崔艷紅， 李克芳， 金 博， 彭 飛， 劉培培， 曲偉偉， 門 翔， 趙 江

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二病區(qū)，河南南陽(yáng)473000）

博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）是一種抗腫瘤藥物，主要用于淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌和睪丸腫瘤的治療。而BLM 的臨床應(yīng)用常由于肺泡炎的發(fā)生而受到限制，且這種肺炎有可能發(fā)展為間質(zhì)性肺纖維化［1］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，已觀察到BLM 處理能導(dǎo)致肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺組織中促炎因子、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和反應(yīng)性含氮物質(zhì)升高，甚至?xí)?dǎo)致肺纖維化的發(fā)生［2-3］。因此，抑制BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎的發(fā)生對(duì)BLM化療應(yīng)用尤為關(guān)鍵。

松果菊苷（echinacoside，ECH）是從管花肉蓯蓉中提取的一種苯乙醇苷類化合物。以往的研究［4-5］表明，ECH 對(duì)多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。近年來(lái)的研究［6-7］顯示，ECH 還具有抗衰老、抗炎和抗氧化的藥理作用。然而，目前ECH 對(duì)BLM 導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的作用尚未明確。因此，本研究采用體外細(xì)胞模型法，初步觀察ECH 處理對(duì)BLM 刺激肺上皮細(xì)胞的凋亡、炎癥因子水平和氧化應(yīng)激的影響，并檢測(cè)與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的蛋白核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）、核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)水平。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞HEPApiC（上海佰曄生物科技中心細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（PAA）；DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）；BLM 和ECH（北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；Hoechst 33258 試劑、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和CCK-8 試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和 IL-1β ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ROS 和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗 Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2 抗體（Stanta Cruz）；抗 GAPDH 和 Lamin B1 抗體及HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEPApiC 細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞約90%鋪滿時(shí)按1∶3 的比例傳代，每3 d傳代換液一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選BLM 和ECH 的最佳處理濃度 將HEPApiC 細(xì)胞制成5×107/L 的細(xì)胞懸液，并接種100 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，然后分別用0、1、2.5、5 和 10 mg/L 的 BLM 處理培養(yǎng) 48 h，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，分別加入10 μL CCK-8 試劑，并在37 ℃下孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，以評(píng)估BLM 的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)濃度。然后，將細(xì)胞分別采用 0、5、25、125 和625 mg/L 的 ECH 處理 48 h，再次用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，以篩選無(wú)細(xì)胞毒性的ECH 濃度范圍。最后，將細(xì)胞用最佳濃度的BLM預(yù)處理30 min，再分別用篩選的無(wú)細(xì)胞毒性的濃度范圍的ECH 分別處理48 h，再次用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力，以篩選最佳的ECH實(shí)驗(yàn)濃度。

2.3 細(xì)胞分組 根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選的BLM 和ECH 濃度，分別將細(xì)胞分為空白對(duì)照（control）組、BLM 處理（BLM）組（最佳實(shí)驗(yàn)濃度的BLM 處理細(xì)胞48 h）和BLM+ECH 組（最佳實(shí)驗(yàn)濃度的BLM 預(yù)處理細(xì)胞30 min，再用最佳實(shí)驗(yàn)濃度的ECH處理48 h）。

2.4 Hoechst 33258 染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 分別收集各組細(xì)胞，在室溫避光環(huán)境中用Hoechst 33258染色15 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，1 207.4×g離心5 min，收集細(xì)胞，再用PBS重懸2遍，加入結(jié)合緩沖液后，轉(zhuǎn)移至暗室，分別加入Annexin V-FITC 試劑和PI試劑混勻，并孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β水平 收集已處理的各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于冰盒上保存。然后根據(jù)ELISA 試劑盒步驟，先將各樣品孔用各試劑盒中的抗體包被，然后在抗體包被的樣品孔中加入10 μL 對(duì)應(yīng)各組的培養(yǎng)基，再加入40 μL稀釋液，封板膜封住反應(yīng)孔，放入37 ℃水浴鍋溫浴30 min，棄去液體，洗滌液洗滌5 次，加 50 μL 酶標(biāo)試劑，溫浴30 min，洗滌5 次后，各孔加入顯色液A、B各50 μL，37 ℃避光15 min；加入 50 μL 終止液，并在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度（A）值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量變化。

