黃麗莉，夏可輝，唐榮，鄭林媚

?？谑袐D幼保健院 1產(chǎn)科，2檢驗科（海南?？?70102）；海南省人民醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 3肝膽外科，4產(chǎn)科（海南海口570102）

子癇前期是一種與高血壓和蛋白尿有關(guān)的妊娠特有疾病，是導(dǎo)致孕婦及圍生兒患病率及病死率高的重要原因之一。據(jù)估計，子癇前期在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為2% ～8%，在我國發(fā)病率為9.4% ～10.4%［1－2］。近年來，盡管對子癇前期有了較為深入的認(rèn)識，但其具體發(fā)病原因尚未明確。由于子癇前期的異質(zhì)性，基因遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)等多種因素可能影響個體的易感性［3］。研究表明，在子癇前期母體中出生的男性，其所生的女性后代發(fā)生子癇前期的風(fēng)險較高［4］，提示遺傳因素在子癇前期的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。近年來，子癇前期的表觀遺傳發(fā)病機(jī)制受到越來越多的重視。大量研究已經(jīng)證實(shí)微小RNA（microRNA，miRNA）等表觀遺傳學(xué)變化參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展［5－6］。miRNAs是一類非編碼RNA（20～24個核苷酸），在細(xì)胞凋亡、血管生成、生長、增殖和分化等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，并通過對靶向mRNA的調(diào)控影響基因表達(dá)［7］。miR－146a是參與炎癥過程中［8］最重要的miRNA之一。miR－149參與血管損傷應(yīng)答過程，可調(diào)控循環(huán)系統(tǒng)血栓形成或炎癥信號通路等相關(guān)基因表達(dá)［9－10］。rs2910164和rs2292832分別位于miR－146a和miR－149前體分子中，上述兩個位點(diǎn)可能影響對應(yīng)miRNA分子的成熟或其與靶基因核心序列的結(jié)合，最終誘發(fā)其調(diào)控靶基因功能紊亂。已有研究報道m(xù)iR－146a和miR－149多態(tài)性與癌癥［11］、缺血性中風(fēng)（IS）［12］和心血管疾病等［13］有關(guān)，但miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832多態(tài)性對子癇前期影響的研究甚少。本研究旨在探討miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832基因多態(tài)性與子癇前期的遺傳易感性，從分子水平為子癇前期的病因?qū)W提供實(shí)驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意選取2016年7月至2018年7月在海口市婦幼保健院收治的子癇前期患者112例（病例組），其中輕度子癇前期患者70例（輕度組），重度子癇前期患者42例（重度組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合ACOG妊娠期高血壓疾病指南（2015）中的標(biāo)準(zhǔn)：妊娠20周后血壓≥140／90 mmHg，蛋白尿≥0.3 g／24 h（或試紙結(jié)果≥1＋）。重度子癇前期表現(xiàn)為收縮壓≥160 mmHg或舒張壓≥110 mmHg或重度蛋白尿（24 h尿標(biāo)本中蛋白≥5 g）。早發(fā)型子癇前期通常被定義為妊娠34周之前發(fā)生的疾病。（2）均為單胎妊娠，分娩方式均為子宮下段剖宮產(chǎn)術(shù)。（3）患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：胎兒畸形、肝功能障礙、腎臟疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、慢性高血壓和心臟病等疾病。同時選取正常妊娠孕婦（分娩方式為剖宮產(chǎn)）105例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 收集了納入標(biāo)準(zhǔn)的PE患者和正常妊娠孕婦的外周靜脈血，使用人類基因組DNA提取試劑盒提取DNA，放置于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR－RFLP測基因型 引物序列、退火溫度、限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物長度見表1［14］。反應(yīng)條件：（1）95℃預(yù)變性6 min；（2）95℃變性45 s；（3）在相應(yīng)的溫度下退火45 s；（4）72℃延伸45 s；（5）最終在72℃擴(kuò)展6 min。上述過程持續(xù)35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物上樣于3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳，并用DNA凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用Fisher精確測驗和Student′s t檢驗比較病例組和對照組的臨床特征。采用χ2檢驗對對照組內(nèi)基因位點(diǎn)的平衡性進(jìn)行檢驗，若P＞0.05，則說明滿足哈迪－溫伯格平衡，相反，若P＜0.05，則表明所選取的樣本未達(dá)到隨機(jī)平衡狀態(tài)，不具有群體代表性。在logistic回歸分析的基礎(chǔ)上，采用優(yōu)勢比（OR）和95%置信區(qū)間（95% CI）測定子癇前期miRNA基因型之間的關(guān)系。采用logistic回歸分析方法分析顯性和隱性基因型中miRNA多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期組和正常妊娠組患者的臨床資料 比較兩組的年齡和初產(chǎn)婦所占比例，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而子癇前期組中除收縮壓和舒張壓高于正常妊娠組（P＜0.05），孕周和新生兒出生體重均明顯低于正常妊娠組（P＜0.01）。見表2。

