龐青民， 趙欲曉， 邵素菊， 李鴻章， 王承惠△

（1鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院針灸理療科，河南鄭州450000；2河南邵氏針灸流派傳承工作室，河南鄭州450008；3河南省中醫(yī)院康復(fù)科，河南鄭州450002）

腦卒中中90%患者出現(xiàn)偏癱性肢體痙攣，屬最常見的肢體功能障礙，因痙攣導(dǎo)致腦卒中不能獨立生活的患者達70%～80%，且常規(guī)步態(tài)康復(fù)很難使患者恢復(fù)如初［1］，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前西藥治療腦卒中后痙攣的主要方法是改變神經(jīng)遞質(zhì)含量和功能，雖能改善痙攣狀態(tài)，但卻不能恢復(fù)肌張力，效果不明顯［2］。中醫(yī)認(rèn)為腦絡(luò)淤阻是腦卒中后痙攣的主要原因，而針灸可調(diào)整營衛(wèi)氣血，使陰陽平衡，臟腑調(diào)和［3］。醒腦開竅針刺法作為治療腦卒中后痙攣針刺方法之一，具有醒腦開竅、疏經(jīng)通絡(luò)、滋肝補腎等作用，可促進大腦生理功能逐漸恢復(fù)，可改善元神之府、開竅啟閉［4］，是治療腦卒中后痙攣的可靠方法，且效果明顯，但其作用機制尚需進一步研究。

已知興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體2（excitatory amino acid transporter 2，EAAT2）長期損傷會促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可介導(dǎo)調(diào)控EAAT2，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)功能［5-6］，推測醒腦開竅針刺法可能調(diào)控mTOR-EAAT2通路發(fā)揮作用。因此，本研究建立腦卒中后痙攣大鼠模型，用醒腦開竅針刺法治療后觀察對神經(jīng)遞質(zhì)的影響，初步探討其機制，以期為臨床上醒腦開竅針刺法治療腦卒中后痙攣提供參考依據(jù)。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康 SPF 級 SD 大鼠，8 周齡，體重（220±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0011。動物實驗中心的溫度為（24±1）℃、濕度（60±5）%、12 h/12 h（光照/黑暗），室內(nèi)通風(fēng)良好，定期更換墊料，暫養(yǎng)1周進行實驗。本實驗經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過。

1.2 試劑 mTOR 抑制劑雷帕霉素（Gene Operation）；N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體（北京百靈威科技有限公司）；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、天門冬氨酸（D-aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）和甘氨酸（glycine，Gly）儲備液（Sigma）；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA；濟南泛諾化工有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 儀器 腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號69100）；高效液相色譜儀（Aupos Scientific，型號 APS-8036）；實時熒光定量 PCR（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）儀（賽默飛世爾，型號7500）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號Tanon3500）。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立 參考文獻［7］采用改良的大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓法+內(nèi)囊注射NMDA 受體法制作腦卒中后痙攣模型。大鼠麻醉后，沿頸部正中偏右切口、暴露出右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)并鈍性分離，再依次向上暴露頸總動脈分叉、頸內(nèi)動脈與頸外動脈，分別結(jié)扎頸總動脈遠心端，頸內(nèi)動脈、頸外動脈近心端，動脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)動脈；離頸總動脈分叉膨大5 mm 處剪一小切口，栓線經(jīng)切口插入頸內(nèi)動脈，稍感阻力停止插線（深度18～20 mm），松開動脈夾，頸內(nèi)動脈近心端和栓線一起結(jié)扎，縫合切口。大鼠清醒后Zea Longa 評分為1～3 分的大鼠第2 天行內(nèi)囊注射NMDA 受體法［8］。大鼠俯臥固定大鼠腦立體定位儀上，沿顱頂矢狀縫作縱行切口，暴露右側(cè)頂骨和額骨交界骨縫，按《大鼠立體定位圖譜》確定內(nèi)囊位置，前囟后1.4 mm、矢狀縫右側(cè)2.4 mm，牙科鉆鉆直徑約2 mm 小孔，微量注射器垂直插入7 mm 緩慢注射5 μL NMDA 受體，注射速度 1 μL/min，注射完畢后拔出微量注射器，止血消毒、逐層縫合切口。大鼠蘇醒后，將 Ashworth 肌張力評分≥1 分，Zea Longa 評分 1～3分視為模型建立成功。術(shù)后均注射青霉素、速尿以抗感染、防腦水腫；術(shù)后正常單籠飼養(yǎng)。

