崔艷紅, 李克芳, 金 博, 彭 飛, 劉培培, 曲偉偉, 門 翔, 趙 江
(南陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二病區(qū),河南南陽473000)
博來霉素(bleomycin,BLM)是一種抗腫瘤藥物,主要用于淋巴瘤、鱗狀細胞癌和睪丸腫瘤的治療。而BLM 的臨床應(yīng)用常由于肺泡炎的發(fā)生而受到限制,且這種肺炎有可能發(fā)展為間質(zhì)性肺纖維化[1]。在動物實驗中,已觀察到BLM 處理能導(dǎo)致肺組織中炎癥細胞浸潤,且肺組織中促炎因子、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和反應(yīng)性含氮物質(zhì)升高,甚至?xí)?dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[2-3]。因此,抑制BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎的發(fā)生對BLM化療應(yīng)用尤為關(guān)鍵。
松果菊苷(echinacoside,ECH)是從管花肉蓯蓉中提取的一種苯乙醇苷類化合物。以往的研究[4-5]表明,ECH 對多種實體瘤細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用。近年來的研究[6-7]顯示,ECH 還具有抗衰老、抗炎和抗氧化的藥理作用。然而,目前ECH 對BLM 導(dǎo)致的肺上皮細胞損傷和炎癥反應(yīng)的作用尚未明確。因此,本研究采用體外細胞模型法,初步觀察ECH 處理對BLM 刺激肺上皮細胞的凋亡、炎癥因子水平和氧化應(yīng)激的影響,并檢測與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的蛋白核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf-2)、核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65 和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表達水平。
人Ⅱ型肺泡上皮細胞HEPApiC(上海佰曄生物科技中心細胞庫);胎牛血清(PAA);DMEM 培養(yǎng)液(Gibco);BLM 和ECH(北京邁瑞達科技有限公司);Hoechst 33258 試劑、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒和CCK-8 試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素 6(interleukin-6,IL-6)和 IL-1β ELISA 試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、ROS 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);抗 Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2 抗體(Stanta Cruz);抗 GAPDH 和 Lamin B1 抗體及HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)。
2.1 細胞培養(yǎng) HEPApiC 細胞加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞約90%鋪滿時按1∶3 的比例傳代,每3 d傳代換液一次。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。
2.2 CCK-8 實驗篩選BLM 和ECH 的最佳處理濃度 將HEPApiC 細胞制成5×107/L 的細胞懸液,并接種100 μL細胞懸液于96孔板中,然后分別用0、1、2.5、5 和 10 mg/L 的 BLM 處理培養(yǎng) 48 h,然后根據(jù)試劑盒說明書,分別加入10 μL CCK-8 試劑,并在37 ℃下孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度(A)值,以評估BLM 的最優(yōu)實驗濃度。然后,將細胞分別采用 0、5、25、125 和625 mg/L 的 ECH 處理 48 h,再次用CCK-8 法檢測細胞活力,以篩選無細胞毒性的ECH 濃度范圍。最后,將細胞用最佳濃度的BLM預(yù)處理30 min,再分別用篩選的無細胞毒性的濃度范圍的ECH 分別處理48 h,再次用CCK-8 檢測細胞活力,以篩選最佳的ECH實驗濃度。
2.3 細胞分組 根據(jù)CCK-8 實驗篩選的BLM 和ECH 濃度,分別將細胞分為空白對照(control)組、BLM 處理(BLM)組(最佳實驗濃度的BLM 處理細胞48 h)和BLM+ECH 組(最佳實驗濃度的BLM 預(yù)處理細胞30 min,再用最佳實驗濃度的ECH處理48 h)。
2.4 Hoechst 33258 染色法觀察細胞凋亡形態(tài) 分別收集各組細胞,在室溫避光環(huán)境中用Hoechst 33258染色15 min,在顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。
2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞,1 207.4×g離心5 min,收集細胞,再用PBS重懸2遍,加入結(jié)合緩沖液后,轉(zhuǎn)移至暗室,分別加入Annexin V-FITC 試劑和PI試劑混勻,并孵育15 min,然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
2.6 ELISA 法檢測各組細胞的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β水平 收集已處理的各組細胞的培養(yǎng)基,置于冰盒上保存。然后根據(jù)ELISA 試劑盒步驟,先將各樣品孔用各試劑盒中的抗體包被,然后在抗體包被的樣品孔中加入10 μL 對應(yīng)各組的培養(yǎng)基,再加入40 μL稀釋液,封板膜封住反應(yīng)孔,放入37 ℃水浴鍋溫浴30 min,棄去液體,洗滌液洗滌5 次,加 50 μL 酶標(biāo)試劑,溫浴30 min,洗滌5 次后,各孔加入顯色液A、B各50 μL,37 ℃避光15 min;加入 50 μL 終止液,并在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量各孔的吸光度(A)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算各組TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量變化。
