張大偉，楊海麟*，華 宇，周 旌，李安平，關(guān) 舒，安 綱，寧 霄

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/江南大學(xué)教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 羅瑪實(shí)驗(yàn)室檢測服務(wù)（無錫）有限公司，江蘇 無錫 214101；3. 百奧明飼料添加劑（無錫）有限公司，江蘇 無錫 214101；4. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

玉米是一種重要的糧食作物，無論是作為直接的產(chǎn)品，還是由玉米制作而成的加工品或生產(chǎn)的副產(chǎn)品都有較高的附加值，帶來了很高的經(jīng)濟(jì)效益，我國是全球第二大玉米生產(chǎn)國，其中西南、華北和東北地區(qū)的種植面積占全國的70%以上[1]。然而玉米無論在種植環(huán)節(jié)還是在儲藏環(huán)節(jié)非常容易受到真菌毒素的污染，據(jù)全球糧農(nóng)組織預(yù)測，全球大于25%的谷物都或多或少遭受真菌毒素侵害，從而帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

真菌毒素（mycotoxins）是特定霉菌在一定條件下產(chǎn)生的小分子次生代謝產(chǎn)物[2-3]，在谷物中十分普遍，不僅給人畜健康帶來巨大威脅，也會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。真菌毒素種類繁多，目前監(jiān)管和研究工作主要集中在黃曲霉毒素（AFT），赭曲霉毒素（OT），伏馬毒素（FUM），玉米赤霉烯酮（ZEN）以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）等。其中，黃曲霉毒素 B1（AFB1）分布最廣且毒性最強(qiáng)，其致癌、致突變、致畸性均居首位，屬于1類致癌物[5]；FUM 種類繁多，其中伏馬菌素B1（FB1）和B2（FB2）的污染最為廣泛，屬2B類致癌物[6-7]；ZEN又稱F-2毒素，是人體的內(nèi)分泌干擾物[8]；DON 則是B族單端孢霉烯族毒素的一種，其靶標(biāo)器官是胃腸道系統(tǒng)，單端孢霉烯族B毒素還包括15-乙?；鶉I吐毒素和3-乙?；鶉I吐毒素等。這些真菌毒素除 FUM 外均具有脂溶性，不僅廣泛污染谷物，還可通過污染谷物制成的飼料傳遞給牲畜，因此也存在于肉、蛋、奶等動(dòng)物產(chǎn)品中。

目前無論是企業(yè)還是政府監(jiān)管部門更多的是關(guān)注食品或飼料法律法規(guī)中存在限量標(biāo)準(zhǔn)的真菌毒素，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型真菌毒素和隱蔽型真菌毒素逐漸引起人們的關(guān)注，因缺乏合適的分析方法和系統(tǒng)充足的風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)，鮮見相關(guān)法規(guī)與限量標(biāo)準(zhǔn)。谷物中主要的新型真菌毒素包括白僵菌素（BEA）、恩鐮孢素（ENN）、Fusaproliferin（FUS）、串珠鐮刀菌素（MON）、桔霉素（CIT）、雜色曲霉毒素（STG）及鏈格孢毒素等。其中MON的毒性很強(qiáng)，與T-2相當(dāng)，主要靶標(biāo)器官是心臟[9]；CIT常與OTA共存增強(qiáng)其致癌性[10]；STG是AFB1合成的前體化合物，被歸為 2B類致癌物[11]。隱蔽型真菌毒素則是動(dòng)植物體在受到外源毒素侵害時(shí)，將母體毒素與糖、氨基酸及硫酸鹽等結(jié)合生成的衍生物[12]；此外一些食品加工過程如發(fā)酵及熱處理也可以提高隱蔽型毒素的含量[13]。目前，谷物中檢測到的隱蔽型真菌毒素主要有 DON的葡萄糖苷衍生物（DON-3G，DON-15G），ZEN 的葡糖苷衍生物（ZEN-4G）以及硫酸鹽衍生物（ZEN-14S）等[14]。隱蔽型毒素通常具有與其母體相似或較低的毒性作用，但當(dāng)其生物利用率更高時(shí)則會表現(xiàn)出比母體更強(qiáng)的毒性作用[15]。

Romer labs是全球真菌毒素檢測的領(lǐng)導(dǎo)者，于 1982年建立了全球第一家真菌毒素檢測實(shí)驗(yàn)室，通過近四十年的積累發(fā)展成為世界上診斷技術(shù)及檢測服務(wù)領(lǐng)域?qū)I(yè)的實(shí)驗(yàn)室之一，奧地利總部一直致力于多毒素檢測方法的開發(fā)，研究利用Romer Labs總部開發(fā)的40+真菌毒素液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測了 2020年的 181份飼用玉米樣品，重點(diǎn)對于嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的隱蔽性毒素以及一些新型毒素進(jìn)行了研究分析，為科研工作提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米樣品，每份樣品500～1 000 g，來源于田間采樣和養(yǎng)殖戶或飼料生產(chǎn)企業(yè)用作飼料原料：百奧明公司抽檢的9個(gè)地區(qū)總共181個(gè)樣本（見表1）；真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：奧地利ROMER公司；甲醇、乙腈、乙酸、（色譜級）、純水、乙酸銨（質(zhì)譜級）：德國默克公司。

