王玲艷，高春暉，馮雪園，崔鑫淼，孫建云，何向輝

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤。2015年我國(guó)女性乳腺癌新發(fā)病例約30.4萬(wàn)例，占女性全部惡性腫瘤發(fā)病的17.1%；死亡病例約7.0萬(wàn)例，占女性全部惡性腫瘤死亡的8.2%［1］。20%～30%的原發(fā)性乳腺癌患者因局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而危及生命［2-3］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）指自發(fā)或因診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTC與癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有直接關(guān)系，是液體活檢重要標(biāo)志物之一［4-5］，可用于指導(dǎo)治療、監(jiān)測(cè)療效、風(fēng)險(xiǎn)分層以及預(yù)測(cè)預(yù)后［6-8］。傳統(tǒng)的CTC檢測(cè)技術(shù)由于標(biāo)本量較少（通常為3～10 mL外周血），以致CTC檢出率較低，一般低于50%［9］。因此，克服外周血標(biāo)本體積限制對(duì)提高CTC捕獲率和檢出率有重要意義［10］。CellCollector?是全球首創(chuàng)的體內(nèi)CTC檢測(cè)技術(shù)，已被用于包括乳腺癌在內(nèi)的多個(gè)癌種的臨床診斷。CellCollector?體內(nèi)CTC檢測(cè)技術(shù)通過(guò)留置針肘靜脈留置30 min，期間過(guò)血量約1500 mL，從而大大提高了CTC檢測(cè)的敏感度。既往報(bào)道在乳腺癌、肺癌等多個(gè)癌種中CellCollector?檢出率可達(dá)71%［11］。目前，基于CellCollector?技術(shù)捕獲CTC在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的研究較少。本研究使用CellCollector?技術(shù)，分析不同臨床特征乳腺癌患者CTC檢出率的差異，以及CTC動(dòng)態(tài)變化與患者疾病進(jìn)展的關(guān)系，探討其用于篩選轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高的乳腺癌患者的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年9月—2020年12月就診于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性乳腺癌的女性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤均位于單側(cè)。（2）不伴有其他臟器惡性腫瘤及其病史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心腎等重要臟器功能不全者。（2）妊娠及哺乳期女性。共納入60例乳腺癌患者為乳腺癌組，年齡30～78歲，平均年齡（50.15±12.05）歲，絕經(jīng)者32例。其中Ⅰ期16例、Ⅱ期29例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。根據(jù)基線CTC檢出情況將患者分為CTC陽(yáng)性組和CTC陰性組。另外，納入同期10例健康女性志愿者為對(duì)照組，年齡28～72歲，平均年齡（49.60±15.39）歲，絕經(jīng)者5例。乳腺癌組和對(duì)照組年齡（t=0.128）、是否絕經(jīng)（χ2=0.038）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 資料收集 收集患者年齡、絕經(jīng)情況、TNM分期、分子分型、Ki-67表達(dá)程度。從第1次診療開(kāi)始，以電話方式每3個(gè)月隨訪1次，了解患者生存狀況，包括疾病進(jìn)展情況、生存狀態(tài)等，隨訪截至2021年4月。

1.3 治療方案 綜合患者病理分期及分子分型，激素受體陽(yáng)性（HR+）分為L(zhǎng)uminal A型和Luminal B型。Luminal A型患者以手術(shù)+內(nèi)分泌治療為主；Luminal B型且人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）陰性患者以手術(shù)+化療+內(nèi)分泌治療為主，Liminal B型且HER-2陽(yáng)性患者以手術(shù)+化療聯(lián)合抗HER-2治療+內(nèi)分泌治療為主；HER-2陽(yáng)性患者以手術(shù)+化療聯(lián)合抗HER-2治療為主；三陰性乳腺癌（TNBC）患者以手術(shù)+化療為主。

1.4 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測(cè) 利用CellCollector?（GILUPI GmbH，Potsdam，Germany）在乳腺癌組乳腺癌根治術(shù)或保乳術(shù)后進(jìn)行至少1次外周血CTC檢測(cè)，對(duì)照組入組后只接受1次CTC檢測(cè)。采樣針通過(guò)20 G留置針穿刺入肘靜脈，確保涂布有上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）抗體和防止白細(xì)胞（WBC）非特異吸附的水凝膠涂層的功能區(qū)暴露于外周血中。

