劉小改，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

中國白酒的特點為制曲釀酒，自古就有“曲乃酒之骨”之說[1]。中國白酒制曲歷史十分悠久，《書經(jīng)·說命篇》記載：“若作酒醴，爾惟曲蘗”，曲蘗即是我國最原始的酒曲，可以說是酒曲的起源，大曲是重要的微生物群落載體，綜合物系、酶系、菌系于一體[2-3]。清香型大曲根據(jù)其生產(chǎn)工藝可定義為中低溫大曲，其中包含霉菌、酵母菌、細菌等各類微生物，在白酒釀造過程中起糖化、發(fā)酵、酯化等作用[4-5]。其中，清香型大曲的酯化作用體現(xiàn)在大曲中酯化酶在白酒釀造過程中催化各種有機酸與乙醇結(jié)合、脫水生成相應的酯類化合物[6]，酯類物質(zhì)在清香型白酒中具有增加白酒香氣、柔和度、醇厚度等作用，是影響白酒品質(zhì)的重要因素，因此，大曲的酯化力水平即成為判斷大曲質(zhì)量的重要指標之一[7-8]。

沈才洪等[9]經(jīng)實驗研究認為，大曲酯化力是指制曲過程中大曲微生物所代謝的酯化酶催化酸醇合成乙酯類物質(zhì)的能力，其中曲塊曲心部位表現(xiàn)出酯化力顯著大于曲皮部位。湯有宏等[10]根據(jù)酯化酶特性從酯化溫度、酯化時間、加曲量、底物濃度角度研究并確定了測定濃香型大曲酯化力的最佳條件。倪雪[11]分別用總酯法和色譜分析法對鳳香型大曲酯化力進行測定，經(jīng)過反復實驗，最終確定了數(shù)據(jù)準確、操作簡易、適合鳳香型大曲酯化力的檢測方法。

輕工行業(yè)標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中規(guī)定，在規(guī)定的試驗條件下，大曲中酯化酶催化游離有機酸與乙醇合成酯，再用皂化法測定所生成的總酯（以己酸乙酯計），表示其酯化力[12]。該標準分析方法中以己酸與乙醇為主要反應試劑，進行酯化反應，并最終測定總酯（以己酸乙酯計）含量。而清香型白酒中酯類化合物以乙酸乙酯為主，己酸乙酯反而成為清香型白酒中的“雜質(zhì)”成分，是不允許出現(xiàn)的[13-14]。清香型大曲中的酯化酶主要為催化合成乙酸乙酯的酶類[15]。根據(jù)前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，大曲中催化合成己酸乙酯的酯化酶與催化合成乙酸乙酯的酯化酶通常并非同一種酶類。因此清香型大曲酯化力的測定，應以其中的酶類催化合成乙酸乙酯的能力進行衡量更為準確。

本研究以清香型大曲為催化劑，以乙酸、乙醇為主要反應試劑，對影響酯化反應的不同條件進行試驗、分析，并最終確定了適合清香型大曲酯化力測定的最優(yōu)方法。酯化力是衡量清香型釀酒大曲質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵性指標之一，研究并確定適宜清香型大曲的酯化力測定方法具有十分重要的現(xiàn)實意義，該方法的確定能夠更好的應用于生產(chǎn)實踐，更為準確的對大曲質(zhì)量做出判定，能夠指導大曲生產(chǎn)的順利進行，從而對清香型白酒生產(chǎn)具有積極的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型白酒大曲HX-1：北京紅星股份有限公司；不同批次清香型白酒大曲L-1、L-2：山西蘭花青酒業(yè)有限公司；不同批次清香型白酒大曲Z-1、Z-2：山西宗酒酒業(yè)有限公司。

乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LA230S電子天平：德國賽多利斯公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9245A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Q10A電陶爐：廣東新功電器有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大曲酯化力測定方法

制備酯化樣品：于250 mL錐形瓶中加入25.0 mL無水乙醇，再加入75 mL蒸餾水，稍微振蕩后，再分別加入不同體積乙酸，充分混勻。再稱取相當于絕干HX-1大曲樣品質(zhì)量25.00 g，精確至0.01 g，加入錐形瓶中，搖勻后用塞子塞上，置于不同溫度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保溫酯化。同時以不添加大曲樣品酯化反應液作為空白對照試驗。