表1 樣品來源分布Table 1 Distribution of samples

1.2 儀器與設(shè)備

RAS Mill研磨機(jī)：奧地利 ROMER公司；Agilent 1290-Sciex QTRAP 5500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司和美國SCIEX公司；Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；BSA2202S-CW 分析天平：德國賽多利斯公司；Pico-17離心機(jī)：美國賽默飛公司；RO500震蕩器：德國格哈特公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

將玉米樣品研磨過 20目篩混合均勻。稱取10 g（精確至0.01 g）于250 mL三角燒瓶中，準(zhǔn)確加入30 mL提取液，V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=79∶20∶1，以 180 r/min振搖 2 h，然后以4 000 r/min離心6 min后取100 μL上清液，加入600 μL稀釋液混勻后用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測分析。

1.3.2 色譜條件

飛諾美Gemini C18 column（150 x 4.6 mm i.d.5 μm），柱溫 40 ℃，流速 0.5 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A為含5 mmol乙酸銨的0.5%乙酸水溶液，流動(dòng)相B為含5 mmol乙酸銨的0.5%乙酸的甲醇溶液。梯度洗脫條件如表2所示。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program %

1.3.3 質(zhì)譜條件

掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；離子源：電噴霧電離ESI；正離子模式電噴霧電壓：5 000 V，離子源溫度：650 ℃；負(fù)離子模式電噴霧電壓：–4 500 V，離子源溫度：600 ℃；碰撞氣：中等；Gas1：55 psi，Gas 2：65 psi；氣簾氣：30.0 psi；其他質(zhì)譜條件見表3。

表3 質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometry conditions

續(xù)表3

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用office2019軟件中Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜圖情況

將 44種毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，經(jīng)色譜柱分離后注入ESI離子源，在上述條件下得到相應(yīng)毒素的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，如圖1-2。色譜峰形對稱尖銳，表明該方法穩(wěn)定可靠，有利于玉米中真菌毒素的檢測。

圖1 真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI+模式下的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple-reaction monitoring chromatograms of mixes solution of mycotoxin standards in ESI+

2.2 嘔吐毒素相關(guān)隱蔽性真菌毒素發(fā)生情況

隨著對真菌毒素研究的深入，近年的研究發(fā)現(xiàn)某些真菌毒素可與一些極性較強(qiáng)的物質(zhì)結(jié)合，這類結(jié)合態(tài)的真菌毒素是常規(guī)手段很難檢測到的，但是在遇到消化酶或腸道微生物時(shí)會部分或全部釋放，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)其生物利用率高時(shí)，會表現(xiàn)出比母體更強(qiáng)的毒性作用，嚴(yán)重危害畜禽健康。本次研究主要關(guān)注含量較高的嘔吐毒素-3-葡萄糖苷（D3G）及嘔吐毒素的兩種乙酰基化合物：15-乙?；鶉I吐毒素（15 AcDON）和3-乙?；鶉I吐毒素（3 AcDON）。這些被檢樣品中，嘔吐毒素-3-葡萄糖苷檢出率最高，其中陽性最高值為412 μg/kg，而陽性均值最高為 152 μg/kg。3-乙?；鶉I吐毒素檢出率最高檢出率較低，最高地區(qū)僅為17%；陽性最高值和陽性均值最高分別為21、18 μg/kg；有3個(gè)地區(qū)未檢出3-乙?；鶉I吐毒素。詳細(xì)情況如圖3、表4所示。

圖3 隱蔽型毒素檢出率Fig.3 Occurrence data of masked-mycotoxin

表4 隱蔽性毒素?cái)?shù)據(jù)Table 4 Masked-mycotoxin in corn μg/kg

2.3 新型毒素和其他類毒素發(fā)生情況

隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新型的真菌毒素逐漸引起人們的關(guān)注。谷物中主要的新型真菌毒素包括白僵菌素（BEA）、恩鐮孢素（ENN）、串珠鐮刀菌素（MON）、雜色曲霉菌素（STC）、霉酚酸（MPA）越來越多的引起科研工作者的關(guān)注，除此以外像α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol，β-ZOL）、玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN）這些玉米赤霉烯酮代謝產(chǎn)物以及以鏈格孢酚（AOH）為代表的鏈格孢霉毒素也時(shí)有報(bào)道。雖然這些真菌毒素暫時(shí)沒有進(jìn)行常規(guī)的分析檢測，更沒有受到法規(guī)的管制，但是有證據(jù)表明，這些新型的真菌毒素不僅種類多，而且很可能產(chǎn)生協(xié)同作用，從而對食品和飼料安全產(chǎn)生更大影響。

