陳 楊， 林鵬程， 蘇珊珊， 周騰飛， 施強強， 董 年， 董 莉， 李玉蘋

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000）

急性肺損傷是臨床上常見的危及生命的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率和死亡率均很高，其特點表現(xiàn)為頑固性低氧、氣體交換受損、過度炎癥反應(yīng)和急性呼吸衰竭［1］。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)、新型抗菌藥物和器官功能支持技術(shù)等被廣泛應(yīng)用，但因其發(fā)病機制復(fù)雜，治療效果尚不理想。蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）是蛋白激酶家族中的經(jīng)典成員，其激活將觸發(fā)下游不同信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)化等，在肺內(nèi)炎癥和肺部腫瘤等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2-3］。近年來，研究顯示PKCα參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，例如，短暫性腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的發(fā)病與肺組織中PKCα mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加相關(guān)［4］。我們在前期預(yù)實驗中也觀察到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠和RAW264.7 細(xì)胞中PKCα的磷酸化水平均顯著上調(diào)?；诖?，我們猜測PKCα 是急性肺損傷潛在的治療靶點。此外，PKCα參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬及細(xì)胞焦亡過程，例如，在人胚胎腎細(xì)胞相關(guān)研究中，葡萄糖剝奪可誘導(dǎo)自噬水平上調(diào)，但抑制PKCα 表達(dá)后，葡萄糖剝奪未能誘導(dǎo)自噬水平上調(diào)［5］。空氣中懸浮顆粒物通過激活PKCα 促進口腔膠質(zhì)細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體形成、活化，從而促進炎癥反應(yīng)發(fā)生［6］。但 PKCα 對 LPS 觸發(fā)的急性肺損傷中細(xì)胞自噬及焦亡的調(diào)節(jié)作用尚未可知。因此，本實驗以LPS 構(gòu)建急性肺損傷體內(nèi)外模型，通過PKCα 特異性抑制劑 calphostin C 抑制 PKCα 后檢測細(xì)胞自噬及焦亡水平，探討PKCα在急性肺損傷中的調(diào)節(jié)機制。

材料和方法

1 材料

SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠（6～8 周齡，20～25 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證號為SXCK（京）2016-0011，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF 級實驗動物房。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 購自上海中科院細(xì)胞庫。LPS（O55：B5；L2880）和 calphostin C（C6303）購自 Sigma；PKCα（phospho S657）抗體［EPR1901（2）］（ab180848）購自Abcam；NLRP3 抗 體（D4D8T）、cleaved caspase-1（Asp296）抗體（E2G2I）、caspase-1 抗體（E2Z1C）、含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domian，ASC）/TMS1抗體（D2W8U）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）抗體、SQSTM1/p62 抗體、β-actin 抗體（13E5）和 GAPDH 抗體（D16H11）XP?購自CST；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo；ELISA試劑盒及RT-qPCR引物購自上海博蘊生物科技有限公司。

2 方法

2.1 小鼠模型 將45 只C57BL/6J 小鼠隨機分為空白（control）組、DMSO 組、DMSO+calphostin C 組、LPS組和LPS+DMSO+calphostin C 組，每組9 只。將calphostin C 溶于DMSO（1 g/L），用PBS 稀釋至0.015 g/L，按0.15 mg/kg 的劑量腹腔注射預(yù)處理4 h。4%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉后以靜脈留置針經(jīng)口氣管插管，接1 mL 針筒后以水柱隨呼吸上下浮動作為插管成功標(biāo)志。將LPS 以10 mg/kg 的劑量經(jīng)氣道滴入（將LPS 溶解于PBS 中，濃度10 g/L，其余組予等體積的PBS 氣道滴入）刺激24 h 后，安樂死小鼠，獲取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及肺組織標(biāo)本。

