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        丁酸梭菌對小鼠健康狀況的影響

        2021-12-05 06:27:26李玉鵬李海花尚智援張效生
        中國飼料 2021年21期
        關(guān)鍵詞:丁酸梭菌細胞因子

        李玉鵬,李海花 ,尚智援,張效生

        (1.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381;2.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院,天津 300384;3.天津師范大學生命科學學院,天津 300387)

        近年來,我國對丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的研究步伐正在逐漸加快。研究表明,丁酸梭菌作為重要的益生菌之一,不僅能夠產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)(丁酸、氨基酸、維生素、纖維素等)和酶類(消化酶、蛋白酶等),供給機體利用,并且具有抗炎和提高免疫力等作用(Li 等,2018;Liao 等,2015;王騰浩,2015)。但有關(guān)丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠生長性能、血清細胞因子含量及緊密連接蛋白表達的機制仍不十分清楚。因此,本研究通過在小鼠上應用丁酸梭菌,研究其對小鼠生長性能、血清細胞因子含量和腸道健康狀況的影響,為進一步揭示丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠健康的機制,以及其在畜禽飼糧中的推廣應用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理 本研究采用單因子設(shè)計,選擇32 只體況正常,體重為21.86 g 的昆明(KM)小鼠,按完全隨機區(qū)組設(shè)計分為4 組,每組8 個重復。4 個處理組均飼喂商品飼糧,即對照組、丁酸梭菌組(CB)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 組(ETEC)以及CB+ETEC 組。對照組用0.2 mL 生理鹽水灌胃,CB 組用0.2 mL 2×106cfu/ml 的丁酸梭菌灌胃,ETEC 組用0.2 ml 2×108cfu/mL 的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 灌胃(該組攻毒前的處理同對照組),CB+ETEC 組攻毒前的處理同CB 組。攻毒24 h 后采集相關(guān)樣品。正式試驗周期為14 d,預飼期3 d,所有小鼠自由采食和飲水,期間觀察小鼠健康狀況并記錄小鼠腹瀉率和死亡率。

        1.2 試驗材料及其處理 試驗所用丁酸梭菌為實驗室自己培養(yǎng),原菌液活菌數(shù)為1×1010cfu/mL,試驗前將其稀釋到所需濃度。

        1.3 生長性能 在正式試驗開始第1、7、14 天對小鼠稱重,計算每組平均體重。

        1.4 樣品的采集 試驗結(jié)束時,在相對封閉的空間內(nèi)用棉花蘸取乙醚,對小鼠進行麻醉,摘除眼球采血,當血液流盡時,用脫臼法處死小鼠。將血液裝于離心管中,置37 ℃溫箱1 h,待血液凝固,血塊收縮后,4000 g 離 心10 min,取上清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌條件下迅速打開腹腔,分離并采集回腸腸管,用磷酸緩沖液(PBS)沖洗干凈置于凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 指標測定及方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定血清中二胺氧化酶(DAO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及白介素-8(IL-8)的含量(均購自美國BD 公司)。采用Western blot 檢測回腸中靶蛋白ZO-1 和occludin 的含量(抗ZO-1 抗體、抗occludin 抗體和抗β-actin 均購自Abcam公司)。

        1.6 數(shù)據(jù)分析 以單只小鼠為單位進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計,利用Excel 2016 對試驗數(shù)據(jù)進行初步分析;采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),統(tǒng)計結(jié)果P <0.05 表示差異顯著,P <0.01 表示差異極顯著。采用Graph-Pad Prism 5 軟件進行圖像處理及分析。

        2 結(jié)果及分析

        2.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 由表1 可知,在1~14 d 階段,小鼠體重總體呈上升趨勢,在第7、14 天時稱重,與對照組相比,CB 組體重分別提高了5.79%和3.97%,但差異均不顯著(P >0.05)。CB 組小鼠沒有發(fā)生腹瀉及死亡。試驗結(jié)果表明,給小鼠飼喂CB,不影響其生長性能。

        表1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響

        2.2 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子含量的影響由圖1 可知,與對照組相比,CB 組小鼠血清細胞因子DAO、TNF-α 和IL-8 的含量無顯著變化(P>0.05),但DAO 的含量有下降趨勢,降低了5.57%,而TNF-α 和IL-8 則與之相反,分別提高了12.41%和20.50%。在ETEC 攻毒后,CB 組DAO、TNF-α 及IL-8 的含量顯著降低,分別降低了13.81%、29.61%和37.29%(P <0.05)。試驗結(jié)果表明,ETEC 感染導致小鼠機體發(fā)生炎癥反應,促進機體產(chǎn)生促炎性細胞因子,但是CB 能夠降低ETEC 誘導的促炎性細胞因子的水平。

        圖1 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子含量的影響

        2.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達量的影響 由圖2 可知,與對照組相比,CB 組ZO-1 和occludin 表達量分別提高了40%和20%;與對照組相比,ETEC 組ZO-1 和occludin表達量分別降低61%和27%,差異均顯著(P <0.01,P <0.05);與ETEC 組相比,CB+ETEC 組ZO-1 和occludin 表達量分別提高了184.61%和24.66%,差異均顯著(P <0.01,P <0.05)。試驗結(jié)果表明,ETEC 感染能夠?qū)е滦∈蠡啬c中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達量下降,但是CB 能夠逆轉(zhuǎn)ETEC 造成的緊密連接蛋白表達下降。