在這些毒素中，白僵菌素檢出率為 67%～100%。恩鐮孢素A檢出率最高為23%；恩鐮孢素A1檢出率最高為13%；恩鐮孢素B檢出率最高為23%，有2個(gè)地區(qū)均未檢出；恩鐮孢素B1檢出率最高為14%，有2個(gè)地區(qū)未檢出。串珠鐮刀菌素檢出率為78%～100%；霉酚酸檢出率最高為33%，2個(gè)地區(qū)未檢出；雜色曲霉菌素檢出率最高為100%，2個(gè)地區(qū)均未檢出；α-玉米赤霉烯醇檢出率最高為 41%，2個(gè)地區(qū)未檢出；玉米赤霉酮檢出最高為 32%，2個(gè)地區(qū)未檢出；格列孢酚均有檢出，但檢出率較低，為 8%～22%。詳細(xì)情況如圖4所示。

圖4-1 白僵菌素和恩鏈孢霉檢出率Fig.4-1 Occurrence data of emerging-toxins such as BEA & ENN

圖4-2 其他毒素以及部分毒素代謝物檢出率Fig.4-2 Occurrence data of other toxins and its metabolite in maize

2.3.1 白僵菌素發(fā)生情況

白僵菌素能夠提高陽離子穿過細(xì)胞膜的能力，由此干擾正常生理水平下的陽離子濃度，影響細(xì)胞膜的電化學(xué)濃度，從而產(chǎn)生毒性反應(yīng)。此外，白僵菌素還可以誘導(dǎo)染色體畸變，姐妹染色單體交換和微核形成，最終引起細(xì)胞凋亡，線粒體功能異常和紅細(xì)胞膜變形等現(xiàn)象。本次研究白僵菌素的均值最大為 70.2 μg/kg，最低為 1.3 μg/kg。詳細(xì)情況見表5。

表5 白僵菌素?cái)?shù)據(jù)Table 5 Beauverin data in maize μg/kg

2.3.2 恩鐮孢素發(fā)生情況

恩鐮孢素目前發(fā)現(xiàn)的有20多種，研究較多的主要有恩鐮孢素 A、恩鐮孢素 A1、恩鐮孢素 B和恩鐮孢素B1這四種，對人和動(dòng)物有致癌、致畸、致突變等毒性。本次研究涉及的樣品中，恩鐮孢A最高值為 361.0 μg/kg，陽性均值為 128.0 μg/kg；恩鐮孢 A1最高值為 13.9 μg/kg，陽性均值為8.4 μg/kg；恩鐮孢B最高值為9.8 μg/kg，陽性均值為 1.8 μg/kg；恩鐮孢 B1最高值為 7.8 μg/kg，陽性均值為2.1 μg/kg。有2個(gè)地區(qū)未檢出恩鐮孢素。詳細(xì)情況見表6。

表6 恩鐮孢素?cái)?shù)據(jù)Table 6 Enniatin data in maize μg/kg

2.3.3 串珠鐮刀菌素發(fā)生情況

串珠鐮刀菌素的毒性很強(qiáng)，主要的靶標(biāo)器官是心臟。本研究涉及的樣品中，最高值和陽性均值最大分別為953、140 μg/kg。最高值和陽性均值最小值分別為113、31.3 μg/kg。詳細(xì)情況見表7。

表7 串珠鐮刀菌素?cái)?shù)據(jù)Table7 Moniliformin data in maize μg/kg

2.3.4 雜色曲霉菌素和霉酚酸發(fā)生情況

雜色曲霉菌素是AFB1合成的前體化合物，也是2B類致癌物。霉酚酸是免疫抑制劑，能阻斷T和B淋巴細(xì)胞的增殖，抑制抗體形成和產(chǎn)生毒性T細(xì)胞[19]。本次研究涉及的樣品中，雜色曲霉菌素最高值和陽性均值最高分別為8.4、2.9 μg/kg，有2個(gè)地區(qū)未檢出。霉酚酸最高值和陽性均值最高分別為57.3、18.1 μg/kg，有2個(gè)地區(qū)未檢出。詳細(xì)情況見表8。

表8 雜色曲霉菌素和霉酚酸數(shù)據(jù)Table 8 Sterigmatocystin & Mycophenolic acid data in maize μg/kg

