李玉鵬，李海花 ，尚智援，張效生

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

近年來，我國對丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的研究步伐正在逐漸加快。研究表明，丁酸梭菌作為重要的益生菌之一，不僅能夠產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)（丁酸、氨基酸、維生素、纖維素等）和酶類（消化酶、蛋白酶等），供給機(jī)體利用，并且具有抗炎和提高免疫力等作用（Li 等，2018；Liao 等，2015；王騰浩，2015）。但有關(guān)丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠生長性能、血清細(xì)胞因子含量及緊密連接蛋白表達(dá)的機(jī)制仍不十分清楚。因此，本研究通過在小鼠上應(yīng)用丁酸梭菌，研究其對小鼠生長性能、血清細(xì)胞因子含量和腸道健康狀況的影響，為進(jìn)一步揭示丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠健康的機(jī)制，以及其在畜禽飼糧中的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理 本研究采用單因子設(shè)計(jì)，選擇32 只體況正常，體重為21.86 g 的昆明（KM）小鼠，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為4 組，每組8 個(gè)重復(fù)。4 個(gè)處理組均飼喂商品飼糧，即對照組、丁酸梭菌組（CB）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 組（ETEC）以及CB+ETEC 組。對照組用0.2 mL 生理鹽水灌胃，CB 組用0.2 mL 2×106cfu/ml 的丁酸梭菌灌胃，ETEC 組用0.2 ml 2×108cfu/mL 的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 灌胃（該組攻毒前的處理同對照組），CB+ETEC 組攻毒前的處理同CB 組。攻毒24 h 后采集相關(guān)樣品。正式試驗(yàn)周期為14 d，預(yù)飼期3 d，所有小鼠自由采食和飲水，期間觀察小鼠健康狀況并記錄小鼠腹瀉率和死亡率。

1.2 試驗(yàn)材料及其處理 試驗(yàn)所用丁酸梭菌為實(shí)驗(yàn)室自己培養(yǎng)，原菌液活菌數(shù)為1×1010cfu/mL，試驗(yàn)前將其稀釋到所需濃度。

1.3 生長性能 在正式試驗(yàn)開始第1、7、14 天對小鼠稱重，計(jì)算每組平均體重。

1.4 樣品的采集 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在相對封閉的空間內(nèi)用棉花蘸取乙醚，對小鼠進(jìn)行麻醉，摘除眼球采血，當(dāng)血液流盡時(shí)，用脫臼法處死小鼠。將血液裝于離心管中，置37 ℃溫箱1 h，待血液凝固，血塊收縮后，4000 g 離 心10 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌條件下迅速打開腹腔，分離并采集回腸腸管，用磷酸緩沖液（PBS）沖洗干凈置于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)測定及方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒測定血清中二胺氧化酶（DAO）、腫瘤壞死因子（TNF-α）以及白介素-8（IL-8）的含量（均購自美國BD 公司）。采用Western blot 檢測回腸中靶蛋白ZO-1 和occludin 的含量（抗ZO-1 抗體、抗occludin 抗體和抗β-actin 均購自Abcam公司）。

1.6 數(shù)據(jù)分析 以單只小鼠為單位進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用Excel 2016 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析；采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），統(tǒng)計(jì)結(jié)果P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。采用Graph-Pad Prism 5 軟件進(jìn)行圖像處理及分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 由表1 可知，在1～14 d 階段，小鼠體重總體呈上升趨勢，在第7、14 天時(shí)稱重，與對照組相比，CB 組體重分別提高了5.79%和3.97%，但差異均不顯著（P ＞0.05）。CB 組小鼠沒有發(fā)生腹瀉及死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠飼喂CB，不影響其生長性能。

表1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響

2.2 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響由圖1 可知，與對照組相比，CB 組小鼠血清細(xì)胞因子DAO、TNF-α 和IL-8 的含量無顯著變化（P＞0.05），但DAO 的含量有下降趨勢，降低了5.57%，而TNF-α 和IL-8 則與之相反，分別提高了12.41%和20.50%。在ETEC 攻毒后，CB 組DAO、TNF-α 及IL-8 的含量顯著降低，分別降低了13.81%、29.61%和37.29%（P ＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，ETEC 感染導(dǎo)致小鼠機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，但是CB 能夠降低ETEC 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的水平。

圖1 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

2.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響 由圖2 可知，與對照組相比，CB 組ZO-1 和occludin 表達(dá)量分別提高了40%和20%；與對照組相比，ETEC 組ZO-1 和occludin表達(dá)量分別降低61%和27%，差異均顯著（P ＜0.01，P ＜0.05）；與ETEC 組相比，CB+ETEC 組ZO-1 和occludin 表達(dá)量分別提高了184.61%和24.66%，差異均顯著（P ＜0.01，P ＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，ETEC 感染能夠?qū)е滦∈蠡啬c中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá)量下降，但是CB 能夠逆轉(zhuǎn)ETEC 造成的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