2.7 試劑盒法檢測(cè)各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平 分別按照試劑盒法檢測(cè)各組MDA、ROS 和SOD 水平。對(duì)于MDA 含量的檢測(cè)，先用RIPA 裂解各組細(xì)胞，并收集裂解液；然后用BCA 法檢測(cè)裂解液中的蛋白濃度后，取各組裂解液與MDA 檢測(cè)工作液混勻后沸水浴15 min，待冷卻至室溫后，536.6 ×g離心5 min，收集上清液，并分別取100 μL 上清液加入96 孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)530 nm波長(zhǎng)處吸光度值；最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品上清液中MDA 含量，并用裂解液中單位質(zhì)量蛋白的含量將細(xì)胞中MDA 的含量標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于ROS 水平的檢測(cè)，在37 ℃下，分別用10 μmol/L 的 DCFH-DA 避光孵育各組細(xì)胞 20 min，然后用熒光顯微鏡觀察，并用自帶軟件統(tǒng)計(jì)各組熒光值。對(duì)于SOD 活性的檢測(cè)，先用SOD 制備液充分裂解細(xì)胞，并在4 ℃下用190 000×g離心5 min收集上清液，并用BCA 法檢測(cè)上清液中蛋白濃度；然后根據(jù)試劑盒提供方法分為樣品孔、空白對(duì)照孔1 和空白對(duì)照孔2，并分別加入SOD 檢測(cè)工作液和反應(yīng)啟動(dòng)液，37 ℃孵育30 min，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值；最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和上清液中蛋白濃度計(jì)算SOD的活性。

2.8 Western blot 法檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量 分別用細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核分離試劑盒和RIPA 萃取各組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白和總蛋白。然后利用BCA 法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，各組樣品分別取 40 μg 蛋白進(jìn)行 Western blot 電泳/電轉(zhuǎn)程序。將電轉(zhuǎn)后的蛋白用5%脫脂牛奶封閉后，室溫孵育 1∶1 000 的稀釋比例的Ⅰ抗（Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2）2 h，TBST 洗滌 3 次后室溫孵育相應(yīng)的 HRP標(biāo)記的Ⅱ抗1 h，TBST 洗滌3 次，加入顯影液并進(jìn)行顯影；然后分別按上述方法孵育內(nèi)參照。以Lamin B1 為細(xì)胞核蛋白內(nèi)參照，以GAPDH 為細(xì)胞質(zhì)蛋白和總蛋白內(nèi)參照，用ImageJ 軟件量化蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析事后Bonferroni校正法進(jìn)行多組間均數(shù)的兩兩比較。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ECH能逆轉(zhuǎn)BLM誘導(dǎo)的HEPApiC活性降低

圖 1A 顯 示 ，BLM 濃 度 為 5 和 10 mg/L 時(shí) HEPApiC 活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且在10 mg/L時(shí)細(xì)胞活性降低最為顯著，故后續(xù)選擇BLM 的實(shí)驗(yàn)濃度為10 mg/L。圖1B顯示，0～125 mg/L濃度范圍的ECH 對(duì) HEPApiC 無(wú)細(xì)胞毒性；且 25 和 125 mg/L 的ECH 均能部分抑制BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），但ECH 在125 mg/L 時(shí)效果最為顯著（圖1C），故后續(xù)選擇ECH 的實(shí)驗(yàn)濃度為125 mg/L。

2 ECH可減少BLM誘導(dǎo)的HEPApiC凋亡

Hoechst 33258 染色結(jié)果（圖2A）顯示，對(duì)照組細(xì)胞核正常，BLM 組HEPApiC 出現(xiàn)細(xì)胞核固縮和凋亡小體（熒光碎片）；BLM+ECH 組細(xì)胞的凋亡小體減少。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖2B、2C）顯示，相較于對(duì)照組，BLM組細(xì)胞凋亡比例顯著增加（P＜0.01）；給予ECH 后，由BLM 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

3 ECH可降低BLM誘導(dǎo)的HEPApiC的炎癥水平

圖 3 顯示，相較于對(duì)照組，BLM 組 HEPApiC 細(xì)胞的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 分泌水平顯著增加（P＜0.01）；給予 ECH 后，BLM 誘導(dǎo)的上述促炎因子的水平均顯著降低（P＜0.01）。

4 ECH 可降低BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 的氧化應(yīng)激水平

圖 4 顯示，相較于對(duì)照組，BLM 組 HEPApiC 細(xì)胞中ROS 和MDA 水平顯著增加（P＜0.01），SOD 活性顯著降低（P＜0.01）；與BLM 組比較，BLM+ECH 組HEPApiC 細(xì)胞中ROS 和MDA 水平顯著降低（P＜0.01），SOD活性顯著增加（P＜0.01）。

5 ECH 對(duì) BLM 誘導(dǎo)的 Nrf-2/NF-κB/COX-2 信號(hào)通路的影響

Figure 1. Screening of BLM and ECH concentrations. A：effects of different concentrations of BLM on viability in HEPApiCs；B：effects of different concentrations of ECH on viability in HEPApiCs；C：effect of ECH on BLM-induced viability. Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BLM group.圖1 BLM和ECH實(shí)驗(yàn)濃度的篩選

圖 5 顯示，相較于對(duì)照組，BLM 組 HEPApiC 細(xì)胞中細(xì)胞核 NF-κB p65、細(xì)胞核 Nrf-2 及 COX-2 蛋白的表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 和細(xì)胞質(zhì)Nrf-2蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與BLM組比較，BLM+ECH 組 HEPApiC 細(xì)胞中細(xì)胞核 NF-κB p65、細(xì)胞質(zhì)Nrf-2 以及COX-2 蛋白的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞質(zhì) NF-κB p65 和細(xì)胞核Nrf-2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。