表2 子癇前期組和正常妊娠組一般情況比較 ±s

表2 子癇前期組和正常妊娠組一般情況比較 ±s

變量 子癇前期組（n＝112）對照組（n＝105） P值年齡（歲）28.2±5.9 31.5±4.6 ＞0.05孕周（d） 247±11 270±13 ＜0.01出生體重（g） 2 614±198 3 109±215 ＜0.01收縮壓（mmHg） 155±11 104±15 ＜0.05舒張壓（mmHg） 99±10 72±13 ＜0.05初產(chǎn)婦［例（%）］ 53（47） 47（45）＞0.05

2.2 miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832多態(tài)性與子癇前期易感性的關(guān)系 miR－146a rs2910164位點(diǎn)基因型GG、GC和CC在子癇前期組和對照組中的頻率分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。rs2910164位點(diǎn)多態(tài)性在等位基因型（P＝0.038）和顯性基因型（P＝0.039）中與子癇前期的易感性有關(guān)。然而，在隱性基因型中沒有發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)與子癇前期易感性之間的相關(guān)性（P＝0.7）。miR－149rs2292832位點(diǎn)基因型或等位基因在子癇前期組和正常妊娠組中頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832位點(diǎn)基因型和 等位基因在兩組中的頻率分布

另外，miR－146a rs2910164基因多態(tài)性分析結(jié)果顯示，重度組患者的GC和CC基因型明顯高于對照組（P＝0.008；P＝0.026）。此外，miR－146a rs2910164多態(tài)性在顯性基因型與重度子癇前期的易感性相關(guān)（P＝0.003），但未發(fā)現(xiàn)miR－146a rs2910164多態(tài)性與輕度子癇前期有相關(guān)性。miR－149 rs2292832基因多態(tài)性分析結(jié)果顯示在不同的遺傳基因型中均未見提高重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險（P＞0.05），rs2292832多態(tài)性與子癇前期嚴(yán)重程度無相關(guān)性。見表4。

表4 對照組、輕度組和重度組miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832基因型頻率分布情況

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的異質(zhì)性疾病。除環(huán)境因素外，母體和胎兒（胎盤）遺傳因素在子癇前期易感性中發(fā)揮著重要作用［15］。母體在妊娠期間表達(dá)大量具有特異性的miRNA，且miRNA表達(dá)量在不同孕周會發(fā)生相應(yīng)的變化。有研究顯示子癇前期患者的胎盤組織中可檢測到miRNA表達(dá)的變化［16－17］。miRNA對血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡、胚胎發(fā)育等具有重要的調(diào)控作用，而這些生物學(xué)過程的異常均參與了子癇前期的發(fā)病機(jī)制。此外，已有研究證實(shí)miRNA在激活胎盤免疫效應(yīng)和調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力等幾個過程中發(fā)揮一定的作用，而miRNA的功能受破壞或表達(dá)異常都有可能影響相關(guān)靶基因的表達(dá)［18］。