2.3.5 α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮發(fā)生情況

α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮為玉米赤霉烯酮的代謝產(chǎn)物，與動(dòng)物內(nèi)源性雌激素β-雌二醇有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，故可以與動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)β-雌二醇的受體結(jié)合而引起牲畜雌激素綜合癥狀，導(dǎo)致牲畜體內(nèi)雌激素過多，引起不孕不育、流產(chǎn)和死胎現(xiàn)象，并有很強(qiáng)的致癌性。α-玉米赤霉烯醇最高值和陽性均值最高分別為13.2、13.2 μg/kg，有1個(gè)地區(qū)未檢出；β-玉米赤霉烯醇最高值和陽性均值最高分別為8.0、5.3 μg/kg，有3個(gè)地區(qū)未檢出；玉米赤霉酮最高值和陽性均值最高分別為12.5、12.5 μg/kg，有2個(gè)地區(qū)未檢出。詳細(xì)情況見表9。

表9 α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮數(shù)據(jù)Table 9 α-zearalenol、β-zearalen & Zearalanone occurrence data in maize μg/kg

2.3.6 鏈格孢酚發(fā)生情況

鏈格孢酚是鏈格孢毒素的一種，對人和動(dòng)物有致癌，致畸，致突變等毒性。鏈格孢酚是玉米中另一種常見的真菌毒素，絕對值不高，但本次研究涉及的樣品，均有微量檢出率。最高值和陽性均值最高分別為25.2、10.8 μg/kg。詳細(xì)情況見表10。

表10 鏈格孢酚數(shù)據(jù)Table 10 AOH Occurrence data in maize μg/kg

3 討論與結(jié)論

玉米是我國重要的糧食作物，同時(shí)也是重要的飼料和工業(yè)原料，因此明確玉米中的真菌毒素分布情況和風(fēng)險(xiǎn)隱患，對于促進(jìn)其精準(zhǔn)監(jiān)管和科學(xué)防治，推動(dòng)糧食產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整與綠色發(fā)展，保障我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。本研究利用利用同位素內(nèi)標(biāo)-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了 2020年用于飼料原料的181份盲樣，數(shù)據(jù)表明隱蔽性毒素和新型毒素應(yīng)該引起更為廣泛的關(guān)注。

嘔吐毒素的隱蔽性毒素由于其含有的糖苷基團(tuán)或者乙?；鶊F(tuán)在進(jìn)入人體和動(dòng)物體內(nèi)會在酶切作用下，還原為原型，因此其毒性也不能忽視，文獻(xiàn)中多有報(bào)道關(guān)于國內(nèi)外玉米的嘔吐毒素隱蔽性毒素的暴露，例如Yan等2017年研究選取606個(gè)樣品中3-ACDON和15-ACDON檢出率分別為13.53%和 76.40%，陽性均值為 115、5 μg/kg[20]。歐盟食品安全評估委員會（EFSA）總結(jié)了歐洲各國關(guān)于隱蔽性毒素3-ACDON和15-ACDON以及DON-3G的數(shù)據(jù)，在谷物類原料中均有不同程度的檢出[21]。

白僵菌素和恩鐮孢霉作為重要的新型毒素主要由鐮刀菌的某些菌種侵染小麥、大麥、黑麥和燕麥等谷物后，在潮濕和溫度較低的條件下產(chǎn)生[22]，是最具有代表性的六酯肽類化合物。這類毒素具有基因和細(xì)胞毒性，可以誘導(dǎo)染色體畸變、姐妹染色體單體交換和微核形成[23]。Han等2017年檢測某省 71個(gè)玉米，其中白僵菌素檢出率為85.9%，陽性均值為 46.96 μg/kg。恩鐮孢霉 A、A1、B、B的檢出率依次為 2.8%、4.2%、0%和4.2%，陽性均值分別為 0.13、0.14、0.21 μg/kg[24]。C, Luz等綜述了白僵菌素在玉米、小麥、大麥等谷物中的檢出率情況，發(fā)現(xiàn)全球各國的白僵菌素均有不同程度的檢出[25]，因此白僵菌素的污染也應(yīng)引起重視。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展以及人們對于越來越多真菌毒素的關(guān)注，使得我們把研究重點(diǎn)更多的聚集在國內(nèi)隱蔽性毒素和新型毒素的陽性檢出率和檢出均值，以期為相關(guān)研究部門和監(jiān)管單位提供更多的數(shù)據(jù)參考。本研究中所檢測樣品來自若干不同地區(qū)，僅用于科研分析，樣品未覆蓋國內(nèi)所有玉米產(chǎn)地，且部分地區(qū)樣品數(shù)量相對較少，代表性弱，并不能全面反映這些地區(qū)2020年用于飼料原料的新玉米中真實(shí)的真菌毒素污染水平。本次分析的隱蔽性毒素和新型毒素的檢測數(shù)據(jù)僅供研究同行參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。