討 論

BLM 是常用的抗腫瘤藥物。然而，有研究［1-3，8］顯示，BLM 在氧分子和鐵離子存在下可產(chǎn)生活性氧自由基，活性氧不僅可引起急性損傷性肺泡炎，還可破壞肺泡上皮細(xì)胞中的DNA 空間結(jié)構(gòu)，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞凋亡，損傷肺功能。因此，逆轉(zhuǎn)BLM化療造成的肺損傷對(duì)BLM 的化療效果具有重大的意義。本研究采用BLM 刺激HEPApiC 以模擬體外環(huán)境BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎，結(jié)果顯示，ECH 能抑制 BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC凋亡、促炎因子和氧化應(yīng)激水平，提示ECH可能具有改善BLM誘導(dǎo)的肺泡炎的潛力。

Nrf-2 是細(xì)胞內(nèi)維持氧化/還原平衡的主要轉(zhuǎn)錄因子，在正常生理狀態(tài)下，其被限制在細(xì)胞質(zhì)中且保持失活；在受到氧化刺激時(shí)，Nrf-2 易位到細(xì)胞核中，并與抗氧化劑反應(yīng)元件結(jié)合而激活［9］。Nrf-2 激活可通過(guò)上調(diào)如SOD、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽還原酶等一系列抗氧化蛋白表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激引起的肺損傷［10-11］。本研究結(jié)果顯示，在給予 BLM 作用后，HEPApiC 的氧化應(yīng)激水平增加，且細(xì)胞中Nrf-2入核，而加入ECH 后氧化應(yīng)激水平降低，且細(xì)胞中Nrf-2 入核進(jìn)一步增加，提示ECH 降低BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 氧化應(yīng)激可能與增強(qiáng)Nrf-2 核轉(zhuǎn)位有關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB 以非活性的形式被錨定在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在外界如氧化應(yīng)激、感染和炎癥等刺激下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，激活NF-κB［12］。已有的研究［12-14］顯示，降低NF-κB活性可抑制機(jī)體多種組織炎癥。在本研究結(jié)果提示，ECH 減輕BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 炎癥反應(yīng)，可能與其降低NF-κB p65核轉(zhuǎn)位有關(guān)。COX-2 是細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的重要介導(dǎo)因子，在正常肺組織中幾乎不表達(dá)COX-2；而肺組織受到氧化應(yīng)激和致炎刺激時(shí)，COX-2 異常高表達(dá)，且高表達(dá)的COX-2 能加劇炎癥反應(yīng)和組織損傷［15-16］。在本研究中，COX-2 在 BLM 作用后上調(diào)，而加入ECH 后的COX-2 的表達(dá)明顯降低，提示COX-2可能參與ECH 對(duì)BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 損傷和炎癥反應(yīng)的抑制作用。

Figure 2. ECH reduced BLM-induced apoptosis in HEPApiCs. A：Hoechst 33258 stained images（scale bar=20 μm）；B and C：apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.圖2 ECH可減少BLM誘導(dǎo)的HEPApiC凋亡

Figure 3. ECH reduced BLM-induced inflammation level in HEPApiCs. The secretion levels of IL-6（A），IL-1β（B）and TNF-α（C）in HEPApiCs of each group were detected by ELISA. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.圖3 ECH可降低BLM誘導(dǎo)的HEPApiC的炎癥水平

Figure 4. ECH reduced BLM-induced oxidative stress level in HEPApiCs. A and B：results of ROS level（scale bar=20 μm）；C：results of MDA level；D：results of SOD activity. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.圖4 ECH可降低BLM誘導(dǎo)的HEPApiC氧化應(yīng)激水平

Figure 5. Effect of ECH on BLM-induced Nrf-2/NF-κB/COX-2 signaling pathway. A to C：the protein expression of NF-κB p65 in HEPApiCs was detected by Western blot；D to F：the protein expression of Nrf-2 in HEPApiCs was detected by Western blot；G and H：the protein expression of COX-2 in HEPApiCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BLM group.圖5 ECH對(duì)BLM誘導(dǎo)的Nrf-2/NF-κB/COX-2信號(hào)通路的影響

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，ECH 對(duì)BLM 誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的氧化損傷和炎癥反應(yīng)具有抑制作用，且能促進(jìn)Nrf-2 入核和下調(diào)NF-κB/COX-2 信號(hào)活性。但本研究尚存在一定的局限性，比如未進(jìn)行動(dòng)物模型的相關(guān)研究，也未對(duì)細(xì)胞進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證ECH 對(duì)BLM 誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的氧化損傷和炎癥反應(yīng)的確切機(jī)制，故ECH 抗BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎的具有作用及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。