其他操作及結(jié)果計算均按照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》規(guī)定方法[12]執(zhí)行。酯化力單位定義：每50 g大曲在一定溫度下，經(jīng)過一定時間催化有機酸和乙醇合成有機酸乙酯的毫克數(shù)為一個單位，符號為U，以mg/50 g表示。

1.3.2 測定條件優(yōu)化單因素試驗

分別向100 mL酯化反應體系中加入不同體積（0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL）乙酸，將錐形瓶置于不同溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃）恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，保溫酯化不同時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d），酯化反應結(jié)束后，測定并計算大曲試樣的酯化力。

1.3.3 測定條件優(yōu)化正交試驗

以乙酸添加量、反應溫度、反應時間為評價因素，以酯化力為評價指標，對酯化反應條件采用L9（34）正交試驗進行優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。

表1 測定條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for determination conditions optimization

1.3.4 方法精密度考察

取同一大曲粉樣品充分混合均勻后，均分為6份，分別按照優(yōu)化后實驗方法檢測各份樣品的酯化力，計算結(jié)果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗操作均重復3次，進行正交試驗及方差分析，確定數(shù)據(jù)差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同底物添加量對測定結(jié)果的影響

分別向100 mL酯化反應體系中加入不同體積乙酸，將錐形瓶置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，保溫酯化7 d，測定并計算大曲試樣的酯化力，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乙酸添加量對測定結(jié)果的影響Fig.1 Effect of different acetic acid addition on detection result

由圖1可知，當乙酸添加量由0.6 mL/100 mL增加至0.8 mL/100 mL時，所測得大曲酯化力升高，繼續(xù)增加乙酸添加量，則酯化力無明顯升高跡象。向100 mL反應體系中加入乙酸量為0.6 mL/100 mL時，測得大曲酯化力結(jié)果明顯低于其他，分析原因為反應體系中乙酸量不足導致，當增加乙酸添加量至0.8～1.5 mL/100 mL時，酯化力測定結(jié)果相差較小，說明反應體系中底物已充足，可滿足酯化反應充分進行。因此，確定最佳乙酸添加量為0.8～1.2 mL/100 mL。

2.2 不同反應溫度對測定結(jié)果的影響

向100 mL酯化反應體系中加入1.2 mL乙酸，分別將錐形瓶置于不同溫度條件下，保溫酯化7 d，測定并計算大曲試樣的酯化力，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著反應溫度升高，所測得大曲酯化力隨之升高，當反應溫度高于32 ℃時，繼續(xù)升高反應溫度，所測酯化力反而逐漸降低。酯化反應溫度為28 ℃時所測大曲酯化力略低，而35 ℃以上反應溫度測得大曲酯化力更低，說明酯化反應溫度過高、過低均不利于清香型大曲中酯化酶催化合成乙酸乙酯，溫度過低時酯化反應進行緩慢，溫度過高則易導致酯化酶活力降低，甚至失活。30 ℃與32 ℃條件下測得大曲酯化力結(jié)果較高，大曲中酯化酶充分發(fā)揮作用。因此，確定30 ℃為酯化酶最適催化溫度。

圖2 不同酯化溫度對測定結(jié)果的影響Fig.2 Effect of different esterification temperature on detection result

2.3 不同反應時間對測定結(jié)果的影響

向100 mL酯化反應體系中加入1.2 mL乙酸，將錐形瓶置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，分別保溫酯化不同時間，測定并計算大曲試樣的酯化力，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酯化時間對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of different esterification time on detection result

由圖3可知，酯化反應初始，隨著反應時間在4～6 d范圍內(nèi)延長，大曲酯化力增加，當反應時間至6 d時，酯化反應得以充分進行，酯化力達到最高，繼續(xù)延長反應時間，所測得大曲酯化力降低。據(jù)相關(guān)研究表明，酯化過程存在可逆性，酯化酶既可以催化酯類的合成，也可以分解已經(jīng)形成的酯類物質(zhì)[16]，故酯化反應時間并非越長越好，應在酯類合成量達到最高時及時終止反應，避免由于酯類分解導致測量誤差。因此，選擇6 d為最佳酯化反應時間。