2.2 細(xì)胞模型 將RAW264.7 細(xì)胞分組如下：control 組、DMSO 組、DMSO+calphostin C 組、LPS 組和LPS+DMSO+calphostin C 組。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，6 孔板按照每孔8×105密度鋪板，12 孔板按每孔4×105密度鋪板，使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。次日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，長至80%～90%左右時，用calphostin C（100 nmol/L）預(yù)處理細(xì)胞2 h后予LPS（1 mg/L）刺激6 h及24 h，6 h后提取蛋白及RNA 檢測細(xì)胞焦亡水平，24 h 后提取蛋白檢測細(xì)胞自噬水平。

2.3 BALF 蛋白濃度及炎癥因子測定 BALF 樣本經(jīng)4 ℃、111.8×g離心后獲取上清液。采用BCA 法測定蛋白濃度。采用鼠相應(yīng)ELISA 試劑盒測定炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）濃度。

2.4 HE染色 經(jīng)留置針向全肺注入0.4 mL多聚甲醛，用細(xì)線結(jié)扎后將完整肺組織浸泡于多聚甲醛中固定，隨后石蠟包埋切片，脫蠟、水化處理，再經(jīng)蘇木素及伊紅染液染色后脫水封片，在顯微鏡下觀察并進行肺損傷病理分級評分（0～4 分制）：無損傷=0；損傷25%=1；損傷50%=2；損傷75%=3；彌漫性損傷=4。

2.5 免疫組化染色 取小鼠石蠟切片，脫蠟、水化、阻斷、抗原修復(fù)、封閉，5% BSA 室溫放置30 min，滴加適量LC3B、p62 和NLRP3 抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜。PBS 清洗3 次后，Ⅱ抗37℃孵育60 min。PBS 清洗后，滴加適量DAB 顯色液5～10 min，自來水沖洗5 min。中性樹脂封片后顯微鏡下觀察肺組織中相應(yīng)蛋白的表達(dá)。

2.6 Western blot 取上述不同實驗干預(yù)后的小鼠肺組織及RAW264.7細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解，4 ℃、20 913×g離心 10 min 提取上清液，使用 BCA 測定蛋白濃度。各組分別取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，快速封閉液室溫下封閉10 min，相應(yīng)Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜 10 min×3 次，Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，再用TBST 緩沖液洗膜10 min×3次，化學(xué)發(fā)光法顯影條帶。

2.7 RT-qPCR 按照Trizol 說明書提取上述不同實驗干預(yù)后的RAW264.7 細(xì)胞總RNA，分光光度法測定RNA 質(zhì)量和濃度。取總RNA 2 μg 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA 為模板進行real-time PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)以 2-ΔΔCt計算。引物（鼠源）序列如下：GAPDH 的上游引物序列為5′-CACGGCAAATTCAACGGCACAG-3′，下游引物序列為 5′-AGACACCAGTAGACTCCACGACATAC-3′；IL-1β的上游引物序列為5′-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3′，下游引物序列為5′-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3′；IL-18 的上游引物序列為 5′-AAGAAAGCCGCCTCAAACCTTCC-3′，下游引物序列為 5′-TTGACGCAAGAGTCTTCTGACATGG-3′；NLRP3的上游引物序列為5′-GGAGGAAGAAGAAGAGAGGAGAGGAG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CTTGAGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′；ASC 的上游引物序列為 5′-GGACGGAGTGCTGGATGCTTTG-3′，下游引物序列為 5′-CATCTTGTCTTGGCTGGTGGTCTC-3′；caspase-1 的上游引物序列為 5′-TGAATACAACCACTCGTACACGTCTTG-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CCAGATCCTCCAGCAGCAACTTC-3′。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制PKCα可減輕LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性肺損傷，減少BALF中炎癥因子分泌

肺組織HE 染色及病理分級評分顯示，LPS 組可見顯著的肺泡及間質(zhì)水腫、肺泡塌陷、炎癥細(xì)胞浸潤等（P＜0.01），而抑制PKCα 后肺組織病理學(xué)改變明顯好轉(zhuǎn)，肺損傷評分顯著降低（P＜0.01），見圖1A、B。此外，抑制PKCα可顯著降低BALF中蛋白濃度及IL-1β和TNF-α的分泌（P＜0.01），見圖1C～E。