2.7 試劑盒法檢測各組細胞的氧化應(yīng)激水平 分別按照試劑盒法檢測各組MDA、ROS 和SOD 水平。對于MDA 含量的檢測,先用RIPA 裂解各組細胞,并收集裂解液;然后用BCA 法檢測裂解液中的蛋白濃度后,取各組裂解液與MDA 檢測工作液混勻后沸水浴15 min,待冷卻至室溫后,536.6 ×g離心5 min,收集上清液,并分別取100 μL 上清液加入96 孔板,用酶標(biāo)儀檢測530 nm波長處吸光度值;最后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組樣品上清液中MDA 含量,并用裂解液中單位質(zhì)量蛋白的含量將細胞中MDA 的含量標(biāo)準(zhǔn)化。對于ROS 水平的檢測,在37 ℃下,分別用10 μmol/L 的 DCFH-DA 避光孵育各組細胞 20 min,然后用熒光顯微鏡觀察,并用自帶軟件統(tǒng)計各組熒光值。對于SOD 活性的檢測,先用SOD 制備液充分裂解細胞,并在4 ℃下用190 000×g離心5 min收集上清液,并用BCA 法檢測上清液中蛋白濃度;然后根據(jù)試劑盒提供方法分為樣品孔、空白對照孔1 和空白對照孔2,并分別加入SOD 檢測工作液和反應(yīng)啟動液,37 ℃孵育30 min,然后用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處吸光度值;最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和上清液中蛋白濃度計算SOD的活性。
2.8 Western blot 法檢測蛋白的相對表達量 分別用細胞質(zhì)/細胞核分離試劑盒和RIPA 萃取各組細胞的細胞質(zhì)蛋白、細胞核蛋白和總蛋白。然后利用BCA 法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后,各組樣品分別取 40 μg 蛋白進行 Western blot 電泳/電轉(zhuǎn)程序。將電轉(zhuǎn)后的蛋白用5%脫脂牛奶封閉后,室溫孵育 1∶1 000 的稀釋比例的Ⅰ抗(Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2)2 h,TBST 洗滌 3 次后室溫孵育相應(yīng)的 HRP標(biāo)記的Ⅱ抗1 h,TBST 洗滌3 次,加入顯影液并進行顯影;然后分別按上述方法孵育內(nèi)參照。以Lamin B1 為細胞核蛋白內(nèi)參照,以GAPDH 為細胞質(zhì)蛋白和總蛋白內(nèi)參照,用ImageJ 軟件量化蛋白相對表達量。
結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,并采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析事后Bonferroni校正法進行多組間均數(shù)的兩兩比較。當(dāng)P<0.05 時,差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
圖 1A 顯 示 ,BLM 濃 度 為 5 和 10 mg/L 時 HEPApiC 活性顯著降低(P<0.05,P<0.01),且在10 mg/L時細胞活性降低最為顯著,故后續(xù)選擇BLM 的實驗濃度為10 mg/L。圖1B顯示,0~125 mg/L濃度范圍的ECH 對 HEPApiC 無細胞毒性;且 25 和 125 mg/L 的ECH 均能部分抑制BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 活性降低(P<0.05,P<0.01),但ECH 在125 mg/L 時效果最為顯著(圖1C),故后續(xù)選擇ECH 的實驗濃度為125 mg/L。
Hoechst 33258 染色結(jié)果(圖2A)顯示,對照組細胞核正常,BLM 組HEPApiC 出現(xiàn)細胞核固縮和凋亡小體(熒光碎片);BLM+ECH 組細胞的凋亡小體減少。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖2B、2C)顯示,相較于對照組,BLM組細胞凋亡比例顯著增加(P<0.01);給予ECH 后,由BLM 誘導(dǎo)的細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。
圖 3 顯示,相較于對照組,BLM 組 HEPApiC 細胞的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 分泌水平顯著增加(P<0.01);給予 ECH 后,BLM 誘導(dǎo)的上述促炎因子的水平均顯著降低(P<0.01)。
圖 4 顯示,相較于對照組,BLM 組 HEPApiC 細胞中ROS 和MDA 水平顯著增加(P<0.01),SOD 活性顯著降低(P<0.01);與BLM 組比較,BLM+ECH 組HEPApiC 細胞中ROS 和MDA 水平顯著降低(P<0.01),SOD活性顯著增加(P<0.01)。
Figure 1. Screening of BLM and ECH concentrations. A:effects of different concentrations of BLM on viability in HEPApiCs;B:effects of different concentrations of ECH on viability in HEPApiCs;C:effect of ECH on BLM-induced viability. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs BLM group.圖1 BLM和ECH實驗濃度的篩選
