王玲艷，高春暉，馮雪園，崔鑫淼，孫建云，何向輝

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤。2015年我國女性乳腺癌新發(fā)病例約30.4萬例，占女性全部惡性腫瘤發(fā)病的17.1%；死亡病例約7.0萬例，占女性全部惡性腫瘤死亡的8.2%［1］。20%～30%的原發(fā)性乳腺癌患者因局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移而危及生命［2-3］。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）指自發(fā)或因診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。CTC與癌癥遠處轉(zhuǎn)移有直接關(guān)系，是液體活檢重要標志物之一［4-5］，可用于指導治療、監(jiān)測療效、風險分層以及預(yù)測預(yù)后［6-8］。傳統(tǒng)的CTC檢測技術(shù)由于標本量較少（通常為3～10 mL外周血），以致CTC檢出率較低，一般低于50%［9］。因此，克服外周血標本體積限制對提高CTC捕獲率和檢出率有重要意義［10］。CellCollector?是全球首創(chuàng)的體內(nèi)CTC檢測技術(shù)，已被用于包括乳腺癌在內(nèi)的多個癌種的臨床診斷。CellCollector?體內(nèi)CTC檢測技術(shù)通過留置針肘靜脈留置30 min，期間過血量約1500 mL，從而大大提高了CTC檢測的敏感度。既往報道在乳腺癌、肺癌等多個癌種中CellCollector?檢出率可達71%［11］。目前，基于CellCollector?技術(shù)捕獲CTC在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的研究較少。本研究使用CellCollector?技術(shù)，分析不同臨床特征乳腺癌患者CTC檢出率的差異，以及CTC動態(tài)變化與患者疾病進展的關(guān)系，探討其用于篩選轉(zhuǎn)移風險較高的乳腺癌患者的可能性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年9月—2020年12月就診于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性乳腺癌的女性患者。納入標準：（1）腫瘤均位于單側(cè)。（2）不伴有其他臟器惡性腫瘤及其病史者。排除標準：（1）合并心腎等重要臟器功能不全者。（2）妊娠及哺乳期女性。共納入60例乳腺癌患者為乳腺癌組，年齡30～78歲，平均年齡（50.15±12.05）歲，絕經(jīng)者32例。其中Ⅰ期16例、Ⅱ期29例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4例。根據(jù)基線CTC檢出情況將患者分為CTC陽性組和CTC陰性組。另外，納入同期10例健康女性志愿者為對照組，年齡28～72歲，平均年齡（49.60±15.39）歲，絕經(jīng)者5例。乳腺癌組和對照組年齡（t=0.128）、是否絕經(jīng)（χ2=0.038）差異均無統(tǒng)計學意義。本研究通過醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集患者年齡、絕經(jīng)情況、TNM分期、分子分型、Ki-67表達程度。從第1次診療開始，以電話方式每3個月隨訪1次，了解患者生存狀況，包括疾病進展情況、生存狀態(tài)等，隨訪截至2021年4月。

1.3 治療方案 綜合患者病理分期及分子分型，激素受體陽性（HR+）分為Luminal A型和Luminal B型。Luminal A型患者以手術(shù)+內(nèi)分泌治療為主；Luminal B型且人表皮生長因子受體-2（HER-2）陰性患者以手術(shù)+化療+內(nèi)分泌治療為主，Liminal B型且HER-2陽性患者以手術(shù)+化療聯(lián)合抗HER-2治療+內(nèi)分泌治療為主；HER-2陽性患者以手術(shù)+化療聯(lián)合抗HER-2治療為主；三陰性乳腺癌（TNBC）患者以手術(shù)+化療為主。

1.4 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測 利用CellCollector?（GILUPI GmbH，Potsdam，Germany）在乳腺癌組乳腺癌根治術(shù)或保乳術(shù)后進行至少1次外周血CTC檢測，對照組入組后只接受1次CTC檢測。采樣針通過20 G留置針穿刺入肘靜脈，確保涂布有上皮細胞黏附分子（EpCAM）抗體和防止白細胞（WBC）非特異吸附的水凝膠涂層的功能區(qū)暴露于外周血中。