2 抑制PKCα可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肺組織自噬水平

Western blot 及免疫組化結(jié)果顯示，LPS 能顯著誘導(dǎo)小鼠肺損傷中自噬相關(guān)蛋白LC3B 及p62 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01），而 calphostin C 預(yù)處理抑制PKCα 后能部分逆轉(zhuǎn)上升的 LC3B 及 p62 水平（P＜0.01），見圖2。

3 抑制PKCα可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肺組織焦亡水平

肺組織免疫組化結(jié)果顯示，與control 組相比，NLRP3 陽性染色程度在LPS 組更顯著（P＜0.01），而LPS+DMSO+calphostin C 組較 LPS 組顯著下降（P＜0.01），見圖3。

4 抑制PKCα 可降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬及焦亡水平

如圖4A 所示，與體內(nèi)Western blot 結(jié)果一致，PKCα 抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬水平相關(guān)蛋白LC3B 及p62 的上調(diào)（P＜0.05）。如圖4B 所示，LPS 組 NLRP3、C-caspase-1 和 ASC 蛋白水平較空白組顯著上調(diào)，而calphostin C 能抑制LPS 觸發(fā)的細(xì)胞焦亡（P＜0.01）。同樣，RT-qPCR 結(jié)果也顯示抑制PKCα 能降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體相關(guān)mRNA水平（P＜0.05），見圖4C。

討 論

Figure 1. Inhibition of PKCα attenuated LPS-triggered acute lung injury and secretion of inflammatory mediators in the BALF from C57BL/6J mice. A：histopathological analysis of lung tissues by HE staining（scale bar=100 μm）；B：severity of lung injury evaluated by semi-quantitative histological scoring；C：BALF protein levels evaluated by BCA method；D：the level of IL-1β in BALF examined by ELISA；E：the level of TNF-α in BALF examined by ELISA. Mean±SD. n=3；#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖1 抑制PKCα可減輕LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性肺損傷并減少BALF中炎癥因子分泌

急性肺損傷的主要病理生理機制為過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的氣血屏障功能破壞，繼而引發(fā)肺水腫及氣體交換障礙，其致病因素包括嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、中毒和休克等。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分，可激活機體固有免疫系統(tǒng)，引起炎癥瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)失控，是急性肺損傷常見誘發(fā)因素之一。由于LPS 攻擊模型方法簡單，且與臨床發(fā)病過程類似，故LPS 常用于構(gòu)建急性肺損傷動物或細(xì)胞模型［7］。已知PKCα 是經(jīng)典型激酶成員之一，可被炎癥因子、激素及神經(jīng)遞質(zhì)等激活，在肺損傷過程中細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。結(jié)合目前文獻(xiàn)報道細(xì)胞自噬及焦亡也參與急性肺損傷中的病理生理過程，本文擬深入研究PKCα 能否調(diào)節(jié)LPS 觸發(fā)的小鼠急性肺損傷中細(xì)胞自噬及焦亡過程。本實驗以10 mg/kg 的LPS 氣管內(nèi)滴注刺激C57BL/6J小鼠24 h成功構(gòu)建急性肺損傷模型，并以PKCα 特異性抑制劑calphostin C 在體內(nèi)外抑制PKCα 活化后檢測細(xì)胞自噬及焦亡水平。為評估肺屏障功能及肺內(nèi)炎癥，實驗檢測了BALF中蛋白濃度及炎癥介質(zhì)IL-1β和TNFα水平。與空白對照組相比，LPS氣管內(nèi)滴入可明顯破壞小鼠肺內(nèi)皮屏障功能造成肺泡內(nèi)蛋白質(zhì)滲漏，同時誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)發(fā)生，而抑制PKCα 后肺損傷病理學(xué)改變顯著改善，肺內(nèi)炎癥反應(yīng)減輕。本實驗證實抑制PKCα 在小鼠急性肺損傷中發(fā)揮了抗炎保護效應(yīng)。

