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        丁酸梭菌對小鼠健康狀況的影響

        2021-12-05 06:27:26李玉鵬李?;?/span>尚智援張效生
        中國飼料 2021年21期
        關(guān)鍵詞:丁酸梭菌細(xì)胞因子

        李玉鵬,李海花 ,尚智援,張效生

        (1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381;2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384;3.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387)

        近年來,我國對丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的研究步伐正在逐漸加快。研究表明,丁酸梭菌作為重要的益生菌之一,不僅能夠產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)(丁酸、氨基酸、維生素、纖維素等)和酶類(消化酶、蛋白酶等),供給機(jī)體利用,并且具有抗炎和提高免疫力等作用(Li 等,2018;Liao 等,2015;王騰浩,2015)。但有關(guān)丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠生長性能、血清細(xì)胞因子含量及緊密連接蛋白表達(dá)的機(jī)制仍不十分清楚。因此,本研究通過在小鼠上應(yīng)用丁酸梭菌,研究其對小鼠生長性能、血清細(xì)胞因子含量和腸道健康狀況的影響,為進(jìn)一步揭示丁酸梭菌調(diào)節(jié)小鼠健康的機(jī)制,以及其在畜禽飼糧中的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理 本研究采用單因子設(shè)計(jì),選擇32 只體況正常,體重為21.86 g 的昆明(KM)小鼠,按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為4 組,每組8 個(gè)重復(fù)。4 個(gè)處理組均飼喂商品飼糧,即對照組、丁酸梭菌組(CB)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 組(ETEC)以及CB+ETEC 組。對照組用0.2 mL 生理鹽水灌胃,CB 組用0.2 mL 2×106cfu/ml 的丁酸梭菌灌胃,ETEC 組用0.2 ml 2×108cfu/mL 的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 灌胃(該組攻毒前的處理同對照組),CB+ETEC 組攻毒前的處理同CB 組。攻毒24 h 后采集相關(guān)樣品。正式試驗(yàn)周期為14 d,預(yù)飼期3 d,所有小鼠自由采食和飲水,期間觀察小鼠健康狀況并記錄小鼠腹瀉率和死亡率。

        1.2 試驗(yàn)材料及其處理 試驗(yàn)所用丁酸梭菌為實(shí)驗(yàn)室自己培養(yǎng),原菌液活菌數(shù)為1×1010cfu/mL,試驗(yàn)前將其稀釋到所需濃度。

        1.3 生長性能 在正式試驗(yàn)開始第1、7、14 天對小鼠稱重,計(jì)算每組平均體重。

        1.4 樣品的采集 試驗(yàn)結(jié)束時(shí),在相對封閉的空間內(nèi)用棉花蘸取乙醚,對小鼠進(jìn)行麻醉,摘除眼球采血,當(dāng)血液流盡時(shí),用脫臼法處死小鼠。將血液裝于離心管中,置37 ℃溫箱1 h,待血液凝固,血塊收縮后,4000 g 離 心10 min,取上清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌條件下迅速打開腹腔,分離并采集回腸腸管,用磷酸緩沖液(PBS)沖洗干凈置于凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 指標(biāo)測定及方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定血清中二胺氧化酶(DAO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及白介素-8(IL-8)的含量(均購自美國BD 公司)。采用Western blot 檢測回腸中靶蛋白ZO-1 和occludin 的含量(抗ZO-1 抗體、抗occludin 抗體和抗β-actin 均購自Abcam公司)。

        1.6 數(shù)據(jù)分析 以單只小鼠為單位進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),利用Excel 2016 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析;采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),統(tǒng)計(jì)結(jié)果P <0.05 表示差異顯著,P <0.01 表示差異極顯著。采用Graph-Pad Prism 5 軟件進(jìn)行圖像處理及分析。

        2 結(jié)果及分析

        2.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 由表1 可知,在1~14 d 階段,小鼠體重總體呈上升趨勢,在第7、14 天時(shí)稱重,與對照組相比,CB 組體重分別提高了5.79%和3.97%,但差異均不顯著(P >0.05)。CB 組小鼠沒有發(fā)生腹瀉及死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明,給小鼠飼喂CB,不影響其生長性能。

        表1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響

        2.2 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響由圖1 可知,與對照組相比,CB 組小鼠血清細(xì)胞因子DAO、TNF-α 和IL-8 的含量無顯著變化(P>0.05),但DAO 的含量有下降趨勢,降低了5.57%,而TNF-α 和IL-8 則與之相反,分別提高了12.41%和20.50%。在ETEC 攻毒后,CB 組DAO、TNF-α 及IL-8 的含量顯著降低,分別降低了13.81%、29.61%和37.29%(P <0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明,ETEC 感染導(dǎo)致小鼠機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子,但是CB 能夠降低ETEC 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的水平。

        圖1 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

        2.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響 由圖2 可知,與對照組相比,CB 組ZO-1 和occludin 表達(dá)量分別提高了40%和20%;與對照組相比,ETEC 組ZO-1 和occludin表達(dá)量分別降低61%和27%,差異均顯著(P <0.01,P <0.05);與ETEC 組相比,CB+ETEC 組ZO-1 和occludin 表達(dá)量分別提高了184.61%和24.66%,差異均顯著(P <0.01,P <0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明,ETEC 感染能夠?qū)е滦∈蠡啬c中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá)量下降,但是CB 能夠逆轉(zhuǎn)ETEC 造成的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