2.4 正交試驗分析

為得出最優(yōu)試驗條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上對乙酸添加量、反應溫度、反應時間進行正交試驗分析，正交試驗結(jié)果及分析見表2。

表2 測定條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for determination conditions optimization

根據(jù)極差分析結(jié)果可知，清香型大曲酯化最佳測定反應條件組合為A1B2C2，即向100 mL反應體系中加入0.8 mL分析純乙酸，將錐形瓶置于30 ℃條件下保溫酯化6 d。根據(jù)方差分析（表3）可知，反應時間對酯化力測定具有顯著影響（P＜0.05），而乙酸添加量及反應溫度對酯化力影響不顯著。

表3 測定條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiments results for determination conditions optimization

以最佳測定條件進行驗證試驗，測得清香型大曲酯化力為898 U。本方法優(yōu)化后的酯化反應體系為酯化過程提供充足的反應底物、最適宜酯化溫度及酯化時間，酯化反應足夠徹底，所測定大曲酯化力達到試驗中最高水平。

2.5 方法精密度考察

取同一大曲粉樣品充分混合均勻后，均分為6份，分別按照優(yōu)化后實驗方法檢測各份樣品的酯化力，檢測結(jié)果并計算相對標準偏差（RSD），結(jié)果如表4所示。

表4 酯化力檢測方法的相對標準偏差Table 4 Relative standard deviation of the determination method for the esterification ability

經(jīng)測定，本試驗方法的相對標準偏差為3.1%，符合標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》要求（不超過10%）。

2.6 清香型大曲酯化力分析

應用以上酯化力檢測方法對不同來源的清香型大曲進行檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 不同清香型大曲酯化力檢測結(jié)果Fig.4 Esterification determination results of different light-flavor Baijiu Daqu

由圖4可知，紅星二鍋頭清香型大曲酯化力為898 U，與不同來源大曲酯化力差異明顯，主要原因為制曲工藝不同導致大曲酯化力不同。

大曲酯化力與制曲工藝及制曲環(huán)境因素密切相關(guān)，根據(jù)清香型大曲制曲工藝不同，可分為清茬曲、紅心曲和后火曲[18-19]。三種大曲曲坯相同，主要差異為制曲過程工藝條件控制不同[20]。其中，后火曲在潮火期、干火期、后火期等各個階段曲塊溫度均高于清茬曲；而紅心曲在整個制曲培養(yǎng)過程中持續(xù)保持曲塊品溫上升，升溫時間長，降溫幅度小[21-22]。清香型大曲培養(yǎng)過程的實質(zhì)即是通過對培養(yǎng)環(huán)境溫度、氧氣、水分的調(diào)節(jié)控制從而達到對大曲塊中微生物種類及數(shù)量的選擇。在培養(yǎng)過程中，擴大大曲中有益微生物的種群、數(shù)量，淘汰不利微生物，使曲塊更有利于白酒釀造過程的進行[23-24]。

經(jīng)相關(guān)研究表明，清茬曲酯化力水平較高，明顯高于紅心曲和后火曲[25]。主要原因為不同制曲環(huán)境與制曲工藝導致大曲中微生物菌群組成結(jié)構(gòu)存在較大差異性，清茬曲中含有豐富的酵母菌屬、霉菌屬等產(chǎn)酯化酶類微生物，更有利于提高大曲整體酯化力水平[26-27]。

3 結(jié)論

本研究依據(jù)標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中規(guī)定的大曲檢測方法，根據(jù)清香型大曲的特殊性質(zhì)，通過實驗進一步對清香型大曲酯化力測定過程中酯化反應底物及酯化反應條件做出了分析優(yōu)化。最終確定以乙酸代替標準中規(guī)定的己酸，乙酸添加量為0.8 mL/100 mL，酯化反應溫度為30 ℃，酯化反應時間為6 d。在此反應條件下可使清香型大曲中的酯化酶充分發(fā)揮催化作用，得出更為接近真實值的酯化力結(jié)果。

經(jīng)過近兩年的檢測應用實踐，應用本方法測定的清香型大曲酯化力，能更為科學、客觀的反映出清香型大曲中酯化酶催化合成乙酸乙酯的能力，為進一步研究清香型大曲提供了可行途徑，對清香型白酒質(zhì)量控制及提升具有重要意義。