2.2 實驗設(shè)計與分組 實驗分為假手術(shù)（sham operation）組、模型（model）組、針刺（acupuncture）組、非穴位（non acupoint）組和針刺+抑制劑（acupuncture tinhibitor）組，每組10 只大鼠。假手術(shù)組僅暴露出右側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)后縫合，除假手術(shù)組外其余各組建立腦卒中后痙攣模型。造模后，假手術(shù)組和模型組不進行任何干預(yù)；針刺組參照郭義主編《實驗針灸學(xué)實驗指導(dǎo)》［9］，并根據(jù)華興邦等［10］研究的大鼠穴位圖譜進行大鼠穴位定位，利用醒腦開竅針刺法［11］進行針刺處理。簡言之，首先選取穴位為雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”、“水溝”和“內(nèi)關(guān)”穴在大鼠前肢內(nèi)側(cè)距腕橫紋上3～4 mm 尺橈骨縫間，直刺進針捻轉(zhuǎn)提瀉法1 min，留針30 min，并利用電針儀刺激，電針刺激強度為3 mA，頻率2 Hz；繼續(xù)刺“水溝”穴，“水溝”穴在大鼠鼻中隔下部，向上斜刺入3 mm，施雀啄手法刺激10 次，每次 30 min，刺激強度為 3 mA，頻率 2 Hz，每天1 次，連續(xù)5 d；非穴位組在大鼠雙脅下非穴位處（共2 處）做相同處理；針刺+抑制劑組在針刺組基礎(chǔ)上腹腔注射2 mg·kg-1·d-1雷帕霉素。

2.3 神經(jīng)功能的檢測指標(biāo)與方法 （1）神經(jīng)功能評分：Zea Longa 評分法評價造模后和實驗結(jié)束后大鼠神經(jīng)損傷程度。無神經(jīng)損傷癥狀，活動正常-0 分；不能完全伸展對側(cè)前爪，輕微神經(jīng)損傷-1 分；爬行時偏癱側(cè)旋轉(zhuǎn)，重度神經(jīng)損傷-2 分；行走時對側(cè)傾倒，重度神經(jīng)損傷-3 分；不能自發(fā)行走，意識下降甚至喪失-4 分，死亡-5 分。（2）肌張力評分：改良 Ashworth 肌張力評分評價造模后和實驗結(jié)束后大鼠肌張力程度。大鼠活動自如，無肌張力增高-0 級（0 分）；抓握中被動屈伸至最后有小的阻力，肌張力輕度增加-1級（1分）；抓握至一半關(guān)節(jié)活動度以上有輕度阻力增加，肌張力輕度增加-1+級（1.5分）；肌張力在大部分關(guān)節(jié)活動度中都有較大增加，但肢體被動運動容易-2 級（2 分）；被動活動困難，肌張力明顯增高-3 級（3分）；強直性屈曲或伸直，受累部分肢體-4級（4分）。

2.4 OPA 柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）熒光法測定大腦皮層GABA、Gly、Glu 和 Asp 的含量 大鼠肌張力檢測后迅速斷頭，冰上快速操作取腦，部分置于-80 ℃冰箱保存，部分大腦皮層組織按1∶9 添加生理鹽水，冰上手動勻漿，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清0.5 mL 添加1 mL 高氯酸（0.4 mol/L）、50 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液3 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液0.5 μL 添加1 mL 碳酸鉀緩沖溶液（2 mol/L）、5 mL 碳酸鉀緩沖溶液（0.1 mol/L）10 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液按衍生化反應(yīng)和色譜條件洗脫。同時配制GABA、Gly、Glu 和Asp 對照貯備液，高效液相色譜儀以流動相磷酸二氫鉀緩沖液（0.1 mol/L、pH6.0）∶甲醇∶乙腈（6∶3∶1），0.45 μm 孔徑濾膜過濾，脫氣15 min，流速1.0 mL/min，熒光檢測發(fā)射波長455 nm、激發(fā)波長357 nm。各氨基酸同內(nèi)標(biāo)的峰面積比值和各自濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定待測氨基酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，求出待測樣品中氨基酸濃度。

2.5 RT-qPCR 檢 測 大 腦 皮 層 mTOR 和 EAAT2 的mRNA 水平 -80 ℃冰箱中取部分大腦皮層組織，Trizol 法提取總RNA，cDNA 第1 條鏈試劑盒合成cDNA，RT-qPCR 法檢測大腦皮層中 mTOR 和 EAAT2 的mRNA 水平。mTOR 的上游引物序列為5’-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3’，下游引物序列為 5’ -GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3’ ；EAAT2 的上游引物序列為5’-ATGCTCCTCATTCTCACAG-3’，下游引物序列為 5’-CTACATTGACCGAAGTTCTC-3’；β-actin 的上游引物：序列為 5’-GCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列為 5’-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3’。20 μL 反 應(yīng) 體 系 為 50 μg/L cDNA 1 μL、2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為 94 ℃、90 s、95 ℃32 s（mTOR：60 ℃、35 s、EAAT2：61℃、40 s），40個 循 環(huán) 。 2-ΔΔCT法 計 算 大 腦 皮 層 mTOR、EAAT2 的mRNA表達水平。