CTC采集完成后，將CellCollector?按照染色試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行染色并鑒定，同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞（NK-92）及陽(yáng)性對(duì)照人乳腺癌細(xì)胞（MCF7）。分別通過(guò)WBC共同抗原CD45（EXBIO Praha，克隆號(hào)MEM-28-Alexa647）抗體、細(xì)胞角蛋白CK7∕19∕panCK抗體（EXBIO Praha，克隆號(hào)A53-B∕A2-Alexa488）進(jìn)行染色分析，然后通過(guò)Hoechst33342熒光染料（Sigma）進(jìn)行核染色，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞學(xué)形態(tài)鑒定所捕獲的細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞。其中，綠色信號(hào)為CK7∕19∕panCK陽(yáng)性，藍(lán)色信號(hào)為Hoechst33342陽(yáng)性，紅色信號(hào)為CD45陽(yáng)性。CTC陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：具有完整細(xì)胞形態(tài)且CD45-，CK7∕19∕panCK+，Hoechst33342+的細(xì)胞。CD45+，CK7∕19∕panCK-，Hoechst33342+則為WBC，見(jiàn)圖1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者基線CTC檢測(cè)情況 乳腺癌組基線CTC檢出率為73.33%（44∕60），范圍1～46個(gè)，中位數(shù)為2個(gè)，26.67%（16∕60）患者CTC數(shù)目≥5個(gè)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者CTC陽(yáng)性比例分別為43.75%（7∕16）、82.76%（24∕29）、81.82%（9∕11）和100%（4∕4），Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者CTC檢出率為71.43%（40∕56）。各分期中≥5個(gè)CTC的患者所占比例分別為2∕16、9∕29、3∕11、2∕4，各分期患者CTC檢出中位數(shù)分別為0個(gè)、2個(gè)、2個(gè)、4個(gè)。對(duì)照組未檢測(cè)到CTC。乳腺癌組患者CTC陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 不同臨床特征患者CTC陽(yáng)性率比較 乳腺癌患者不同臨床分期下CTC檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同年齡、是否絕經(jīng)、不同分子分型及Ki-67表達(dá)水平患者CTC檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Fig.1 Standard image of CTC detection in CellCollector?(×100)圖1 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測(cè)判讀標(biāo)準(zhǔn)圖（×100）

Fig.2 Representative image of CTC positive detection in CellCollector?(×100)圖2 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果（×100）

2.3 CTC動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果及與疾病進(jìn)展情況的相關(guān)性分析 24例患者進(jìn)行2次CTC檢測(cè)，其基線CTC檢出率為70.83%（17∕24），CTC數(shù)目范圍0～13個(gè)，中位數(shù)2個(gè)，25.00%（6∕24）患者CTC數(shù)目≥5個(gè)；第2次CTC檢出率為62.50%（15∕24），CTC數(shù)目范圍0～9個(gè)，中位數(shù)1個(gè)，8.33%（2∕24）患者CTC數(shù)目≥5個(gè)。隨訪4～19個(gè)月，50.00%（12∕24）患者CTC數(shù)目降低，16.67%（4∕24）患者CTC數(shù)目升高，33.33%（8∕24）患者CTC數(shù)目不變。4例患者疾病發(fā)生進(jìn)展，其基線均檢出CTC，其中1例CTC數(shù)目增多，3例CTC數(shù)目降低。20例無(wú)疾病進(jìn)展患者中，基線CTC檢出率為65.00%（13∕20），其中45%（9∕20）患者CTC數(shù)目降低，40%（8∕20）患者CTC數(shù)目不變，15%（3∕20）患者CTC數(shù)目升高。Spearman相關(guān)性分析得出CTC數(shù)目動(dòng)態(tài)變化與疾病進(jìn)展不存在相關(guān)性（rs=-0.224，P＞0.05）。

Tab.1 Comparison of positive CTC rates at baseline between different clinical characteristics表1 不同臨床特征下基線CTC陽(yáng)性率比較（例）