針對PKCα 對LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺損傷中細(xì)胞自噬過程的調(diào)節(jié)，我們體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示LPS 刺激下自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，而抑制PKCα后可逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的自噬流變化。已知自噬是細(xì)胞吞噬各種病原體以及胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器，經(jīng)由溶酶體被降解的分解代謝過程。這個過程主要包括吞噬細(xì)胞膜誘導(dǎo)、吞噬泡形成、自噬體延伸及成熟、吞噬-溶酶體復(fù)合體融合、吞噬物降解［8］。自噬相關(guān)蛋白LC3B-I 向LC3B-II 的轉(zhuǎn)化水平可作為判斷自噬體形成的標(biāo)志物，與自噬活性密切相關(guān)。p62是一種重要的自噬接頭蛋白，可與LC3B-II 結(jié)合，將泛素化的蛋白聚集體或者其它細(xì)胞組分募集到自噬小體中，然后在自噬溶酶體內(nèi)一起被降解［9］。在正常生理條件下，自噬發(fā)生可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在應(yīng)激或損傷情況下（如營養(yǎng)剝奪、饑餓和創(chuàng)傷），自噬主要作為細(xì)胞生存的適應(yīng)防御機制而存在。但某些情況下，自噬水平低下或過度或者紊亂均可引發(fā)細(xì)胞死亡和組織損傷等［10］。在本研究中，自噬水平在LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中顯著上調(diào)，但其作為適應(yīng)性反應(yīng)或是致病機制加重?fù)p傷尚未明確。因此，對LPS誘導(dǎo)的自噬水平進行干預(yù)，深入研究自噬穩(wěn)態(tài)在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。另外，關(guān)于PKCα 信號通路調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)報道也是相互矛盾。粉防己堿是一種新型PKCα抑制劑，通過抑制PKCα 活性誘導(dǎo)自噬發(fā)生［11］。而我們的研究顯示LPS 誘導(dǎo)小鼠肺組織及RAW264.7 細(xì)胞中LC3B-II/I水平較對照組顯著增加，抑制PKCα后能在體內(nèi)外部分逆轉(zhuǎn)這些自噬流變化，與Choi 等［5］報道的藥物抑制 PKCα 以及 siRNA 轉(zhuǎn)染 PKCα 可以有效地阻止葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的LC3B-II 水平的增加結(jié)果相似。此外，本實驗結(jié)果還顯示LPS 誘導(dǎo)下p62 蛋白水平升高，與先前多項研究觀點一致［12-13］，我們認(rèn)為p62 上調(diào)可能是自噬流紊亂過程，即自噬體雖然形成，但自噬降解過程受阻導(dǎo)致自噬體積累。積聚的自噬體被擠出胞外引起促炎反應(yīng)從而加重機體炎性損傷。我們的研究結(jié)果表明在LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中自噬流發(fā)生紊亂，而PKCα 參與了該自噬流的調(diào)控過程。

Figure 2. Inhibition of PKCα reversed LPS-induced autophagy in lung tissue of C57BL/6J mice. A：Western blot was used to observe the protein levels of p-PKCα，LC3B and p62；B：immunohistochemical analysis of the expression of LC3B and p62（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3 to 6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖2 抑制PKCα可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肺組織自噬水平

Figure 3. Inhibition of PKCα reversed LPS-triggered pyroptosis in lung tissue of C57BL/6J mice（immunohistochemical staining for NLRP3，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖3 抑制PKCα可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肺組織焦亡水平

