紜玲 高洪梅 李碩 楊爍 王海濤 崔慧娟 劉煥亮 付源★

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾?。?］。細(xì)胞外β?淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibril?lary tangles，NFTs）伴神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)細(xì)胞活化是AD 病理特征［2］。流行病學(xué)調(diào)查顯示65 歲以上人群中每10 人就有一人患病，85 歲以上人群中每3 人就有1 個患者［3］。AD 已成為全球嚴(yán)重的醫(yī)療和社會問題之一，給社會和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。目前對AD 尚無有效治療方法，而早期診斷AD 有助于早期干預(yù)及延緩疾病進(jìn)展。生物化學(xué)改變發(fā)生于臨床癥狀出現(xiàn)前20年，所以檢測生物標(biāo)志物是AD早期診斷的重要工具［4］。本文就AD 早期分子診斷研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以幫助早期治療、早期預(yù)防。

1 基因檢測

AD 根據(jù)發(fā)病年齡分為早老性AD（early?onset AD，EOAD）與遲發(fā)型AD（late?onset AD，LOAD），EOAD 占所有AD 病例5%以下，LOAD 占所有AD病例的95%以上［5］。研究發(fā)現(xiàn)EOAD 主要由β?淀粉樣蛋白前體（APP）、早老素?1（PSEN1）和早老素?2（PSEN2）基因突變引起，這些錯義基因可協(xié)助早期診斷AD［6］，其突變之后可導(dǎo)致腦組織發(fā)生氧化損傷，引起腦內(nèi)Aβ 的產(chǎn)生和清除的失平衡，進(jìn)而形成Aβ 異常沉積所形成的老年斑（Amyloid Plaque），最終出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡［7］?；蛲蛔兊姆诸惸壳叭匀痪哂刑魬?zhàn)性，多項研究發(fā)現(xiàn)不同EOAD患者體內(nèi)存在多個突變，如PSEN1的兩個新突變（Y256N 和H214R）、致病性PSEN1Trp165Cys 突變、PSEN1G209A 突變，這些基因突變位點的篩查可為臨床早期診斷AD 提供突變序列，未來還將從蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)同步檢查，并整合這兩個組學(xué)分析的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究其可能的致病機(jī)制［8?11］。

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因被廣泛認(rèn)為是LOAD 的易感基因，其中APOE ε4等位基因是LOAD 發(fā)病的最強(qiáng)風(fēng)險因素，與AD 大腦中Aβ 異常沉積密切相關(guān)［12］。攜帶APOE ε4基因亞型的AD 模型小鼠腦內(nèi)Aβ 的異常沉積主要發(fā)生在Aβ 形成早期，而不影響中晚期Aβ 沉積［13］。脂質(zhì)化apoE 與Aβ 競爭性結(jié)合細(xì)胞膜表面HSPG 受體，抑制神經(jīng)細(xì)胞攝取Aβ，導(dǎo)致Aβ 清除減慢，此作用具有濃度依賴性［14］。APOE ε4轉(zhuǎn)基因小鼠中炎癥因子環(huán)孢素A 和基質(zhì)金屬蛋白酶?9 通過加速血腦屏障周細(xì)胞的降解，引起血腦屏障破壞，進(jìn)而影響血腦屏障介導(dǎo)的外源性Aβ 的清除［15］。此外，APOE ε4激活Erk 途徑、降低細(xì)胞自噬清除tau 蛋白、誘發(fā)腫瘤壞死因子?α 分泌產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等途徑加劇tau 蛋白異常磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元退行性改變［16］，這些關(guān)鍵的病理變化可協(xié)助早期篩查LOAD 患者。

全基因組關(guān)聯(lián)研究證實了CD33基因與AD 發(fā)病具有關(guān)聯(lián)性，其表達(dá)的CD33 蛋白在大腦中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，對小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的Aβ 的攝取發(fā)揮抑制作用，是LOAD 易感基因位點，利用靜息狀態(tài)功能磁共振成像發(fā)現(xiàn)CD33基因型主要影響額葉?紋狀體環(huán)路中腦功能，在海馬旁回中也觀察到CD33基因型和AD 之間存在相互作用，這些發(fā)現(xiàn)為CD33基因型對認(rèn)知功能的影響提供了進(jìn)一步的見解［17?18］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)攜帶微管相關(guān)蛋白tau（Microtubule?associated protein tau，MAPT）基因患者腦脊液t?tau 和p?tau 水平顯著增加，表明MAPT基因可作為早期診斷AD 有效的篩查基因，但仍需要進(jìn)一步明確其基因多態(tài)性與AD 發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性［19］。所以驗證這些基因準(zhǔn)確預(yù)測疾病發(fā)生的能力并明確可能的致病機(jī)制非常重要。