CTC采集完成后，將CellCollector?按照染色試劑盒說明書要求進行染色并鑒定，同時設(shè)有陰性對照惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞（NK-92）及陽性對照人乳腺癌細胞（MCF7）。分別通過WBC共同抗原CD45（EXBIO Praha，克隆號MEM-28-Alexa647）抗體、細胞角蛋白CK7∕19∕panCK抗體（EXBIO Praha，克隆號A53-B∕A2-Alexa488）進行染色分析，然后通過Hoechst33342熒光染料（Sigma）進行核染色，同時結(jié)合細胞學形態(tài)鑒定所捕獲的細胞是否為腫瘤細胞。其中，綠色信號為CK7∕19∕panCK陽性，藍色信號為Hoechst33342陽性，紅色信號為CD45陽性。CTC陽性判讀標準：具有完整細胞形態(tài)且CD45-，CK7∕19∕panCK+，Hoechst33342+的細胞。CD45+，CK7∕19∕panCK-，Hoechst33342+則為WBC，見圖1。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者基線CTC檢測情況 乳腺癌組基線CTC檢出率為73.33%（44∕60），范圍1～46個，中位數(shù)為2個，26.67%（16∕60）患者CTC數(shù)目≥5個。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期乳腺癌患者CTC陽性比例分別為43.75%（7∕16）、82.76%（24∕29）、81.82%（9∕11）和100%（4∕4），Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者CTC檢出率為71.43%（40∕56）。各分期中≥5個CTC的患者所占比例分別為2∕16、9∕29、3∕11、2∕4，各分期患者CTC檢出中位數(shù)分別為0個、2個、2個、4個。對照組未檢測到CTC。乳腺癌組患者CTC陽性結(jié)果見圖2。

2.2 不同臨床特征患者CTC陽性率比較 乳腺癌患者不同臨床分期下CTC檢出率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同年齡、是否絕經(jīng)、不同分子分型及Ki-67表達水平患者CTC檢出率差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

Fig.1 Standard image of CTC detection in CellCollector?(×100)圖1 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測判讀標準圖（×100）

Fig.2 Representative image of CTC positive detection in CellCollector?(×100)圖2 CellCollector?體內(nèi)CTC檢測陽性結(jié)果（×100）

2.3 CTC動態(tài)監(jiān)測結(jié)果及與疾病進展情況的相關(guān)性分析 24例患者進行2次CTC檢測，其基線CTC檢出率為70.83%（17∕24），CTC數(shù)目范圍0～13個，中位數(shù)2個，25.00%（6∕24）患者CTC數(shù)目≥5個；第2次CTC檢出率為62.50%（15∕24），CTC數(shù)目范圍0～9個，中位數(shù)1個，8.33%（2∕24）患者CTC數(shù)目≥5個。隨訪4～19個月，50.00%（12∕24）患者CTC數(shù)目降低，16.67%（4∕24）患者CTC數(shù)目升高，33.33%（8∕24）患者CTC數(shù)目不變。4例患者疾病發(fā)生進展，其基線均檢出CTC，其中1例CTC數(shù)目增多，3例CTC數(shù)目降低。20例無疾病進展患者中，基線CTC檢出率為65.00%（13∕20），其中45%（9∕20）患者CTC數(shù)目降低，40%（8∕20）患者CTC數(shù)目不變，15%（3∕20）患者CTC數(shù)目升高。Spearman相關(guān)性分析得出CTC數(shù)目動態(tài)變化與疾病進展不存在相關(guān)性（rs=-0.224，P＞0.05）。

Tab.1 Comparison of positive CTC rates at baseline between different clinical characteristics表1 不同臨床特征下基線CTC陽性率比較（例）

