戴婷婷，許婷，俞小衛(wèi)

國(guó)內(nèi)外統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌仍居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位，疾病負(fù)擔(dān)逐年上升［1-2］。近年來(lái)，隨著靶向、免疫等治療方案的不斷更新和改進(jìn)，肺癌患者的生存狀況有了較大的改觀，但其5年生存率仍居于末位［3］，尋找肺癌治療的新方法是亟待解決的問(wèn)題?；蛑委熗ㄟ^(guò)將目的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)獲得穩(wěn)定持久的表達(dá)，從而發(fā)揮治療作用，有望成為腫瘤治療的熱點(diǎn)［4］。NK4作為一種新型抗腫瘤藥物，不僅可以與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met），抑制HGF∕c-Met介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［5］，還可以通過(guò)直接抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）而抑制血管生成，在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、腫瘤治療研究中具有重要的意義［6-7］。本研究在前期體外細(xì)胞水平的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的NK4過(guò)表達(dá)慢病毒載體，以瘤內(nèi)注射的方式對(duì)裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究慢病毒載體介導(dǎo)的NK4基因過(guò)表達(dá)對(duì)人肺腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細(xì)胞株由南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。4～5周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)健康雌性BALB∕c裸鼠15只購(gòu)自江蘇科標(biāo)醫(yī)學(xué)檢測(cè)有限公司，飼養(yǎng)于24℃、50%濕度，SPF級(jí)無(wú)菌環(huán)境中。重組慢病毒載體LV-NK4及陰性對(duì)照載體LV-con由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建。細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司?？筩-Met、抗CD31以及抗Flag標(biāo)簽兔抗人單克隆抗體購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，GAPDH兔抗人單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。臺(tái)式低溫離心機(jī)、梯度PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，凝膠圖像分析儀（SH-100）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物模型建立 人肺腺癌A549細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合達(dá)90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞懸液至2×107個(gè)∕mL，于BALB∕c裸鼠右前肢腋端皮下注射A549腫瘤細(xì)胞0.2 mL。注射細(xì)胞后定期觀察裸鼠健康狀況。接種后10 d左右，裸鼠皮下開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)節(jié)，15只均成瘤。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù) 待瘤徑達(dá)5 mm左右時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將15只裸鼠分為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、LV-con組和LV-NK4組，每組5只。采用瘤內(nèi)注射的方式進(jìn)行給藥，共注射2次，間隔3 d。PBS組注射25μL PBS，LV-con組、LVNK4組分別注射25μL滴度為6×108TU∕mL的陰性對(duì)照慢病毒載體LV-con及重組慢病毒載體LV-NK4。隨后繼續(xù)放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及裸鼠生存狀態(tài)，腫瘤體積按照公式V=（長(zhǎng)徑×短徑×高）π∕6計(jì)算。連續(xù)觀察4周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，小心剝離皮下瘤組織，稱(chēng)量瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=［PBS組平均瘤質(zhì)量-LV-NK4組平均瘤質(zhì)量（或LV-con組平均瘤質(zhì)量）］∕PBS組平均瘤質(zhì)量×100%。將一部分瘤組織和取出的肺組織用10%福爾馬林固定，行石蠟包埋備用。另一部分瘤組織-80℃凍存，備用。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤組織及肺組織HE染色 取腫瘤組織及肺組織蠟塊，低溫處理后以最大面積行3μm厚度切片，HE染色法處理后，在低倍鏡下尋找壞死面積最大區(qū)域，隨后在高倍鏡下隨機(jī)讀取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，觀察腫瘤組織壞死情況。肺組織同樣用HE染色法處理觀察其形態(tài)及腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.2.4 移植瘤組織免疫組化染色 取瘤組織蠟塊，3μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，按免疫組化SP法步驟對(duì)裸鼠皮下瘤組織進(jìn)行染色，檢測(cè)瘤組織中c-Met和CD31表達(dá)情況。c-Met陽(yáng)性表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色。從每組切片的高倍視野下讀取10個(gè)不同視野，拍照后應(yīng)用Image Pro.Plus6.0（IPP6.0）定量分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算各組蛋白陽(yáng)性表達(dá)平均光密度（mean optical density，MOD）。CD31染色陽(yáng)性主要定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈棕黃色。CD31染色的血管呈條索狀或具有明顯的管腔。微血管密度（microvessel density，MVD）計(jì)數(shù)參照Weidner計(jì)數(shù)法，即先在低倍鏡下（×40）讀取幾個(gè)微血管數(shù)量最多的“熱點(diǎn)”區(qū)域，在高倍鏡下（×400）計(jì)數(shù)每一個(gè)區(qū)域中的微血管數(shù)，取其平均值為MVD。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況 用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。樣本染色完成后立即在熒光顯微鏡下分析，載玻片注意避光。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞均染成藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有異硫氰酸熒光素（FITC）摻入而定位的綠色熒光。每張切片在高倍視野下（×400）取10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)∕細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 qPCR檢測(cè)瘤體內(nèi)NK4 mRNA的表達(dá) 將瘤組織充分研磨，使用TRIzol液提取總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定OD260與OD280比值。取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板配置qPCR反應(yīng)體系，具體如下：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA 2μL、ddH2O 7μL。引物序列：NK4上游5'-TCCATGATACCACACGAACACAGC-3'，下游5'-CTTCGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3'；內(nèi)參GAPDH上游5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'，下游5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。qPCR反應(yīng)步驟：95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)40次；95℃15 s，60℃60 s；95℃15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算NK4的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組瘤組織NK4的蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至3 g∕L。使用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后加入Flag標(biāo)簽抗體（檢測(cè)融合蛋白NK4表達(dá)情況）和內(nèi)參GAPDH兔單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜。TBST溶液洗去未結(jié)合的抗體，室溫下二抗（1∶2000）孵育2 h，TBST洗滌3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。將膜移入凝膠成像分析儀中，進(jìn)行成像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)的NK4過(guò)表達(dá)對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 治療期間，裸鼠一般狀況良好，活動(dòng)能力可，攝食飲水正常。治療28 d后（即實(shí)驗(yàn)第38天），將裸鼠處死并取出瘤組織，可見(jiàn)LV-NK4組瘤組織表面出現(xiàn)出血、壞死、結(jié)痂，且瘤組織較LV-con組和PBS組縮小，見(jiàn)圖1。LV-NK4組裸鼠腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量均較LV-con組和PBS組明顯減?。≒＜0.05），而LV-con組和PBS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。LV-NK4組抑瘤率為44.51%，LV-con組抑瘤率為10.35%，抑瘤效果明顯。