3 討論

CellCollector?使用EpCAM抗體特異性捕獲CTC，其功能區(qū)的水凝膠涂層避免了WBC的非特異性富集，確保了捕獲方法的特異性。相比于CellSearchTM體外檢測(cè)技術(shù)，CellCollector?可檢測(cè)約1500 mL外周血，大大提高了CTC檢出率［6］。一項(xiàng)注冊(cè)臨床試驗(yàn)入組127例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和63例良性乳腺疾病患者，采用CellCollector?對(duì)所有入組人員進(jìn)行基線CTC檢測(cè)，結(jié)果顯示乳腺癌患者CTC檢出率為74.8%，良性組檢出率為0，特異度為100%［12］。此外，CellCollector?的CTC檢測(cè)具有安全性、穩(wěn) 定 性 和 可 重 復(fù) 性［11，13］。這 些 優(yōu) 勢(shì) 使 得CellCollector?成為同時(shí)通過(guò)歐洲聯(lián)盟（CE）和中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)的CTC體內(nèi)捕獲和鑒定技術(shù)。不論體內(nèi)還是體外CTC檢測(cè)，現(xiàn)有研究多為探究CTC與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的關(guān)系。Xie等［6］采用CellCollector?檢測(cè)38例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的CTC，結(jié)果顯示CellCollector?檢出率較高，且可以獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后。本研究通過(guò)入組60例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者，探究基于CellCollector?檢測(cè)的CTC在原發(fā)性乳腺癌患者中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中所有患者基線CTC檢出率為73.33%，對(duì)照組檢出率為0，表明CellCollector?檢測(cè)的CTC敏感度較高，且特異度為100%。本研究分析未發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的CTC檢出率，結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅲ期患者中CTC檢出率為71.43%，高于傳統(tǒng)體外CTC檢測(cè)技術(shù)CellSearchTM檢出率的20%左右［8，10］。有研究發(fā)現(xiàn)CTC作為微小殘留病灶可以識(shí)別出轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)人群［7，14］。在第8版《AJCC癌癥分期手冊(cè)》中，CTC已作為一個(gè)新的M分期（遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移）標(biāo)準(zhǔn)被列為M0和M1之間的cM0（i+）分期［15］。Sparano等［7］研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌中CTC陽(yáng)性患者較陰性患者相比復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高13.1倍，提示CTC輔助臨床對(duì)患者進(jìn)行復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)分層有重要意義。本研究中Ⅰ～Ⅳ期檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這為輔助乳腺癌診斷，從而進(jìn)行針對(duì)性治療提供了新的依據(jù)。本研究中不同年齡、是否絕經(jīng)、分子分型乳腺癌患者CTC檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往采用體外技術(shù)CellSearchTM檢測(cè)CTC的研究結(jié)果一致［9，14］。Ki-67作為一種細(xì)胞增殖的核標(biāo)志物，是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)［16］。但是，本研究中Ki-67表達(dá)＞30%和≤15%乳腺癌患者CTC檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此需要大樣本量的前瞻性研究來(lái)探討驗(yàn)證兩者的關(guān)系。

Schott等［17］研究指出，在治療期間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC可以實(shí)時(shí)評(píng)估療效，早期發(fā)現(xiàn)治療敏感或耐藥患者?！吨袊?guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)乳腺癌診療指南2020》也提出，CTC可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和預(yù)測(cè)預(yù)后，這對(duì)輔助臨床決策，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化治療具有重要意義。本研究進(jìn)一步探討了CellCollect?體內(nèi)技術(shù)捕獲的CTC在治療中的動(dòng)態(tài)變化是否可以反映治療效果，但并未發(fā)現(xiàn)CTC的動(dòng)態(tài)變化與疾病進(jìn)展具有相關(guān)性。

本研究為單中心的小樣本研究，結(jié)果表明CellCollector?體內(nèi)CTC檢測(cè)技術(shù)用于Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者有較高的檢出率，這為CTC用于監(jiān)測(cè)疾病早期進(jìn)展提供了更多支持。CTC與疾病進(jìn)展的關(guān)系需要大規(guī)模的研究來(lái)進(jìn)一步探討分析。