fā)生衰亡，使酒的苦味較明顯[24]。因此，確定麥曲添加量0.4%為最佳添加量。

圖3 麥曲添加量對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of wheat malt addition on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，桂花酒酒精度和感官評(píng)分隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后又略降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)桂花酒感官評(píng)分、酒精度均最高，分別為77.5分、14.8% vol。當(dāng)發(fā)酵溫度低于30 ℃時(shí)，發(fā)酵進(jìn)行緩慢，且易被雜菌污染、滋味不協(xié)調(diào)；當(dāng)發(fā)酵溫度高于30 ℃時(shí)，高溫致使麥曲（中高溫曲）中的根霉菌和毛霉菌易成為優(yōu)勢(shì)菌，要及時(shí)進(jìn)行攪拌、散溫，否則會(huì)發(fā)酵失敗[25]。因此，確定發(fā)酵溫度30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of O.fragrans wine

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響

由圖5可知，桂花酒酒精度和感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后又略降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵時(shí)間為192 h時(shí)桂花酒感官評(píng)分、酒精度均最高，分別為76.4分、14.7% vol，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＜192 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，發(fā)酵不充分、酒香不明顯、顏色淺黃渾濁暗淡；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞192 h后，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酒精開(kāi)始部分轉(zhuǎn)化為其他醇類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸等，使酒精度降低[26]，影響口感。因此，確定發(fā)酵時(shí)間192 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桂花酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.3 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3、表4可知，Y2模型中各因素交互作用均不顯著，因此只對(duì)酒精度（Y1）進(jìn)行分析。4個(gè)因素經(jīng)過(guò)擬合后得酒精度（Y1）的二次多元回歸方程為：Y1=15.48+0.50A+0.29B+0.19C+0.32D+0.025AB-0.100AC+0.33AD+0.37BC-0.13BD+0.20CD-0.69A2-0.38B2-0.65C2-0.84D2。由表5可知，Y1的回歸方程模型顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P=0.076 6＞0.05不顯著，表示模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好；決定系數(shù)R2=0.993 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9863，表明酒精度的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的擬合度較高[27-28]。4個(gè)因素對(duì)酒精度的影響順序：糖漬桂花添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞麥曲添加量＞發(fā)酵溫度。從分析中還可以看出，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AD、BC、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC和BD對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

表3 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode

2.4 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，得出糖漬桂花添加量、麥曲添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)桂花酒酒精度影響的響應(yīng)曲面和等高線，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，等高線呈橢圓形，說(shuō)明糖漬桂花添加量和發(fā)酵溫度、糖漬桂花添加量和發(fā)酵時(shí)間、麥曲添加量和發(fā)酵溫度、麥曲添加量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間存在交互作用，與表4方差分析結(jié)果一致。

由圖6可知，隨著A（糖漬桂花添加量）和C（發(fā)酵溫度）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，A對(duì)應(yīng)的曲面坡度相較于C的陡峭，即A對(duì)酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示A和C交互作用顯著；隨著A（糖漬桂花添加量）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，A對(duì)應(yīng)的曲面坡度相較于D的陡峭，即A對(duì)酒精度的影響程度大于D，等高線呈橢圓形，表示糖漬A和D交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B(niǎo)（麥曲添加量）和C（發(fā)酵溫度）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，C對(duì)應(yīng)的曲面坡度相較于B的陡峭，即C對(duì)酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和C交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B(niǎo)（麥曲添加量）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，D對(duì)應(yīng)的曲面坡度相較于B的陡峭，即D對(duì)酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和D交互作用顯著（P＜0.05）；隨著C（發(fā)酵溫度）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，D對(duì)應(yīng)的曲面坡度相較于C的陡峭，即D對(duì)酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示C和D交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖6 各因素交互作用對(duì)桂花酒酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on alcohol content of Osmanthus fragrans wine

最終得到最優(yōu)工藝參數(shù)：生酸過(guò)程為植物乳桿菌添加量0.1%，18 ℃條件下發(fā)酵60 h；發(fā)酵過(guò)程為糖漬桂花添加量5%，麥曲添加量0.3%，固定酵母添加量0.2%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h。

2.5 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型具有可行性，用得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到桂花酒酒精度為14.61% vol，感官評(píng)分達(dá)到81.9分。酒精度與預(yù)測(cè)值（14.50% vol）相對(duì)誤差為0.007 8，模型不顯著（P＞0.05），模型驗(yàn)證成功，桂花酒品質(zhì)工藝優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。最后測(cè)得成品桂花酒糖度（以葡萄糖計(jì)）為23 g/L，酸度（以乳酸計(jì)）為3.6 g/L，口感清爽，酒體金黃透亮。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)得出的桂花酒最佳工藝，即選擇自制優(yōu)質(zhì)干桂花，先制作成糖漬桂花，添加0.1%植物乳桿菌，大米進(jìn)行酸化，添加0.2%酵母、5%糖漬桂花、0.3%麥曲，在30 ℃發(fā)酵192 h，然后過(guò)濾，即可得到感官評(píng)分81.9分，酒精度為14.61% vol，糖度為23 g/L（以葡萄糖計(jì)），酸度3.6 g/L（以乳酸計(jì)）的桂花酒。桂花酒有著濃郁的桂花香氣，諸香和諧純正，口感清爽，酒體呈金黃透亮。

傳統(tǒng)黃酒生產(chǎn)工藝，在發(fā)酵前期加入了新鮮桂花，使得酒精度介于12% vol～13% vol，糖度（以葡萄糖計(jì)）45～50 g/L，總酸（以乳酸計(jì)）4.5～6.5 g/L。本試驗(yàn)的結(jié)果中酒精度較高，糖度較低，酸度較低，口感清爽，酒液清亮，如何將酒精度降低至12% vol～13% vol、提升殘?zhí)沁€有待進(jìn)一步研究，在積極改善桂花酒的口感的同時(shí)且不失營(yíng)養(yǎng)功效，在降低成本的同時(shí)提高附加值，為桂花酒的研究提供了一定的基礎(chǔ)，且有益于本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展。