3 討論

CellCollector?使用EpCAM抗體特異性捕獲CTC，其功能區(qū)的水凝膠涂層避免了WBC的非特異性富集，確保了捕獲方法的特異性。相比于CellSearchTM體外檢測技術(shù)，CellCollector?可檢測約1500 mL外周血，大大提高了CTC檢出率［6］。一項注冊臨床試驗入組127例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和63例良性乳腺疾病患者，采用CellCollector?對所有入組人員進行基線CTC檢測，結(jié)果顯示乳腺癌患者CTC檢出率為74.8%，良性組檢出率為0，特異度為100%［12］。此外，CellCollector?的CTC檢測具有安全性、穩(wěn) 定 性 和 可 重 復 性［11，13］。這 些 優(yōu) 勢 使 得CellCollector?成為同時通過歐洲聯(lián)盟（CE）和中國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準的CTC體內(nèi)捕獲和鑒定技術(shù)。不論體內(nèi)還是體外CTC檢測，現(xiàn)有研究多為探究CTC與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的關(guān)系。Xie等［6］采用CellCollector?檢測38例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的CTC，結(jié)果顯示CellCollector?檢出率較高，且可以獨立預(yù)測預(yù)后。本研究通過入組60例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者，探究基于CellCollector?檢測的CTC在原發(fā)性乳腺癌患者中的應(yīng)用價值。

本研究中所有患者基線CTC檢出率為73.33%，對照組檢出率為0，表明CellCollector?檢測的CTC敏感度較高，且特異度為100%。本研究分析未發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的CTC檢出率，結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅲ期患者中CTC檢出率為71.43%，高于傳統(tǒng)體外CTC檢測技術(shù)CellSearchTM檢出率的20%左右［8，10］。有研究發(fā)現(xiàn)CTC作為微小殘留病灶可以識別出轉(zhuǎn)移高風險人群［7，14］。在第8版《AJCC癌癥分期手冊》中，CTC已作為一個新的M分期（遠端轉(zhuǎn)移）標準被列為M0和M1之間的cM0（i+）分期［15］。Sparano等［7］研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌中CTC陽性患者較陰性患者相比復發(fā)風險高13.1倍，提示CTC輔助臨床對患者進行復發(fā)轉(zhuǎn)移風險分層有重要意義。本研究中Ⅰ～Ⅳ期檢出率差異有統(tǒng)計學意義，這為輔助乳腺癌診斷，從而進行針對性治療提供了新的依據(jù)。本研究中不同年齡、是否絕經(jīng)、分子分型乳腺癌患者CTC檢出率差異無統(tǒng)計學意義，與既往采用體外技術(shù)CellSearchTM檢測CTC的研究結(jié)果一致［9，14］。Ki-67作為一種細胞增殖的核標志物，是反映腫瘤細胞增殖活性的重要指標［16］。但是，本研究中Ki-67表達＞30%和≤15%乳腺癌患者CTC檢出率的差異無統(tǒng)計學意義，因此需要大樣本量的前瞻性研究來探討驗證兩者的關(guān)系。

Schott等［17］研究指出，在治療期間動態(tài)監(jiān)測CTC可以實時評估療效，早期發(fā)現(xiàn)治療敏感或耐藥患者?！吨袊R床腫瘤學會乳腺癌診療指南2020》也提出，CTC可以動態(tài)監(jiān)測疾病進展和預(yù)測預(yù)后，這對輔助臨床決策，實現(xiàn)精準化治療具有重要意義。本研究進一步探討了CellCollect?體內(nèi)技術(shù)捕獲的CTC在治療中的動態(tài)變化是否可以反映治療效果，但并未發(fā)現(xiàn)CTC的動態(tài)變化與疾病進展具有相關(guān)性。

本研究為單中心的小樣本研究，結(jié)果表明CellCollector?體內(nèi)CTC檢測技術(shù)用于Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者有較高的檢出率，這為CTC用于監(jiān)測疾病早期進展提供了更多支持。CTC與疾病進展的關(guān)系需要大規(guī)模的研究來進一步探討分析。