圖 5 顯示,相較于對照組,BLM 組 HEPApiC 細胞中細胞核 NF-κB p65、細胞核 Nrf-2 及 COX-2 蛋白的表達均顯著增加(P<0.01),細胞質(zhì)NF-κB p65 和細胞質(zhì)Nrf-2蛋白的表達顯著降低(P<0.01);與BLM組比較,BLM+ECH 組 HEPApiC 細胞中細胞核 NF-κB p65、細胞質(zhì)Nrf-2 以及COX-2 蛋白的表達均顯著降低(P<0.05,P<0.01),細胞質(zhì) NF-κB p65 和細胞核Nrf-2蛋白表達顯著增加(P<0.01)。
BLM 是常用的抗腫瘤藥物。然而,有研究[1-3,8]顯示,BLM 在氧分子和鐵離子存在下可產(chǎn)生活性氧自由基,活性氧不僅可引起急性損傷性肺泡炎,還可破壞肺泡上皮細胞中的DNA 空間結(jié)構(gòu),誘發(fā)脂質(zhì)過氧化和細胞凋亡,損傷肺功能。因此,逆轉(zhuǎn)BLM化療造成的肺損傷對BLM 的化療效果具有重大的意義。本研究采用BLM 刺激HEPApiC 以模擬體外環(huán)境BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎,結(jié)果顯示,ECH 能抑制 BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC凋亡、促炎因子和氧化應(yīng)激水平,提示ECH可能具有改善BLM誘導(dǎo)的肺泡炎的潛力。
Nrf-2 是細胞內(nèi)維持氧化/還原平衡的主要轉(zhuǎn)錄因子,在正常生理狀態(tài)下,其被限制在細胞質(zhì)中且保持失活;在受到氧化刺激時,Nrf-2 易位到細胞核中,并與抗氧化劑反應(yīng)元件結(jié)合而激活[9]。Nrf-2 激活可通過上調(diào)如SOD、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽還原酶等一系列抗氧化蛋白表達,從而減輕氧化應(yīng)激引起的肺損傷[10-11]。本研究結(jié)果顯示,在給予 BLM 作用后,HEPApiC 的氧化應(yīng)激水平增加,且細胞中Nrf-2入核,而加入ECH 后氧化應(yīng)激水平降低,且細胞中Nrf-2 入核進一步增加,提示ECH 降低BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 氧化應(yīng)激可能與增強Nrf-2 核轉(zhuǎn)位有關(guān)。在正常生理狀態(tài)下,NF-κB 以非活性的形式被錨定在于細胞質(zhì)內(nèi),在外界如氧化應(yīng)激、感染和炎癥等刺激下,NF-κB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細胞核,激活NF-κB[12]。已有的研究[12-14]顯示,降低NF-κB活性可抑制機體多種組織炎癥。在本研究結(jié)果提示,ECH 減輕BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 炎癥反應(yīng),可能與其降低NF-κB p65核轉(zhuǎn)位有關(guān)。COX-2 是細胞炎癥反應(yīng)和凋亡的重要介導(dǎo)因子,在正常肺組織中幾乎不表達COX-2;而肺組織受到氧化應(yīng)激和致炎刺激時,COX-2 異常高表達,且高表達的COX-2 能加劇炎癥反應(yīng)和組織損傷[15-16]。在本研究中,COX-2 在 BLM 作用后上調(diào),而加入ECH 后的COX-2 的表達明顯降低,提示COX-2可能參與ECH 對BLM 誘導(dǎo)的HEPApiC 損傷和炎癥反應(yīng)的抑制作用。
Figure 2. ECH reduced BLM-induced apoptosis in HEPApiCs. A:Hoechst 33258 stained images(scale bar=20 μm);B and C:apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs BLM group.圖2 ECH可減少BLM誘導(dǎo)的HEPApiC凋亡
Figure 3. ECH reduced BLM-induced inflammation level in HEPApiCs. The secretion levels of IL-6(A),IL-1β(B)and TNF-α(C)in HEPApiCs of each group were detected by ELISA. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs BLM group.圖3 ECH可降低BLM誘導(dǎo)的HEPApiC的炎癥水平
Figure 4. ECH reduced BLM-induced oxidative stress level in HEPApiCs. A and B:results of ROS level(scale bar=20 μm);C:results of MDA level;D:results of SOD activity. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs BLM group.圖4 ECH可降低BLM誘導(dǎo)的HEPApiC氧化應(yīng)激水平
Figure 5. Effect of ECH on BLM-induced Nrf-2/NF-κB/COX-2 signaling pathway. A to C:the protein expression of NF-κB p65 in HEPApiCs was detected by Western blot;D to F:the protein expression of Nrf-2 in HEPApiCs was detected by Western blot;G and H:the protein expression of COX-2 in HEPApiCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs BLM group.圖5 ECH對BLM誘導(dǎo)的Nrf-2/NF-κB/COX-2信號通路的影響
綜上所述,本研究結(jié)果顯示,ECH 對BLM 誘導(dǎo)的肺上皮細胞的氧化損傷和炎癥反應(yīng)具有抑制作用,且能促進Nrf-2 入核和下調(diào)NF-κB/COX-2 信號活性。但本研究尚存在一定的局限性,比如未進行動物模型的相關(guān)研究,也未對細胞進行恢復(fù)實驗以驗證ECH 對BLM 誘導(dǎo)的肺上皮細胞的氧化損傷和炎癥反應(yīng)的確切機制,故ECH 抗BLM 誘導(dǎo)的肺泡炎的具有作用及其具體機制仍需進一步研究。