圖2 丁酸梭菌對小鼠回腸緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 丁酸梭菌即丁酸梭狀芽孢桿菌，對多種抗生素具有較強(qiáng)的耐藥性，研究表明，其僅對新生霉素、萬古霉素、四環(huán)素等幾種抗生素敏感。且丁酸梭菌能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫、高熱，以及耐受機(jī)體胃液、膽汁酸、消化酶等的作用。因此，我國當(dāng)前已在畜牧生產(chǎn)中逐步推廣應(yīng)用該新型益生菌（李玉鵬等，2017）。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)全程，各組小鼠均沒有發(fā)生腹瀉，成活率為100%，在保證小鼠原有營養(yǎng)水平的同時(shí)，給小鼠灌胃適量的CB，不影響其生長性能，且沒有給小鼠的健康造成不良影響。

3.2 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子的影響 丁酸梭菌能夠分泌多種營養(yǎng)物質(zhì)，既有直接的營養(yǎng)功能，又能夠激活動物機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，維持動物健康。炎癥反應(yīng)是機(jī)體的一種自我保護(hù)，適度時(shí)能幫助機(jī)體清除病原體，但過度的炎癥反應(yīng)則會對組織造成傷害，甚至能夠危及生命，因而，正常情況下機(jī)體的炎癥反應(yīng)與抗炎癥反應(yīng)是處于平衡狀態(tài)的（李玉鵬等，2017）。二胺氧化酶（DAO）是一種高活性的細(xì)胞內(nèi)酶，處于動物小腸黏膜上層絨毛中，其活性與黏膜細(xì)胞的核酸及蛋白合成高度關(guān)聯(lián)，可以反映機(jī)體腸道中機(jī)械屏障的完整度和受損情況。腸屏障功能受損時(shí)，腸黏膜上皮細(xì)胞將釋放DAO 進(jìn)入血液（Shu 等，2016）。因此，血清中的DAO 活性能夠在一定程度上反映上皮細(xì)胞黏膜的受損情況，常作為判斷腸道通透性改變的內(nèi)源指標(biāo)（Zhao 等，2014）。腫瘤壞死因子（TNF-α）也是評判動物機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，入侵機(jī)體的外來病原體會刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，然后誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)（Feng 等，2016；Liu等，2009）。機(jī)體產(chǎn)生適量的TNF-α 時(shí)，能夠促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抵抗病毒感染等，且對免疫應(yīng)答具有一定的調(diào)節(jié)作用，但過量產(chǎn)生時(shí)則會造成機(jī)體免疫平衡的紊亂（李海花等，2019）。作為機(jī)體炎性因子之一，IL-8 是一種較強(qiáng)的趨化性活性因子，與外來病原體等刺激物誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)的改變相關(guān)，在機(jī)體腸道發(fā)生的炎癥反應(yīng)中具有重要作用（Rostami等，2013）。通常當(dāng)機(jī)體腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，血清中TNF-α 以及IL-8 含量會顯著上升，因此，二者能在一定程度上反映動物機(jī)體的健康狀況（王柳懿等，2013）。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠降低小鼠血清中IL-6與TNF-α 含量（張琳等，2020）。本研究表明，給小鼠灌胃適量CB 后，血清中的TNF-α 以及IL-8 含量有上升趨勢，使小鼠處于免疫激活狀態(tài)，適度地提升了機(jī)體的免疫力，并且能夠降低ETEC 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的含量。

3.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響 腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關(guān)，單層腸上皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白結(jié)合形成腸道屏障，能夠有效阻止從腸腔進(jìn)入血液的有害微生物、抗原和毒素（Séverine 等，2021）。緊密連接包括跨膜蛋白（封閉蛋白和閉合蛋白）以及各種被招募到頂外側(cè)膜的胞漿蛋白，如緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2 和occludin 等，它們經(jīng)細(xì)胞骨架影響細(xì)胞形態(tài)和信號傳遞（Heinemann 和Schuetz，2019），被公認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞旁通路并在腸道通透性中發(fā)揮重要作用（He 等，2019）。研究表明，內(nèi)源性或外源性毒素引起的炎癥會導(dǎo)致腸道屏障功能障礙（He 等，2019），與本研究結(jié)果一致。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠提高小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白o(hù)ccludin 和claudin-1 的表達(dá)量，緩解小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎病癥（張琳等，2020）。給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌的飼糧，能夠提高其腸道中緊密連蛋白ZO-1、ZO-2、occludin 和claudin-1 mRNA 水平的相對表達(dá)量，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善腸道通透性，維護(hù)腸道上皮的完整性，有利于機(jī)體發(fā)揮腸道屏障功能（李?；ǖ?，2019；李玉鵬等，2017）。本研究表明，ETEC 感染能夠降低小鼠回腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá)，但是這種不利影響能夠被CB 部分逆轉(zhuǎn)。

4 結(jié)論

丁酸梭菌能夠調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)，維護(hù)機(jī)體的免疫平衡，且不影響小鼠的健康狀況。此外，丁酸梭菌能夠促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)，減輕由致病性大腸桿菌導(dǎo)致的機(jī)體損傷程度，改善其腸道健康狀況。