        圖2 丁酸梭菌對小鼠回腸緊密連接蛋白相對表達量的影響

        3 討論

        3.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 丁酸梭菌即丁酸梭狀芽孢桿菌,對多種抗生素具有較強的耐藥性,研究表明,其僅對新生霉素、萬古霉素、四環(huán)素等幾種抗生素敏感。且丁酸梭菌能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫、高熱,以及耐受機體胃液、膽汁酸、消化酶等的作用。因此,我國當前已在畜牧生產(chǎn)中逐步推廣應用該新型益生菌(李玉鵬等,2017)。本研究結(jié)果表明,試驗全程,各組小鼠均沒有發(fā)生腹瀉,成活率為100%,在保證小鼠原有營養(yǎng)水平的同時,給小鼠灌胃適量的CB,不影響其生長性能,且沒有給小鼠的健康造成不良影響。

        3.2 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子的影響 丁酸梭菌能夠分泌多種營養(yǎng)物質(zhì),既有直接的營養(yǎng)功能,又能夠激活動物機體免疫系統(tǒng),增強機體免疫力,維持動物健康。炎癥反應是機體的一種自我保護,適度時能幫助機體清除病原體,但過度的炎癥反應則會對組織造成傷害,甚至能夠危及生命,因而,正常情況下機體的炎癥反應與抗炎癥反應是處于平衡狀態(tài)的(李玉鵬等,2017)。二胺氧化酶(DAO)是一種高活性的細胞內(nèi)酶,處于動物小腸黏膜上層絨毛中,其活性與黏膜細胞的核酸及蛋白合成高度關(guān)聯(lián),可以反映機體腸道中機械屏障的完整度和受損情況。腸屏障功能受損時,腸黏膜上皮細胞將釋放DAO 進入血液(Shu 等,2016)。因此,血清中的DAO 活性能夠在一定程度上反映上皮細胞黏膜的受損情況,常作為判斷腸道通透性改變的內(nèi)源指標(Zhao 等,2014)。腫瘤壞死因子(TNF-α)也是評判動物機體發(fā)生炎癥反應的一個重要指標,入侵機體的外來病原體會刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α,然后誘導機體發(fā)生炎癥反應(Feng 等,2016;Liu等,2009)。機體產(chǎn)生適量的TNF-α 時,能夠促進損傷組織的修復,誘導腫瘤細胞凋亡,抵抗病毒感染等,且對免疫應答具有一定的調(diào)節(jié)作用,但過量產(chǎn)生時則會造成機體免疫平衡的紊亂(李?;ǖ?,2019)。作為機體炎性因子之一,IL-8 是一種較強的趨化性活性因子,與外來病原體等刺激物誘導的緊密連接蛋白表達的改變相關(guān),在機體腸道發(fā)生的炎癥反應中具有重要作用(Rostami等,2013)。通常當機體腸道發(fā)生炎癥反應時,血清中TNF-α 以及IL-8 含量會顯著上升,因此,二者能在一定程度上反映動物機體的健康狀況(王柳懿等,2013)。研究表明,微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠降低小鼠血清中IL-6與TNF-α 含量(張琳等,2020)。本研究表明,給小鼠灌胃適量CB 后,血清中的TNF-α 以及IL-8 含量有上升趨勢,使小鼠處于免疫激活狀態(tài),適度地提升了機體的免疫力,并且能夠降低ETEC 誘導的促炎性細胞因子的含量。

        3.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達量的影響 腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關(guān),單層腸上皮細胞通過緊密連接蛋白結(jié)合形成腸道屏障,能夠有效阻止從腸腔進入血液的有害微生物、抗原和毒素(Séverine 等,2021)。緊密連接包括跨膜蛋白(封閉蛋白和閉合蛋白)以及各種被招募到頂外側(cè)膜的胞漿蛋白,如緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2 和occludin 等,它們經(jīng)細胞骨架影響細胞形態(tài)和信號傳遞(Heinemann 和Schuetz,2019),被公認為能夠調(diào)節(jié)上皮細胞旁通路并在腸道通透性中發(fā)揮重要作用(He 等,2019)。研究表明,內(nèi)源性或外源性毒素引起的炎癥會導致腸道屏障功能障礙(He 等,2019),與本研究結(jié)果一致。研究表明,微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠提高小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白occludin 和claudin-1 的表達量,緩解小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎病癥(張琳等,2020)。給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌的飼糧,能夠提高其腸道中緊密連蛋白ZO-1、ZO-2、occludin 和claudin-1 mRNA 水平的相對表達量,降低機體炎癥反應,改善腸道通透性,維護腸道上皮的完整性,有利于機體發(fā)揮腸道屏障功能(李海花等,2019;李玉鵬等,2017)。本研究表明,ETEC 感染能夠降低小鼠回腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達,但是這種不利影響能夠被CB 部分逆轉(zhuǎn)。

        4 結(jié)論

        丁酸梭菌能夠調(diào)節(jié)小鼠機體的炎癥反應,維護機體的免疫平衡,且不影響小鼠的健康狀況。此外,丁酸梭菌能夠促進緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達,減輕由致病性大腸桿菌導致的機體損傷程度,改善其腸道健康狀況。

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