2.6 Western blot 檢測大腦皮層 mTOR 和 EAAT2 的蛋白水平 -80 ℃冰箱中取部分大腦皮層組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，凝膠電泳分離蛋白、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST 清洗 3 次，分別加入對應(yīng)的 抗 mTOR、EAAT2 和 β-actin 抗體，4 ℃過夜孵育；PBST 清洗 3次，時間分別為5 min、10 min 和20 min；加入對應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h，顯色、蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照、ImageJ 定量分析灰度值。目的蛋白水平相對值=目的蛋白灰度值/對應(yīng)內(nèi)參蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析。偏態(tài)數(shù)據(jù)以中位數(shù)（median，M）及四分位數(shù)間距（quartile range，QR）［M（QR）］表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗，多組間比較采用 Kruskai-Wallis H 檢驗；正態(tài)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 醒腦開竅針刺法對大鼠神經(jīng)功能評分和肌張力評分的影響

造模后，與假手術(shù)組相比，模型組、針刺組、非穴位組和針刺+抑制劑組神經(jīng)功能評分和肌張力評分升高（P＜0.05）。實驗結(jié)束后，與假手術(shù)組相比，模型組、針刺組、非穴位組和針刺+抑制劑組神經(jīng)功能評分和肌張力評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組神經(jīng)功能評分和肌張力評分及針刺+抑制劑組肌張力評分降低（P＜0.05）；與針刺組相比，非穴位組和針刺+抑制劑組神經(jīng)功能評分和肌張力評分升高（P＜0.05）；與非穴位組相比，針刺+抑制劑組肌張力評分降低（P＜0.05）。與造模后相比，實驗結(jié)束后針刺組神經(jīng)功能評分、肌張力評分，針刺+抑制劑組肌張力評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 5組大鼠神經(jīng)功能評分和肌張力評分比較Table 1. Comparison of neurological function score and muscle tension score of the rats in the 5 groups［Median（QR）. n=10］

2 醒腦開竅針刺法對大鼠大腦皮層GABA、Gly、Glu和Asp含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層GABA 和Gly 含量降低，Glu 和Asp含量升高（P＜0.05），針刺組大腦皮層Gly 含量降低（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組大腦皮層GABA 和Gly 含量升高，Glu 和Asp 含量降低（P＜0.05），針刺+抑制劑組大腦皮層GABA 含量升高，Glu 和Asp 含量降低（P＜0.05）；與針刺組相比，非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層GABA 和Gly 含量降低，Glu 和Asp含量升高（P＜0.05）；與非穴位組相比，針刺+抑制劑組大腦皮層 GABA 和 Gly 含量升高，Glu、Asp 含量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 5組大鼠大腦皮層GABA、Gly、Glu和Asp含量的比較Table 2. Comparison of the contents of GABA，Gly，Glu and Asp in cerebral cortex of the rats in the 5 groups（μmol/L. Mean±SD. n=10）

3 醒腦開竅針刺法對大鼠大腦皮層mTOR 和EAAT2 mRNA和蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR 和EAAT2的mRNA 水平及針刺組大腦皮層mTOR 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組和針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR 和 EAAT2 的 mRNA 水平升高（P＜0.05）；與針刺組相比，非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR 和 EAAT2 的 mRNA 水平降低（P＜0.05）；與非穴位組相比，針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR、EAAT2的mRNA水平升高（P＜0.05）。見圖1。

與假手術(shù)組相比，模型組、針刺組、非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR 和EAAT2 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組大腦皮層mTOR、EAAT2 的蛋白水平，針刺+抑制劑組大腦皮層EAAT2 的蛋白水平升高（P＜0.05）；與針刺組相比，非穴位組和針刺+抑制劑組大腦皮層mTOR、EAAT2 的蛋白水平降低（P＜0.05）；與非穴位組相比，針刺+抑制劑組大腦皮層EAAT2 的蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖1。

Figure 1. Relative mRNA and protein levels of mTOR and EAAT2 in cerebral cortex of the rats in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs sham operation group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs acupuncture group；&P＜0.05 vs non-acupoint group.圖1 5組大鼠大腦皮層mTOR和EAAT2蛋白和mRNA水平的比較

