張冬雪 石巖巖 丁士剛

北京大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科 北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床流行病學(xué)研究中心(100183)

幽門螺桿菌(Hp)引起的胃細(xì)胞應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制的改變在慢性感染和胃黏膜疾病進(jìn)展過程中具有重要作用[1-2]。發(fā)生Hp感染相關(guān)性胃炎后，激發(fā)機(jī)體過度的氧化反應(yīng)，激活的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞過度表達(dá)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)，同時Hp本身亦可生成ROS，導(dǎo)致機(jī)體ROS/RNS過度累積[3]。Hp感染引起胃炎后產(chǎn)生的ROS會影響胃上皮細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時過表達(dá)的ROS/RNS產(chǎn)物也會引起細(xì)胞凋亡和胃上皮細(xì)胞DNA損傷。Hp在進(jìn)化過程中生成了一系列逃逸氧化應(yīng)激的機(jī)制，使機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)不但未能清除細(xì)菌，反而更有助于Hp感染，同時氧化應(yīng)激破壞了機(jī)體自身系統(tǒng)的平衡并造成炎癥等多種應(yīng)激損傷，產(chǎn)生惡性循環(huán)，從而促進(jìn)炎癥環(huán)境[3]。由于氧化應(yīng)激生成的過氧化物、一氧化氮(NO)等產(chǎn)物的過表達(dá)使胃黏膜損傷加劇，繼而明顯增強(qiáng)慢性非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生、遠(yuǎn)端胃腺癌的風(fēng)險[1]。此外，亞硝化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激亦參與該過程。本文就Hp感染引發(fā)的應(yīng)激的相關(guān)機(jī)制及其在胃黏膜疾病中的作用作一綜述。

一、氧化應(yīng)激

Hp導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的生化途徑主要有兩條，即NADPH氧化酶(NOX)和精胺氧化酶(SMOX)[2]。NOX是一種通過質(zhì)膜傳遞電子的酶，其電子受體是氧，反應(yīng)產(chǎn)物是過氧化物。目前已鑒定出7個同源物，分別NOX1～NOX5和2個雙氧化酶(DUOX)。有研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染期間可見NOX1、NOX2和DUOX2表達(dá)[4]。一旦病原菌進(jìn)入體內(nèi)，中性粒細(xì)胞立即吞噬細(xì)菌形成吞噬小體，并通過NOX產(chǎn)生的ROS殺死吞噬的病原體。在吞噬過程中，NOX的催化亞單位gp91phox被激活，并接受來自細(xì)胞質(zhì)NADPH的電子。隨后，NOX將這個電子給予吞噬小體內(nèi)或吞噬細(xì)胞外的分子氧，產(chǎn)生過氧化物，可被超氧化物歧化酶(SOD)催化或吞噬小體中的非酶歧化為H2O2。H2O2可被動滲透細(xì)胞膜，在髓過氧化物酶(MPO)的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為次氯酸，其毒性為H2O2的100倍[3,5]。亞鐵存在的情況下，H2O2還與過氧化物發(fā)生非酶反應(yīng)生成羥自由基。一般而言，這些高活性的ROS被吞噬細(xì)胞用來殺死病原菌。而SMOX在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并通過對精胺的氧化過程產(chǎn)生H2O2。

感染Hp后，通過一系列氧化應(yīng)激機(jī)制，產(chǎn)生過量ROS，可能是胃黏膜損傷的主要原因。

1. 細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)：CagA是一種高免疫原性蛋白，分子質(zhì)量為120～140 kDa(1 Da=0.992 1 u)，由CagA基因編碼，其基因位于致病島末端(CAG PAI)。CagA通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)轉(zhuǎn)送至宿主細(xì)胞中[6-7]。多項研究結(jié)果表明，CagA陽性Hp菌株的感染與更高級別的胃黏膜炎癥和嚴(yán)重萎縮性胃炎有關(guān)，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[6-8]。

Hp感染胃黏膜產(chǎn)生ROS的主要來源是宿主的中性粒細(xì)胞，而CagA陽性可影響胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS。具體機(jī)制為：①研究發(fā)現(xiàn)CagA陽性Hp感染可使中性粒細(xì)胞大量積聚并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)增加，產(chǎn)生更多的ROS[2]。②除中性粒細(xì)胞外，胃上皮細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生也顯著增加。Hp CagA可上調(diào)胃上皮細(xì)胞SMOX表達(dá)，SMOX將多胺精胺代謝成亞精胺，并產(chǎn)生H2O2，引起ROS積聚、DNA損傷和細(xì)胞凋亡[9]。③CagA陽性與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)-8表達(dá)增加顯著相關(guān)，而這兩個指標(biāo)均為炎癥和氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[9]。④CagA還可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS：研究發(fā)現(xiàn)將CagA基因轉(zhuǎn)染至胃上皮細(xì)胞，部分CagA蛋白定位于線粒體，產(chǎn)生大量ROS并伴有線粒體電子傳遞功能的受損和過氧化物的產(chǎn)生。線粒體DNA(MtDNA)因其離電子傳遞鏈很近，且缺乏保護(hù)性組蛋白或DNA結(jié)合蛋白，相比核DNA更容易受到ROS損傷，可能表現(xiàn)出電子傳遞功能受損，從而增加電子泄漏和ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇線粒體的氧化應(yīng)激和氧化損傷[7]。因此，CagA可誘導(dǎo)胃黏膜發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞成分，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。