Tab.1 The volume and weight of the transplanted tumor in the three groups表1 各組裸鼠移植瘤體積及質(zhì)量 （n=5，±s）

Tab.1 The volume and weight of the transplanted tumor in the three groups表1 各組裸鼠移植瘤體積及質(zhì)量 （n=5，±s）

*P＜0.05，a與PBS組比較，b與LV-con組比較，P＜0.05

組別PBS組LV-con組LV-NK4組F腫瘤體積（mm3）838.598±390.780812.714±348.967316.166±89.290ab 4.612*腫瘤質(zhì)量（g）0.7829±0.15100.7018±0.22270.4344±0.1234ab 5.689*

2.2 外源性NK4表達(dá)增多對(duì)瘤組織的形態(tài)及肺部轉(zhuǎn)移的影響 HE染色結(jié)果顯示，裸鼠皮下移植瘤的瘤組織為肺腺癌，LV-NK4組裸鼠的瘤組織中出現(xiàn)大量出血壞死灶，細(xì)胞核萎縮、變形及破碎，細(xì)胞排列稀疏，腫瘤壞死程度高于LV-con組和PBS組。肺組織HE染色切片顯示，LV-con組和PBS組可見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，LV-NK4組未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶。見(jiàn)圖2。

Fig.1 Comparison of the growth of transplanted tumors between the three groups of nude mice圖1 各組裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況比較

2.3 外源性NK4表達(dá)增多對(duì)瘤組織c-Met表達(dá)及肺腺癌微血管形成的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，LV-NK4組c-Met染色程度較LV-con組和PBS組明顯減弱（P＜0.05），而LV-con組和PBS組間無(wú)明顯差異；LV-NK4組MVD較LV-con組和PBS組降低（P＜0.05），而LV-con組和PBS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、表2。

2.4 外源性NK4表達(dá)增多對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LV-NK4組裸鼠皮下移植瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，與LV-con組、PBS組凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖4。

Tab.2 Comparison of the MOD,MVD,AI and expression levels of NK4 mRNA in tumor tissues between the three groups表2 各組移植瘤組織c-Met表達(dá)、MVD、AI和NK4 mRNA表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the MOD,MVD,AI and expression levels of NK4 mRNA in tumor tissues between the three groups表2 各組移植瘤組織c-Met表達(dá)、MVD、AI和NK4 mRNA表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

**P＜0.01，a與PBS組比較，b與LV-con組比較，P＜0.05

組別PBS組LV-con組LV-NK4組F c-Met（MOD）0.7829±0.15100.7018±0.22270.4344±0.1234ab 42.847**MVD 22.00±5.4018.90±3.4811.20±2.78ab 18.954**凋亡指數(shù)（%）9.72±2.6211.96±5.2218.13±4.80ab 9.955**NK4 mRNA 1.00±0.101.37±0.333.30±0.73ab 108.922**

Fig.2 The tumor tissues and lung tissues in each group observed by HE staining圖2 HE染色觀察各組裸鼠瘤組織和肺組織