        圖2 丁酸梭菌對小鼠回腸緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響

        3 討論

        3.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 丁酸梭菌即丁酸梭狀芽孢桿菌,對多種抗生素具有較強(qiáng)的耐藥性,研究表明,其僅對新生霉素、萬古霉素、四環(huán)素等幾種抗生素敏感。且丁酸梭菌能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫、高熱,以及耐受機(jī)體胃液、膽汁酸、消化酶等的作用。因此,我國當(dāng)前已在畜牧生產(chǎn)中逐步推廣應(yīng)用該新型益生菌(李玉鵬等,2017)。本研究結(jié)果表明,試驗(yàn)全程,各組小鼠均沒有發(fā)生腹瀉,成活率為100%,在保證小鼠原有營養(yǎng)水平的同時(shí),給小鼠灌胃適量的CB,不影響其生長性能,且沒有給小鼠的健康造成不良影響。

        3.2 丁酸梭菌對小鼠血清細(xì)胞因子的影響 丁酸梭菌能夠分泌多種營養(yǎng)物質(zhì),既有直接的營養(yǎng)功能,又能夠激活動物機(jī)體免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體免疫力,維持動物健康。炎癥反應(yīng)是機(jī)體的一種自我保護(hù),適度時(shí)能幫助機(jī)體清除病原體,但過度的炎癥反應(yīng)則會對組織造成傷害,甚至能夠危及生命,因而,正常情況下機(jī)體的炎癥反應(yīng)與抗炎癥反應(yīng)是處于平衡狀態(tài)的(李玉鵬等,2017)。二胺氧化酶(DAO)是一種高活性的細(xì)胞內(nèi)酶,處于動物小腸黏膜上層絨毛中,其活性與黏膜細(xì)胞的核酸及蛋白合成高度關(guān)聯(lián),可以反映機(jī)體腸道中機(jī)械屏障的完整度和受損情況。腸屏障功能受損時(shí),腸黏膜上皮細(xì)胞將釋放DAO 進(jìn)入血液(Shu 等,2016)。因此,血清中的DAO 活性能夠在一定程度上反映上皮細(xì)胞黏膜的受損情況,常作為判斷腸道通透性改變的內(nèi)源指標(biāo)(Zhao 等,2014)。腫瘤壞死因子(TNF-α)也是評判動物機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo),入侵機(jī)體的外來病原體會刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,然后誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)(Feng 等,2016;Liu等,2009)。機(jī)體產(chǎn)生適量的TNF-α 時(shí),能夠促進(jìn)損傷組織的修復(fù),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抵抗病毒感染等,且對免疫應(yīng)答具有一定的調(diào)節(jié)作用,但過量產(chǎn)生時(shí)則會造成機(jī)體免疫平衡的紊亂(李海花等,2019)。作為機(jī)體炎性因子之一,IL-8 是一種較強(qiáng)的趨化性活性因子,與外來病原體等刺激物誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)的改變相關(guān),在機(jī)體腸道發(fā)生的炎癥反應(yīng)中具有重要作用(Rostami等,2013)。通常當(dāng)機(jī)體腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),血清中TNF-α 以及IL-8 含量會顯著上升,因此,二者能在一定程度上反映動物機(jī)體的健康狀況(王柳懿等,2013)。研究表明,微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠降低小鼠血清中IL-6與TNF-α 含量(張琳等,2020)。本研究表明,給小鼠灌胃適量CB 后,血清中的TNF-α 以及IL-8 含量有上升趨勢,使小鼠處于免疫激活狀態(tài),適度地提升了機(jī)體的免疫力,并且能夠降低ETEC 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的含量。

        3.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達(dá)量的影響 腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關(guān),單層腸上皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白結(jié)合形成腸道屏障,能夠有效阻止從腸腔進(jìn)入血液的有害微生物、抗原和毒素(Séverine 等,2021)。緊密連接包括跨膜蛋白(封閉蛋白和閉合蛋白)以及各種被招募到頂外側(cè)膜的胞漿蛋白,如緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2 和occludin 等,它們經(jīng)細(xì)胞骨架影響細(xì)胞形態(tài)和信號傳遞(Heinemann 和Schuetz,2019),被公認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞旁通路并在腸道通透性中發(fā)揮重要作用(He 等,2019)。研究表明,內(nèi)源性或外源性毒素引起的炎癥會導(dǎo)致腸道屏障功能障礙(He 等,2019),與本研究結(jié)果一致。研究表明,微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠提高小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白o(hù)ccludin 和claudin-1 的表達(dá)量,緩解小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎病癥(張琳等,2020)。給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌的飼糧,能夠提高其腸道中緊密連蛋白ZO-1、ZO-2、occludin 和claudin-1 mRNA 水平的相對表達(dá)量,降低機(jī)體炎癥反應(yīng),改善腸道通透性,維護(hù)腸道上皮的完整性,有利于機(jī)體發(fā)揮腸道屏障功能(李?;ǖ?,2019;李玉鵬等,2017)。本研究表明,ETEC 感染能夠降低小鼠回腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá),但是這種不利影響能夠被CB 部分逆轉(zhuǎn)。

        4 結(jié)論

        丁酸梭菌能夠調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng),維護(hù)機(jī)體的免疫平衡,且不影響小鼠的健康狀況。此外,丁酸梭菌能夠促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá),減輕由致病性大腸桿菌導(dǎo)致的機(jī)體損傷程度,改善其腸道健康狀況。

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