2. 空泡細(xì)胞毒素A(VacA)：VacA基因編碼VacA蛋白，VacA蛋白由Hp通過V型自轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)分泌，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，可促進(jìn)Hp定植，并與炎癥和胃癌的風(fēng)險增加相關(guān)。其具體機(jī)制為：①VacA通過靶向作用于線粒體膜的內(nèi)層，誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和ROS的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致NF-κB的激活和趨化因子表達(dá)上調(diào)[9-10]。②研究表明VacA通過激活ROS而誘導(dǎo)自噬破壞反應(yīng)，從而促進(jìn)Hp的持續(xù)定植。VacA通過與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)結(jié)合來誘導(dǎo)自噬，即與LRP1結(jié)合導(dǎo)致ROS積聚，促進(jìn)Akt激活、MDM2磷酸化、p53降解和誘導(dǎo)自噬[9]。③VacA通過降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，引起ROS積聚和Akt激活，誘導(dǎo)自噬和CagA降解。總之，VacA可導(dǎo)致細(xì)胞ROS的增加，并在Hp感染期間促進(jìn)炎癥和腫瘤環(huán)境的形成。

3. 尿素酶和中性粒細(xì)胞激活蛋白A(NapA)：尿素酶和NapA是Hp的兩個毒力因子，有助于中性粒細(xì)胞浸潤和ROS的產(chǎn)生。具體機(jī)制為：①NapA對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有趨化作用，通過G蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Src家族酪氨酸激酶和胞內(nèi)鈣離子濃度等信號通路，使NOX在質(zhì)膜上組裝，從而誘導(dǎo)活性氧中間體(ROI)的產(chǎn)生[4,11]。②NapA還可招募中性粒細(xì)胞至感染部位，NapA和尿素酶誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生氧化爆發(fā)，將大量ROS泄漏至感染的微環(huán)境中，從而導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激和DNA氧化損傷[12]。③感染過程中尿素酶可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氮物質(zhì)NO，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[9]。Uberti等[13]的研究還發(fā)現(xiàn)尿素酶可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤、高水平炎癥和ROS的產(chǎn)生，并可與其他因子放大胃部的炎癥過程。

4. γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)：Gong等[14]的研究已證實Hp的GGT可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞凋亡和炎癥途徑的激活。GGT可引起宿主細(xì)胞谷氨酰胺和谷胱甘肽的消耗和ROS的產(chǎn)生[15]。具體機(jī)制為：①Hp感染后在周質(zhì)中產(chǎn)生谷胱甘肽，在宿主細(xì)胞中具有抗氧化作用，但Hp的GGT可導(dǎo)致黏膜中谷氨酰胺和谷胱甘肽的消耗，降低細(xì)胞外谷胱甘肽水平，降低宿主細(xì)胞對ROS的抵抗力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[14-15]。②GGT可通過硫醇依賴的鐵還原產(chǎn)生ROS(如H2O2)，通過激活p38MAPK、AKT和NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、生長因子和IL-8[15-16]。IL-8在Hp誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)黏膜損傷中起主要作用，而COX-2過表達(dá)在Hp相關(guān)性胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。③研究表明Hp的GGT可導(dǎo)致8-羥基脫氧葡萄糖(8-OH-dG)含量增加，8-OH-dG為DNA損傷的直接標(biāo)志物和體內(nèi)ROS產(chǎn)生的替代標(biāo)志物，從而可認(rèn)為GGT引起氧化性DNA損傷[9,14]。

5. 脂多糖(LPS)：Hp細(xì)菌外膜上LPS可激活中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)的啟動，其可在中性粒細(xì)胞上通過依賴PI3K/RAC1途徑誘導(dǎo)NOX1的表達(dá)，還可通過刺激Hp表面Toll樣受體4(TLR4)產(chǎn)生過氧化物，增加炎癥細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞中iNOS表達(dá)，從而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[17]。LPS還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞快速氧化爆發(fā)，使Hp感染持續(xù)存在，從而誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致慢性炎癥、消化性潰瘍、胃炎和進(jìn)一步胃癌的發(fā)生[16]。

