白慧慧，任海偉*，任雨薇，唐多利，彭軼楠，王治業(yè)，李志忠

（1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省科學院 生物研究所 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730099）

明膠是一種高分子蛋白質生物材料，因其具有良好的成膜性、側基的高化學反應活性、生物相容性、膠凝態(tài)和溶膠態(tài)的可逆轉變性以及無毒等優(yōu)良特性，在感光材料、食品、醫(yī)藥、化妝品、造紙、防腐抗蝕、化工等行業(yè)廣泛使用[1]。明膠生產(chǎn)過程中耗水量高達1 500～2 000 t/t明膠[2]，廢水產(chǎn)量龐大，若直接排放將會造成嚴重的水體和土壤環(huán)境污染[3]。另一方面，因明膠生產(chǎn)原料多采用牛骨等動物廢棄物，生產(chǎn)過程中又有石灰水中和等步驟，使廢水中的Ca2+濃度相對較高[4]；較高濃度Ca2+對細胞有一定毒性，污泥上的鈣沉淀會降低微生物的生物活性，導致污水生物處理的效率下降；而且明膠廢水中Ca2+會與碳酸根離子結合生成碳酸鈣，導致次生廢物剩余污泥排放量巨大，占到污水處理量的0.4%[5]。如何有效避免高濃度Ca2+引起的污水處理困擾，是明膠加工企業(yè)面臨的難題之一[6]。若能將明膠廢水中的Ca2+通過特定的微生物菌株進行富集吸附，則既可降低污水中Ca2+濃度，還可以生成高鈣微生物進行深度利用。

目前MATHIVANAN K等[7]研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸芽胞桿菌（Lysinibacillus）作為生物吸附劑對Pb（II）的生物吸附能力和去除效率分別為43.25 mg/g和86.5%；李倩等[8]從活性污泥中篩選得到耐鎘菌株，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），得到最大鉛離子耐受質量濃度為350 mg/L，吸附量為205 mg/g。鄒水林[9]篩選得到一株對銅離子有強耐受能力和吸附性能的菌株Citrobactersp.，該菌株對銅離子的最小抑制濃度可達400 mg/L。周防震等[10]從富硒土壤中篩選出枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），當Na2SeO3溶液質量濃度20 μg/mL，加硒時間5 h，培養(yǎng)溫度37 ℃，富硒率為58.3%。曹禮等[11]篩選出耐鋅菌株HXZ-1，當鋅離子質量濃度為50 mg/L、培養(yǎng)時間為10 h時，最大吸附量為29.1%。但是，有關耐鈣菌株的分離和鑒定鮮有報道。

本研究從明膠加工廢水中篩選出有一定耐鈣能力的微生物菌株N3-1，利用形態(tài)學觀察、生理生化試驗及16S rRNA序列分析法等方法對其進行鑒定，對其生長特性進行研究，并通過單因素試驗、Box-Behnken 試驗設計優(yōu)化菌株N3-1的培養(yǎng)條件，以期為高鈣含量的水體污染修復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 廢水樣品

明膠加工廢水樣品：取自甘肅阿敏生物清真明膠有限公司污水處理站。

1.1.2 化學試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉、氯化鈣（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：瓊脂16 g/L，其余與上述液體培養(yǎng)基相同，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：瓊脂18 g/L，其余同液體培養(yǎng)基，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：稱取氯化鈣8.33 g（Ca2+含量為3 g/L）、27.78 g（Ca2+含量為10 g/L）、55.56 g（Ca2+含量為20 g/L）、83.33 g（Ca2+含量為30 g/L）、111.11 g（Ca2+含量為40 g/L）、138.89 g（Ca2+含量為50 g/L）分別溶于1 L液體的培養(yǎng)基中，121℃高壓蒸汽滅菌20min，即得對應Ca2+濃度的篩選培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基Ca2+含量的計算公式如下：

式中：mc（CaCl2）為氯化鈣的質量，g；c（Ca2+）為所需的Ca2+含量，g/L；M（CaCl2）為氯化鈣的摩爾質量，111 g/mol；M（Ca2+）為Ca2+的摩爾質量，40g/mol；V為培養(yǎng)基體積，L。

1.2 儀器與設備

HVS-1300-U型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；SHZ-8Z型恒溫振蕩器：國華企業(yè)集團有限公司；Genesy 96T型基因擴增熱循環(huán)儀：杭州郎基科學儀器有限公司；UV2600nmA紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；24LDJ手提式高壓蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；PTC-200型聚合酶鏈式反應（polymeraschainreaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 廢水樣品處理