2 生物學(xué)標(biāo)志物檢測

AD 相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物檢測主要以腦脊液檢查為主，隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，在外周血液等其他組織也正在試圖尋找簡便有效的早期診斷生物標(biāo)志物。根據(jù)國際工作組織和美國國立老化研究院建立的診斷標(biāo)準(zhǔn)，腦脊液Aβ1?42水平下降、總tau、磷酸化tau 水平上升被認(rèn)為是有效的AD 支持性診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。Lewczuk 等人［20?21］報道腦脊液中Aβ42 降低對AD 診斷的敏感性為69.3%，特異性則可達(dá)到88.9%，Aβ42/Aβ40 降低的敏感性和特異性分別為93.3%和100%，在臨床常規(guī)條件下腦脊液Aβ42/Aβ 40 代替Aβ42 可以提高診斷準(zhǔn)確性，然而腦脊液生物標(biāo)志物的可變性太高（包括運輸、實驗方法、參考值等的影響），臨床界限值確定存在較大困難，下一步需要標(biāo)準(zhǔn)化實驗室條件，識別和連續(xù)優(yōu)化影響因素。Aβ1?42和p?tau 是腦脊液生物學(xué)標(biāo)志物的最佳組合，可以預(yù)測輕度認(rèn)知功能障礙患者發(fā)生AD 的總體風(fēng)險，有利于對AD 患者進(jìn)行早期干預(yù)［22］。視錐蛋白樣蛋白1（Visinin?like protein?1，VILIP?1）是一種神經(jīng)元內(nèi)鈣傳感蛋白，在腦損傷模型和基因陣列分析中已被證實可作為神經(jīng)元損傷的指標(biāo)，其可作為神經(jīng)元丟失病理過程的累積結(jié)果。因此，捕捉神經(jīng)元變性丟失的腦脊液標(biāo)志物可能對未來的認(rèn)知下降提供預(yù)測價值。據(jù)此，有研究發(fā)現(xiàn)腦脊液VILIP?1 水平與情景記憶和語義記憶能力下降有關(guān)，與AD 早期顳葉內(nèi)側(cè)萎縮病理改變具有一致性，CSF 中VILIP?1和VILIP?1/Aβ42 可作為早期AD 患者認(rèn)知功能下降的預(yù)測模型，其作用與tau 和tau/Aβ42 類似，可能成為AD 早期神經(jīng)變性的有效CSF 替代物［23］。

由于腦脊液檢測的有創(chuàng)性和普及難度大，而血液采集具有極大的簡便性，大家開始把目光轉(zhuǎn)向血液生物標(biāo)志物。由于血漿中Aβ 的含量較低，且干擾測量的特定血液蛋白質(zhì)和其他化合物含量過高，其免疫測量和定量受到阻礙。在極輕微AD、輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impair?ment，MCI）和健康對照組的血漿中檢測t?tau 和p?tau蛋白水平，發(fā)現(xiàn)極輕微AD 和MCI 患者血漿t?tau和P?tau 水平高于健康對照組，極輕微AD 患者血漿t?tau 和p?tau 水平高于MCI 組，并且p?tau 相關(guān)性更顯著，表明血漿t?tau 和p?tau 均可協(xié)助篩查早期AD，但血漿p?tau 水平與AD 嚴(yán)重程度相關(guān)性高于血漿t?tau［24］。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)血清t?tau 和p?tau181 蛋白水平與蒙特利爾評分呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果支持血液t?tau 和p?tau 作為早期AD 的預(yù)測標(biāo)志物，有可能作為未來隨訪AD 患者預(yù)后的指標(biāo)［25］。分析MCI 和AD 患者血漿Micro RNA 轉(zhuǎn)錄組，microRNA?206 表現(xiàn)出與認(rèn)知能力下降和記憶缺陷的強(qiáng)烈相關(guān)性，五年以上的縱向隨訪發(fā)現(xiàn)，microR?NA?206 在認(rèn)知功能障礙發(fā)生之前異常增加，可用于預(yù)測MCI 階段認(rèn)知能力的下降［26］。

唾液生物學(xué)標(biāo)志物檢測是一種比血液更為簡便的方法，利用高度敏感的Luminex 分析法對唾液t?tau、p?tau 和Aβ42 蛋白水平進(jìn)行定量評估，結(jié)果顯示AD 患者的p?tau/t?tau 比值顯著增加，在S396 磷酸化位點變化更明顯［27?28］。這些結(jié)果表明，唾液tau 蛋白可能成為AD 早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，甚至可應(yīng)用于無癥狀受試者的篩查，進(jìn)而為AD 治療提供更大的時間窗［29］。此外，研究還顯示AD 患者的唾液Aβ42 水平明顯高于對照組［30］。綜上所述，唾液檢測可成為AD 早期診斷的關(guān)鍵方法。下一步有必要進(jìn)一步了解這些生物標(biāo)志物的聯(lián)用優(yōu)勢，進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)驗證及建立可靠的臨界值和標(biāo)準(zhǔn)參考物。