目前多項研究提示細(xì)胞焦亡是促進急性肺損傷中過度炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，干預(yù)細(xì)胞焦亡可顯著改善肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)。鑒于細(xì)胞焦亡主要發(fā)生于巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞在急性肺損傷發(fā)病的過度炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用，我們采用了LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞建立體外模型進行驗證。NLRP3炎癥小體是促進巨噬細(xì)胞焦亡啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是由 NLRP3、pro-caspase-1 和 ASC 組裝成的復(fù)合體。該復(fù)合體在識別病原體相關(guān)分子或危險相關(guān)分子后激活caspase-1，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜小孔形成，最終細(xì)胞腫脹破裂并釋放IL-1β 和IL-18 等炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)［14-15］。例如，在光氣誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠模型中NLRP3 炎癥小體形成及活化，通過抑制 NLRP3 或 caspase-1 表達(dá)，下調(diào)了 IL-1β 等炎癥因子釋放水平，有效改善了肺損傷［16］。另外，LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷中，干擾素基因刺激蛋白活化NLRP3 炎癥體而觸發(fā)細(xì)胞焦亡是IL-1β 及IL-18 等炎癥因子過度釋放的重要病因［17］。與上述結(jié)果相似，本研究也證實在LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中NLRP3炎癥小體明顯活化，細(xì)胞焦亡在急性肺損傷過度炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要誘導(dǎo)作用。此外，既往研究已表明PKCα 與NLRP3 炎癥小體形成活化關(guān)系密切。在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞，磷酸化的PKCα 是介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體形成的必要因子，抑制PKCα 表達(dá)明顯抑制了NLRP3 形成及巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)［18］?；诖?，我們對PKCα 在LPS觸發(fā)的小鼠肺損傷中細(xì)胞焦亡的調(diào)節(jié)機制做了初步探索。在體內(nèi)外實驗?zāi)Ｐ椭?，我們觀察到calphostin C 抑制PKCα 表達(dá)后可顯著逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡水平。結(jié)合以上結(jié)果，我們率先闡明在LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中，抑制PKCα后的抗炎保護效應(yīng)與其抑制細(xì)胞焦亡過程存在密切聯(lián)系。PKCα-NLRP3 炎癥小體通路參與了LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的病理生理過程。

本研究仍存在一些不足之處：首先，在體外研究中，我們只采用了單一的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞進行驗證，未來我們將分離原代巨噬細(xì)胞、原代肺泡上皮及內(nèi)皮細(xì)胞等，以更全面嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕嵌壬钊胙芯?；其次，我們發(fā)現(xiàn)了PKCα 抑制分別對LPS誘導(dǎo)的自噬及焦亡水平所產(chǎn)生的影響，但尚未對自噬及焦亡靶點進行干預(yù)，對兩種之間的聯(lián)系，以及PKCα 在其中的調(diào)節(jié)尚未深入探索。既往文獻(xiàn)表明自噬及焦亡之間確實存在著相關(guān)性。例如，在創(chuàng)傷性腦損傷中，自噬激活能下調(diào)IL13/IL-13Rα1 的表達(dá)，抑制JAK-1/STAT-1信號通路，從而抑制細(xì)胞焦亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［19］。在動脈粥樣硬化的體外巨噬細(xì)胞模型中，電刺激激活的自噬能抑制ROS 的產(chǎn)生，從而減少NLRP3活化抑制細(xì)胞焦亡所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［20］。因此，PKCα-自噬/焦亡軸在急性肺損傷中的潛在調(diào)節(jié)機制是一個值得探索的新方向。

Figure 4. Inhibition of PKCα reversed LPS-induced autophagy and pyroptosis in macrophages. A：the protein levels of p-PKCα，p62 and LC3B measured by Western blot；B：the protein levels of p-PKCα，NLRP3，cleaved caspase-1（C-caspase-1），caspase-1 and ASC measured by Western blot；C：the mRNA levels of IL-1β，IL-18，NLRP3，caspase-1 and ASC evaluated by RT-qPCR. Mean±SD. n=3 to 6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖4 抑制PKCα可降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬及焦亡水平

綜上所述，本研究在體內(nèi)外證實抑制PKCα能降低LPS 觸發(fā)的細(xì)胞自噬及焦亡水平，從而減輕C57BL/6J小鼠肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)，對PKCα在LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中的調(diào)節(jié)機制做了初步探索。