從明膠污水處理站的初沉池、好氧池、厭氧池和排放口4個采樣點分別取廢水樣品5 g，然后加入事先準備的30 mL含玻璃珠的無菌水中。

菌懸液的制備：在30℃、120r/min條件下恒溫振蕩10min。準確量取1 mL菌懸液加入到9 mL無菌水中得到10-1菌懸液，采用同樣方法依次稀釋得到10-2～10-7梯度菌懸液。

1.3.2 耐鈣菌株的初篩

在超凈工作臺中，取Ca2+含量為3 g/L已滅菌的液體培養(yǎng)基中加入0.05 mL廢水樣品，放入37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液。用接種環(huán)將發(fā)酵液采用三區(qū)劃線法接種至Ca2+含量為3 g/L的固體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。經(jīng)過反復平板劃線分離純化，將篩選出的菌株進行編號，4 ℃斜面保存[12]。

1.3.3 耐鈣菌株的復篩

將初篩得到的菌株按2%的接種量依次加入Ca2+含量為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，取100 μL培養(yǎng)液用涂布棒均勻涂布在固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，挑取高Ca2+含量培養(yǎng)基中生長良好的菌落，最終篩選出耐鈣能力強的菌株，接種于斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存[13]。

1.3.4 耐鈣菌株的鑒定

形態(tài)學觀察：制備10-6菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h會形成單菌落，肉眼及顯微鏡觀察菌落的形狀、顏色、粘稠度以及邊緣等特征[14]。

生理生化鑒定：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]、《伯杰氏細菌鑒定手冊》[16]，通過吲哚試驗、檸檬酸鹽試驗等方法考察菌株的生理生化特征。

分子生物學鑒定：利用試劑盒提取菌體總DNA[17]；并以該DNA為模板，以27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'為引物[18]，進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）：上下游引物各2 μL，Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，雙蒸水35.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后94 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司測序。將測序的基因序列通過與美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，使用MEGA 7.0生物學軟件對近似序列進行比對分析，利用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.5 耐鈣菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

單因素試驗：將篩選菌株接種在30 mL液體培養(yǎng)基中活化18 h后，分別以5%（V/V）的接種量接入已滅菌的裝液量為30 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中。在37 ℃、120 r/min條件下，分別研究培養(yǎng)時間（0、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h、27 h、30 h、33 h、36 h、39 h、42 h、45 h），培養(yǎng)溫度（20 ℃、26 ℃、32 ℃、37 ℃、45 ℃），培養(yǎng)基初始pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），初始Ca2+含量（0、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L、8.0 mg/L）對菌懸液吸光度值（OD600nm值）的影響，每個試驗進行3次平行。

響應面試驗：在上述單因素試驗結果的基礎上，以培養(yǎng)溫度（A），培養(yǎng)基初始pH值（B）和初始Ca2+含量（C）為響應因素，以菌懸液吸光度值（OD600nm值）（Y）為響應值，進行基于Box-Behnken試驗設計的3因素3水平優(yōu)化試驗，并根據(jù)方程（1）對變量進行編碼[20]。

式中：Y是響應值即菌懸液吸光度值（OD600nm值）；β0是常數(shù)；βi是線性系數(shù)；βii是二次系數(shù)；βij是變量之間相互作用系數(shù)，Xi和Xj是表示不同自變量。

通過方差分析（analysis of variance，ANOVA）檢驗回歸系數(shù)統(tǒng)計的顯著性及模型的充分性，自變量之間的相互作用及其影響利用響應面等值線圖進行分析。最后多次試驗驗證優(yōu)化設計及統(tǒng)計實驗的有效性[21]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 軟件整理基礎數(shù)據(jù)，整理后的數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0軟件進行ANOVA分析，用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)分析作圖，用Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計并進行相關數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 耐鈣菌株的篩選

2.1.1 耐鈣菌株的初篩

通過從Ca2+含量為3 g/L已滅菌的培養(yǎng)基平板中初篩獲得3株菌株，依次編號為N3-1、N3-2、N3-3。

2.1.2 耐鈣菌株的復篩

初篩得到的3株菌株依次通過Ca2+含量為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的培養(yǎng)基中復篩，菌株N3-2、N3-3在Ca2+含量為20 g/L的培養(yǎng)基中停止生長，菌株N3-1在Ca2+含量為40 g/L的培養(yǎng)基中緩慢生長，在Ca2+含量為50 g/L的培養(yǎng)基中停止生長，通過復篩獲得一株耐鈣菌株N3-1。