在正常妊娠中，多種miRNA在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括miR－17－92簇、miR－146a、miR－155和miR－223，并且這些miRNA已被證實(shí)在子癇前期中表達(dá)失調(diào)［19］。有學(xué)者研究證實(shí)了miR－146a在調(diào)節(jié)Toll樣受體（TLR）信號通路和炎癥細(xì)胞因子機(jī)制中發(fā)揮重要作用［8］。目前miR－146a已作為產(chǎn)后心肌?。?0］的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與C等位基因相比，子癇前期患者的G等位基因頻率更高。Abo－Elmatty等［21］研究顯示妊娠期糖尿病合并子癇前期的患者miR－146a rs2910164位點(diǎn)等位基因C的頻率更高。本研究還發(fā)現(xiàn)miR－146a rs2910164位點(diǎn)在等位基因型和顯性基因型中均與子癇前期中存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，此外，在顯性基因型和隱性基因型中，miR－146a rs2910164多態(tài)性與重度子癇前期的易感性相關(guān)，說明此位點(diǎn)可能參與此病的發(fā)生、發(fā)展過程。因此miR－146a在炎癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制中的作用可以部分解釋其對子癇前期的可能影響。本研究結(jié)果與Salimi等［22］的研究結(jié)果一致。與Maharaj等［23］研究結(jié)果不同，該結(jié)果雖未證實(shí)miR－146a rs2910164多態(tài)性與子癇前期易感性之間存在關(guān)聯(lián)，但發(fā)現(xiàn)GC／CC基因型可能會降低重度子癇前期的發(fā)病風(fēng)險。造成各研究結(jié)果不同的可能原因與樣本量小或納入人群的地域、遺傳背景、環(huán)境等因素差異有關(guān)。

MiR－149是另一種miRNA，在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了2種成熟的miRNA亞型（miR－149－5p和149－3p）。人miR－149基因位于2q37.3，僅包含一個外顯子。miR－149－5p可以預(yù)測多種涉及腫瘤進(jìn)展所必需的相關(guān)因子的靶向基因，包括胰島素、趨化因子和MAPK信號通路。有證據(jù)表明，miR－149可影響細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展。然而，miR－149在多種細(xì)胞［24］中可能發(fā)揮雙重作用。在胎盤的發(fā)育［25］和癌癥［26］的進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)了一些相似之處，包括快速增長、侵襲性生長和活躍的血管生成。在Guo等［27］的研究中，通過可調(diào)制模塊性聚類（MMC）檢測了子癇前期和宮內(nèi)生長受限（IUGR）的一些分子標(biāo)記，他們發(fā)現(xiàn)miR－149表達(dá)在子癇前期患者中有下調(diào)現(xiàn)象。但Yang等［28］發(fā)現(xiàn)，miR－149在子癇前期的母體血液和胎盤組織中均有升高。

目前尚無關(guān)于miR－149 rs2292832多態(tài)性和子癇前期可能影響的報道，但已有幾項研究表明這種多態(tài)性對癌癥、缺血性腦中風(fēng)和心腦血管疾病的影響。Zou等［12］對亞洲人群進(jìn)行的meta分析顯示，miR－149 rs2292832 CC基因型與缺血性腦中風(fēng)風(fēng)險之間存在一定關(guān)系。在另一項研究中，Sung等［13］發(fā)現(xiàn)miR－149 rs2292832與心腦血管疾病相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR－149 rs2292832位點(diǎn)的等位基因、基因型CT和TT在對照組和病例組中的頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），進(jìn)一步分析此位點(diǎn)在等位基因型、顯性基因型和隱性基因型中均未見與子癇前期中存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，此外，miR－149 rs2292832多態(tài)性與子癇前期和子癇前期嚴(yán)重程度之間無相關(guān)性，提示此位點(diǎn)可能不參與子癇前期中的發(fā)生過程，僅僅是一個遺傳標(biāo)記，非此病的遺傳易感位點(diǎn)。

此外，本研究尚存在一些不足之處。首先，我們研究了miR－146a rs2910164基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)性，但并沒有對miRNA表達(dá)水平及其對相關(guān)的靶mRNA調(diào)控子癇前期的作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討，因此，我們后續(xù)研究的主要方向?qū)⒎旁趍iRNA基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系以及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和機(jī)制上。其次，本研究樣本量偏少，研究對象局限，下一步我們將擴(kuò)大樣本量和進(jìn)行更多群裔群體的設(shè)計，采用大規(guī)模病例－對照研究，對研究miR－146a rs2910164與子癇前期的關(guān)系進(jìn)行更深層次的探討。

綜上所述，本研究通過PCR－RFLP技術(shù)分別分析了miR－146a rs2910164和miR－149 rs2292832與子癇前期易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR－149 rs2292832位點(diǎn)與子癇前期可能無關(guān)，但miR－146a rs2910164位點(diǎn)可能與子癇前期有關(guān)，可能是子癇前期的遺傳風(fēng)險易感因子。