3 影像學(xué)檢查

影像學(xué)技術(shù)發(fā)展對AD的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。AD 患者磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查的主要改變是皮質(zhì)性腦萎縮和腦室擴(kuò)大伴腦溝裂增寬，但由于缺乏對AD 診斷的特異性，主要用于排除可引起癡呆的其他疾病。定量磁化率成像是磁共振成像中一項新興的用于定量測量組織磁化特性的技術(shù)，利用該技術(shù)證明Aβ 具有抗磁性，可在磁化率圖上產(chǎn)生強(qiáng)烈的對比，磁化率標(biāo)測可以用來檢測AD 小鼠模型中Aβ 斑塊的聚集［31?32］。

正電子發(fā)射斷層掃描淀粉樣蛋白顯像劑與大腦內(nèi)纖維狀淀粉樣蛋白沉積的結(jié)合，可視化和量化大腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積，可檢測AD 患者大腦內(nèi)Aβ 異常沉積，主要配體包括11C 和18F 標(biāo)記的放射性示蹤劑［33］。利用突觸囊泡糖蛋白2A PET 顯像測定突觸密度，可為阿爾茨海默病的早期診斷提供工具［34］。氟?2?脫氧?D?葡萄糖?正電子發(fā)射斷層掃描成像顯示，顳頂葉、額葉和后扣帶皮質(zhì)中的葡萄糖代謝減少是AD 的標(biāo)志，中晚期出現(xiàn)額葉皮質(zhì)受累，額葉受累與否，可作為鑒別AD 早期和中晚期的標(biāo)志［35］。應(yīng)用單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）技術(shù)評估腦灌注變化，發(fā)現(xiàn)≥94%輕度AD患者的灌注值低于健康對照組的平均值，這一結(jié)果提示繪制低灌注的地形圖，可明確特定的早期灌注模式，幫助早期診斷AD［36］。由于目前還沒有確切規(guī)范的測量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)案例較少，下一步需要建立供臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)并培訓(xùn)閱片人。

4 新技術(shù)展望

隨著視覺變異型AD（Visual variant of AD，VVAD）患者的發(fā)現(xiàn)，眼部標(biāo)志物逐漸進(jìn)入研究者的視線，有研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)AD 神經(jīng)病理學(xué)包括視網(wǎng)膜Aβ、tau 蛋白的積聚、神經(jīng)元丟失和RGC 凋亡，在AD 模型小鼠中發(fā)現(xiàn)其視網(wǎng)膜RGCc 層凋亡細(xì)胞的存在，視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞檢測技術(shù)是一種利用放射性annexin V 和聚光共聚焦掃描眼底鏡檢測凋亡細(xì)胞的方法，可以在AD患者中無創(chuàng)性顯示AD病理變化，這種成像技術(shù)的演變和發(fā)展可成為未來的AD診斷工具［37?38］。

生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度通過識別元件識別后經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為光、電等可測量信號進(jìn)行檢測的儀器，因其快速、低廉、簡便、可重復(fù)使用等優(yōu)點成為診斷很多疾病的有前途的工具［39］。一種用于檢測Aβ 蛋白的免疫磁生物傳感器，利用sulfo?SMCC 交聯(lián)法將抗Aβ 抗體標(biāo)記在磁性氮摻雜石墨烯表面，形成磁性免疫載體，將磁性免疫載體放置在Au 電極上，在電極下方放置一個外部磁鐵進(jìn)行電化學(xué)Aβ 檢測，通過電流變化測定Aβ 蛋白濃度，該儀器目前只在體外實驗進(jìn)行驗證，未來可考慮對AD 患者腦脊液、血液Aβ 蛋白濃度進(jìn)行測定，對AD 早期診斷有潛在的作用［40］。雖然這些技術(shù)優(yōu)勢顯而易見，但同時也需要解決可再生性、特異性、穩(wěn)定性等方面的問題，才可能使其成為未來的有效診斷工具。

5 結(jié)語

AD 目前尚無有效的治療手段，早期診斷和干預(yù)是控制AD 發(fā)生發(fā)展的重要措施。建立有效的分子診斷標(biāo)志物是AD 研究領(lǐng)域的重要難題。隨著醫(yī)療新技術(shù)的不斷發(fā)展，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有良好重復(fù)性及有效性，確立簡便、易行的診斷方法，將會為AD 診斷指明新方向。