2.2 耐鈣菌株的鑒定

2.2.1 菌株N3-1的形態(tài)學觀察

由圖1可知，菌株N3-1在37 ℃固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后形成的表面呈同心環(huán)狀，邊緣鋸齒狀，灰白色半透明的圓形菌落，菌株N3-1革蘭氏染色結果顯示為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株N3-1的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain N3-1

2.2.2 菌株N3-1的生理生化特征

菌株N3-1的生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗鑒定結果分別見表1和表2。由表1和表2可知，菌株N3-1可分解明膠、淀粉、葡萄糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇等，但不能分解木糖。菌株N3-1吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P試驗結果均為陽性，檸檬酸鹽試驗結果為陰性。

表1 菌株N3-1的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain N3-1

表2 菌株N3-1的糖發(fā)酵試驗結果Table 2 Sugar fermentation tests results of strain N3-1

2.2.3 菌株N3-1的分子生物學鑒定

將菌株N3-1的16S rDNA產(chǎn)物進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對，利用MEGA7.0軟件中的NJ法對該菌株及與其序列相似度較高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株N3-1與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的Bacillusniabensis（登錄號AY998119）同源性最高[22]，相似度為100%。結合形態(tài)學特征、生理生化試驗及16S rRNA分子生物學分析，菌株N3-1被鑒定為尼阿布芽孢桿菌（Bacillus niabensis）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株N3-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain N3-1 based on 16S rDNA sequence

2.3 耐鈣菌株N3-1的培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 菌株N3-1的生長曲線

微生物生長有一定的規(guī)律性，分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期[23]。由圖3可知，菌株N3-1培養(yǎng)0～6 h時菌液澄清，為潛伏期；培養(yǎng)6～21 h菌液開始渾濁，表明菌株的生長速度加快，進入對數(shù)期階段，菌體數(shù)出現(xiàn)指數(shù)增長；培養(yǎng)21～36 h后菌體渾濁程度相對穩(wěn)定，未發(fā)生明顯變化，說明該菌體進入穩(wěn)定期；培養(yǎng)36 h后吸光度值出現(xiàn)明顯的下降趨勢，可能由于部分菌體衰亡，說明該菌體進入衰退期。該試驗得出菌株N3-1的最佳培養(yǎng)時間為21 h。

圖3 菌株N3-1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain N3-1

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株N3-1生長的影響

pH值是影響微生物生長的重要因素，與微生物的物質代謝、生命活動有著密切的關系[8]。由圖4可知，當培養(yǎng)基初始pH值＜6時，菌懸液OD600nm值隨著pH值的增加呈現(xiàn)快速增長趨勢；當培養(yǎng)基初始pH值為6～8時，OD600nm值緩慢增加；當培養(yǎng)基初始pH達到8時，菌株N3-1的OD600nm值達到最大，為0.825；當培養(yǎng)基初始pH＞8之后，OD600nm值隨著pH的增加反而下降，過高或過低均不利其生長。因此，菌株N3-1的最適培養(yǎng)基初始pH值為8。

圖4 培養(yǎng)基初始pH對菌株N3-1生長的影響Fig.4 Effect of initial medium pH on strain N3-1 growth

2.3.3 培養(yǎng)溫度對菌株N3-1生長的影響

溫度是微生物的重要生存因子，在適宜溫度范圍內(nèi)，酶促反應速率隨著溫度的升高逐漸加快，微生物的代謝速率和生長速率也相應提高，適宜的培養(yǎng)溫度可以使微生物以最快的生長速率繁殖生長[23-24]。由圖5可知，當培養(yǎng)溫度在20～37 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，OD600nm值明顯升高，表明菌株N3-1的生長速率隨著培養(yǎng)溫度的升高而加快，生長情況較好；當培養(yǎng)溫度為37 ℃時，菌株的OD600nm值達到最大值，為0.489，表明菌株N3-1的培養(yǎng)溫度適宜；當培養(yǎng)溫度＞37 ℃之后，OD600nm值明顯下降，表明菌株N3-1的生長速率隨著溫度的升高而下降。因此，菌株N3-1的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖5 培養(yǎng)溫度對菌株N3-1生長的影響Fig.5 Effect of culture temperature on growth of strain N3-1