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能評分、肌張力評分在造模后模型組、針刺組、非穴位組、針刺+抑制劑組均出現(xiàn)升高現(xiàn)象，提示腦卒中后痙攣模型制作成功。醒腦開竅針刺法治療后神經(jīng)功能評分、肌張力評分均有所下降，提示醒腦開竅針刺法可緩解腦卒中后痙攣現(xiàn)象，實現(xiàn)對大鼠的保護，但機制尚需進一步研究。腦卒中后痙攣會誘發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)功能異常，特別是氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)失常。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)分為興奮性氨基酸和抑制性氨基酸，抑制性氨基酸包括GABA和Gly等，興奮性氨基酸包括Glu和Asp等，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)相對降低或興奮性神經(jīng)遞質(zhì)相對增加均會加劇痙攣［12］。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)代表，由興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu 在Glu 脫羧酶作用下脫去羧基而成，可與GABA 受體結(jié)合，從而抑制鈣離子流入前突觸，抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，進而緩解痙攣［13］。Gly 屬突觸后抑制，若Gly 受到拮抗則會引起強烈的痙攣反應(yīng)［14］。Glu 屬哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，過度刺激Glu 會造成神經(jīng)中毒，可參與包括腦卒中、阿爾茨海默癥、癲癇癥、帕金森綜合征和抑郁癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制［15］。正常情況下，末梢去極化后，存在于末梢突觸囊泡中的Glu 和Asp 釋放到突觸間隙，與突觸后膜特異性受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)，可產(chǎn)生興奮性突觸后膜；若腦損傷，主要表現(xiàn)為鈉離子內(nèi)流，導(dǎo)致腦部能量供應(yīng)不足，Glu 和Asp 釋放到突觸間隙后，重新攝入受到抑制，在細胞外大量堆積，造成細胞毒性［16］。在本研究中，醒腦開竅針刺法治療后大鼠大腦皮層GABA 和Gly 含量升高，Glu 和Asp 含量降低，提示醒腦開竅針刺法不僅能夠抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的表達，促進興奮性神經(jīng)遞質(zhì)進入細胞中，而且促進抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，進而抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，緩解痙攣。

EAAT2 主要在星形膠質(zhì)細胞中表達，少量在神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞中，含有八個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個具有調(diào)節(jié)作用的3’-UTR 區(qū)，在嚙齒動物中又稱Glu 轉(zhuǎn)運體1，作為鈉離子依賴的Glu 轉(zhuǎn)運蛋白，主要負(fù)責(zé)攝取突觸間隙中Glu 進而清除，維持細胞外Glu穩(wěn)定，降低突觸中Glu在突觸間隙的積累造成的神經(jīng)元興奮毒性作用［17］。而mTOR 水平的改變影響EAAT2 的水平與功能［18］。mTOR 作為能量代謝相關(guān)經(jīng)典通路，是機體能量感知的關(guān)鍵分子，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在下丘腦、海馬、大腦皮層中廣泛表達，與機體的能量狀態(tài)關(guān)系密切，參與突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道、軸突芽生等多種分子過程［19］。在本研究中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦皮層中mTOR 和EAAT2的mRNA 和蛋白水平下降，提示 mTOR 表達下降導(dǎo)致 mTOR 對 EAAT2 的作用降低，EAAT2 清除Glu 功能減弱，促進神經(jīng)元毒性。針刺組腦卒中后痙攣大鼠大腦皮層中mTOR 和EAAT2 mRNA 和蛋白表達水平上升，提示經(jīng)醒腦開竅針刺法治療后可減輕大腦皮層mTOR 下降情況，增加清除Glu 功能，促進神經(jīng)元毒性的分解，從而實現(xiàn)對疾病的緩解。而在醒腦開竅針刺法基礎(chǔ)上添加mTOR 抑制劑雷帕霉素后，mTOR、EAAT2 的 mRNA和蛋白表達水平下降，GABA 和 Gly 含量下降，Glu 和Asp 含量升高，提示mTOR 抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)醒腦開竅針刺法，加重疾病，醒腦開竅針刺法能夠激活mTOREAAT2 通路降低 Glu 和 Asp 含量，升高 GABA 和 Gly含量，降低突觸間隙造成的神經(jīng)元興奮毒性積累過程，實現(xiàn)對腦卒中后痙攣的緩解。

綜上所述，醒腦開竅針刺法可通過激活mTOREAAT2 通路調(diào)控腦卒中后痙攣大鼠神經(jīng)遞質(zhì)，實現(xiàn)對疾病的緩解，為臨床上醒腦開竅針刺法治療腦卒中后痙攣提供一定理論依據(jù)，且本文首次發(fā)現(xiàn)mTOR-EAAT2 通路對 Asp、GABA 和 Gly 含量亦有調(diào)控作用，但屬直接還是間接調(diào)控需進一步研究。