Fig.3 c-Met and CD31 expression in tumor tissues of each group detected by immunohistochemistry(×400)圖3 免疫組化檢測(cè)不同治療組移植瘤組織中c-Met、CD31表達(dá)（×400）

2.5 移植瘤組織中NK4 mRNA和蛋白表達(dá)情況 qPCR結(jié)果顯示，LV-NK4組NK4 mRNA表達(dá)量較LV-con組和PBS組明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，外源性NK4在LV-NK4組表達(dá)相應(yīng)蛋白，而LV-con組及PBS組未見(jiàn)NK4蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖5。

Fig.4 The apoptosis of tumor cells in each group detected by TUNEL(×400)圖4 TUNEL法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況（×400）

Fig.5 The expression of NK4 in tumor tissues of each group detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)各組移植瘤組織NK4蛋白表達(dá)

3 討論

基因治療是將目的基因通過(guò)載體遞送至細(xì)胞內(nèi)以達(dá)到治療目的，已用于癌癥和多種遺傳性疾病的治療［8-9］。基因治療成功的關(guān)鍵是將足量的治療核酸有效載荷導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，因此必須考慮給藥載體、給藥方法和靶細(xì)胞［10］。本研究使用的慢病毒載體是基于人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）設(shè)計(jì)改造的，可以感染分裂和非分裂細(xì)胞，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因攜帶能力（8 kb），并能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)［4］。此外，目前研發(fā)設(shè)計(jì)的慢病毒載體具有“自滅活”特性，降低了遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)［10］。給藥方式的選擇也至關(guān)重要。肺部基因治療給藥方式中，靜脈注射往往僅有34%的藥物被遞送至肺部，大多數(shù)藥物最終進(jìn)入了肝臟［11］。霧化吸入時(shí)霧化器產(chǎn)生的剪切力也會(huì)在很大程度上影響載體的功能，降低治療效果［12］。將攜帶有目的基因的慢病毒載體通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式給藥，既提高了局部藥物濃度、減少了對(duì)非靶器官的影響，同時(shí)又可避免給藥過(guò)程中載體功能的受損。本研究通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定的NK4過(guò)表達(dá)慢病毒載體，以瘤內(nèi)注射的方式對(duì)裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，NK4基因過(guò)表達(dá)成功并表達(dá)相應(yīng)蛋白發(fā)揮作用，提示慢病毒載體介導(dǎo)的NK4過(guò)表達(dá)可穩(wěn)定持久轉(zhuǎn)染裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

NK4最早是由Date等［5］通過(guò)水解消化HGF獲得，NK4主要由HGF的α鏈部分組成，包括N端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和4個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)相似性使得NK4可以與HGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合c-Met，抑制HGF∕c-Met通路以及下游的PI3K∕Akt、MAPK以及STAT3等相關(guān)通路，最終抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和對(duì)分子靶向藥物的耐藥性［13-14］。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，HGF∕c-Met信號(hào)通路在腫瘤可塑性、免疫逃逸和適應(yīng)性機(jī)制發(fā)展中也起到關(guān)鍵作用［15］。本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，NK4具有抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，并且可能與下調(diào)c-Met基因水平有關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，NK4過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)裸鼠皮下移植瘤組織壞死、細(xì)胞凋亡，通過(guò)對(duì)瘤組織進(jìn)行c-Met免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)LV-NK4組c-Met蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制，與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示NK4可以通過(guò)抑制HGF∕c-Met通路，發(fā)揮抗腫瘤作用。

此外，NK4作為血管生成抑制劑，不僅可以通過(guò)直接抑制VEGF和bFGF影響血管生成，還可以通過(guò)與基底膜聚糖結(jié)合，抑制纖連蛋白依賴(lài)的內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散，從而起到維持血管穩(wěn)定的作用［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，LV-NK4組較PBS組和LV-con組瘤組織MVD明顯降低，血管生成受到抑制，提示NK4還可以通過(guò)抑制腫瘤微血管生成影響腫瘤生長(zhǎng)。此外，肺組織HE染色切片顯示，LV-con組和PBS組可見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，LV-NK4組未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶，考慮可能與血管生成減少、腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率降低有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NK4的治療潛力已在多種腫瘤中得到證實(shí)［17-19］，其多重抗腫瘤作用在腫瘤治療方面顯示出優(yōu)勢(shì)及前景。本研究通過(guò)瘤內(nèi)注射LV-NK4，不僅可以將足量的NK4基因有效載荷導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，從而提高局部藥物濃度，還可以降低慢病毒載體靶向其他組織和器官的可能性，減少對(duì)肝臟、腎臟等非靶器官的影響［20］。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的NK4過(guò)表達(dá)可以通過(guò)促進(jìn)裸鼠皮下移植瘤壞死、腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制c-Met蛋白表達(dá)以及微血管的形成，最終抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，NK4還可能降低腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率，從而抑制肺轉(zhuǎn)移。