2.3.4 初始Ca2+含量對菌株N3-1生長的影響

由圖6可知，當菌株N3-1在初始Ca2+含量為0.5～1.5 mg/L時，OD600nm值隨著鈣離子含量的增加而增大，說明初始Ca2+含量在適當范圍內(nèi)能促進該菌株的生長。當初始Ca2+含量為1.5 mg/L時，OD600nm值達到最大，為0.883。當初始Ca2+含量＞1.5 mg/L之后，OD600nm值呈波動下降趨勢，初始Ca2+含量過高會抑制菌株N3-1的生長。因此，菌株N3-1的最適初始Ca2+含量為1.5 mg/L。

圖6 初始Ca2+含量對菌株N3-1生長的影響Fig.6 Effect of initial Ca2+contents on strain N3-1 growth

2.4 菌株N3-1培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗

2.4.1 響應面優(yōu)化試驗及結果

在單因素試驗基礎上，以菌懸液OD600nm值（Y）為響應值，以培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基初始pH（B）和初始Ca2+含量（C）為自變量，進行響應面優(yōu)化試驗，Box-Behnken 試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合，得到二次多項回歸模型方程為：Y=0.78+0.018A+0.014B-0.050C-4.750E-0.03AB-0.047AC-6.500E-0.03BC-0.48A2-0.076B2-0.14C2

2.4.2 回歸模型方差分析

由表4可知，模型F值為375.40，P值＜0.000 1，表明響應面建立的回歸模型達到了高度顯著水平，失擬項P值=0.052 7＞0.05，不顯著，表明模型與試驗數(shù)據(jù)之間擬合度好。模型決定系數(shù)R2=0.997 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.995 3，說明該模型的擬合度良好且試驗誤差較小。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為4.07%，在可接受范圍內(nèi)，說明實驗操作可行[25]。二次項A2、B2、C2對結果影響高度顯著（P＜0.001），一次項C、交互項AC對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。各因素對菌株N3-1的OD600nm值影響程度高低順序依次為初始Ca2+含量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基初始pH值。

2.4.3 各因素交互作用對菌株N3-1生長影響的響應面分析

響應曲面圖可以直觀地反映出兩因素交互作用對響應值的影響[26]。通過保持其中兩個因素不變而改變另一個因素，以了解兩個獨立變量之間的交互作用對OD600nm值影響，利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用響應面及等高線見圖7。

圖7 各因素交互作用對菌株N3-1的OD600nm值影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on OD600 nm value of strain N3-1

由圖7可知，溫度與pH值的交互作用下，溫度一定時，隨著pH值的增加，OD600nm值無顯著變化，當pH值一定時，隨著溫度增大，OD600nm值先升高后降低，表明溫度影響比pH明顯；溫度與初始Ca2+含量的交互影響下，溫度一定時，OD600nm值隨Ca2+含量的增加輕微地先增加后減少，當初始Ca2+含量一定時，隨溫度增大，OD600nm值先增后減的變化趨勢，表明初始Ca2+含量比溫度影響明顯；pH值與初始Ca2+含量的交互影響下，控制其他條件不變，初始Ca2+含量增加，OD600nm值先逐漸升高后降低，控制除pH值外的條件不變，pH值增加，OD600nm值無顯著變化，由各因素對純度影響效果的顯著性可以得出，初始Ca2+含量比pH值影響明顯。

2.4.4 驗證試驗

理論上菌株N3-1最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37.2 ℃，初始Ca2+含量1.41 mg/L，初始pH值8.31，在此條件下預測的OD600nm值為0.775。為了便于實際操作，將培養(yǎng)條件修正為培養(yǎng)溫度37 ℃，初始Ca2+含量1.40 mg/L，初始pH值8.3。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下進行3次平行驗證試驗，OD600nm值實際值為0.768。實測值與理論值的誤差為0.90%，差異不顯著，表明該模型可以較好的預測菌株的生長條件。

3 結論

本研究從明膠廢水中篩選出一株對Ca2+有較強抗性的細菌，經(jīng)過形態(tài)特征的觀察、生理生化鑒定及分子生物學鑒定為尼阿布芽孢桿菌（Bacillus niabensis）。通過單因素及響應面優(yōu)化確定該菌株的最適培養(yǎng)條件為初始Ca2+含量1.40 mg/L，培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH 值為8.3。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，OD600nm值為0.768。本研究中篩選得到的Bacillus niabensis可以在高Ca2+濃度的水體環(huán)境中生長。今后將繼續(xù)對該菌鈣離子的吸附機理進一步研究，可以為微生物修復水體污染提供新的菌種資源。