二、亞硝化應(yīng)激

Hp可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或浸潤的炎癥細(xì)胞表達(dá)iNOS[18-19]，將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為NO，也可上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)生成NO，NO會產(chǎn)生各種RNS[19]。NO可與金屬離子，如血紅素和鐵硫蛋白中的Fe2+產(chǎn)生亞硝?；磻?yīng)，從而影響細(xì)胞功能[20-21]。NO與NADPH氧化酶產(chǎn)生的超氧化物結(jié)合生成一種強(qiáng)氧化劑過氧亞硝酸鹽(ONOO-)[17,21]，分別通過產(chǎn)生硝基酪氨酸和DNA加合來損傷蛋白質(zhì)和DNA[22]，從而產(chǎn)生毒性效應(yīng)。此外，細(xì)胞內(nèi)的游離金屬或與蛋白質(zhì)結(jié)合的金屬可促進(jìn)NO單價氧化成亞硝酸根離子，其與谷胱甘肽相連接形成有毒的S-亞硝基谷胱甘肽[23]。NO可自動氧化成N2O3并導(dǎo)致DNA堿基脫氨[17]，過氧亞硝酸根也促進(jìn)DNA堿基的硝化，從而誘導(dǎo)DNA損傷，對Hp和宿主組織產(chǎn)生毒性作用[24]。實驗表明在Hp感染引發(fā)的慢性胃炎中，NO、iNOS、eNOS表達(dá)顯著增加[19,22]。與此同時，iNOS和eNOS過表達(dá)也促使機(jī)體產(chǎn)生更多的氧自由基，氧化應(yīng)激反應(yīng)會促使eNOS發(fā)生谷胱甘肽化反應(yīng)，加劇超氧化物的產(chǎn)生。NOS與ROS協(xié)同作用，創(chuàng)造一個有利于DNA損傷和腫瘤轉(zhuǎn)化的環(huán)境[9]。

三、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過控制蛋白質(zhì)的折疊和運輸在細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而參與維持細(xì)胞功能和存活。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于未折疊和(或)錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中聚集，可激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，通過激活細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能失衡。UPR早期通過各種機(jī)制以重建細(xì)胞內(nèi)外平衡以及恢復(fù)穩(wěn)態(tài)和正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，但當(dāng)壓力超出UPR的代償功能時，會導(dǎo)致細(xì)胞炎癥和凋亡[25-26]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)因子包括蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求因子1 (IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)[25]。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)域的3個跨膜受體蛋白PERK、IRE1和ATF6與鈣網(wǎng)織蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/BiP)處于結(jié)合狀態(tài)，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，處于未激活狀態(tài)。當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中增加時，GRP78從PERK、ATG-6和IRE1中釋放，從而激活3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力傳感器，產(chǎn)生UPR信號級聯(lián)反應(yīng)[23]。尤其是PERK的激活，可通過真核起始因子(EIF2)-α的磷酸化而誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白(CHOP)表達(dá)[27]。CHOP抑制抗凋亡蛋白Bcl的表達(dá)，激活促凋亡BH3蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)。另一個關(guān)鍵蛋白IRE1α可直接結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)，促進(jìn)凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)及其下游激酶活化，最終過通JNK激活caspase-12，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。

慢性Hp感染的壓力會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Baird等[29]發(fā)現(xiàn)Hp陽性的胃癌與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活和UPR顯著相關(guān)(92%)，HSPA5在Hp陽性患者腸化生中的表達(dá)增加，而HSPA5高表達(dá)與多種UPR效應(yīng)器失調(diào)有關(guān)，并與人類和小鼠胃黏膜中與Hp有關(guān)的腫瘤級聯(lián)反應(yīng)中的非細(xì)胞自主誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。在長時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，Hp可能通過激活UPR促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。說明對UPR的誘導(dǎo)發(fā)生在腸化生至異型增生的演變早期。還有研究發(fā)現(xiàn)在Hp陽性的腸化生中，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所激活的UPR中關(guān)鍵因子Bip、CHOP、IRE1α等的表達(dá)高于無萎縮的胃黏膜[25,30]，表明Hp誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在癌前病變形成的早期階段發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Hp VacA可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其分泌抗原HP0175來激活PERK，從而激活A(yù)TF4和CHOP，誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬和凋亡[25,30-31]。

急性Hp感染時缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，提示UPR激活可能是胃上皮細(xì)胞對慢性Hp感染的一種修復(fù)反應(yīng)。在Hp感染的胃黏膜中，慢性炎癥所致的長時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)了UPR的激活，而CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可促進(jìn)黏膜萎縮的發(fā)展，HSPA5過表達(dá)驅(qū)動的增殖可誘導(dǎo)腸化生向胃癌進(jìn)展。UPR作為一種適應(yīng)性反應(yīng)，Hp所致的慢性炎癥時可能促使細(xì)胞沿著腸化生-異型增生途徑進(jìn)展。

四、結(jié)語

綜上所述，Hp感染后炎癥的發(fā)生是由于多種損傷因素疊加引起的，包括應(yīng)激，尤其是氧化應(yīng)激、亞硝化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?？偨Y(jié)并研究應(yīng)激相關(guān)的機(jī)制，有助于更好地了解Hp感染在胃黏膜疾病中的重要作用，可能是治療Hp相關(guān)胃炎的慢性炎癥并阻止癌變發(fā)生的一個重要的新策略。