江成英，劉曉蘭，王 松

（1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西梧州 543000；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白粉是玉米加工后的具有高能量、高蛋白質(zhì)的副產(chǎn)品，常作為一種飼料資源在畜禽飼料中使用（楊露等，2018）。但其氣味特殊、口感不好、水溶性差、缺乏必需氨基酸等缺點，導(dǎo)致畜禽對玉米蛋白質(zhì)的利用率相對較低，從而限制了其在飼料中的應(yīng)用（趙謀明等，2019）。對玉米蛋白粉進行加工處理，提高其蛋白的水溶性是解決這一問題的關(guān)鍵。目前，常用處理方法有物理法、酶解法和微生物法。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶類能夠?qū)⒌鞍追壑须y以被吸收利用的植物大分子蛋白質(zhì)降解為分子質(zhì)量較小的多肽、小肽或游離氨基酸，從而提高其蛋白的利用率（向麗蓉等，2019）。王念祥等（2009）利用好食脈孢霉發(fā)酵玉米蛋白粉，使蛋白粉的蛋白質(zhì)溶出率達到25.31%。魏炳棟等（2017）研究表明，利用復(fù)合菌發(fā)酵玉米蛋白粉后，其粗蛋白質(zhì)、多肽和總必需氨基酸含量均明顯增加。王松等（2019）采用紫外誘變的方法,篩選出一株枯草芽孢突變菌株，可將玉米蛋白粉飼料中的可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率由原始菌株的37.39%提高到47.83%。

本試驗以添加一定比例麩皮的玉米蛋白粉為原料，進行多菌種混合固態(tài)發(fā)酵飼料的制備，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析法，優(yōu)化發(fā)酵工藝，為玉米蛋白粉發(fā)酵飼料的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌均由齊齊哈爾大學(xué)生物工程實驗室提供。

1.2 原料 玉米蛋白粉：中糧生化能源（龍江）有限公司提供；麩皮：市售。

1.3 試劑 酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鈉、酚酞、鎢酸鈉、鹽酸、酵母粉、鉬酸鈉、磷酸、胰蛋白胨、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂等試劑均購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.4 主要儀器 SYQ-DSK-280B 型手提式壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），TU-1810 型紫外可見分光光度計（日本島津儀器廠），PHS-25 型數(shù)顯pH 計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ZHJH-C2109C 型超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器廠），PYX-DHS-40×50-BS-I 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）等。

1.5 試驗方法

1.5.1 可溶性蛋白含量的測定 采用福林酚法測定可溶性蛋白含量（王永華，2010）。

1.5.2 單因素試驗 將玉米蛋白粉與麩皮以一定比例混合，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入混合菌種（枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合）進行固態(tài)發(fā)酵，通過測定發(fā)酵物料中的可溶性蛋白含量研究物料比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量對發(fā)酵飼料的影響。

1.5.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計（CCD）原理，以可溶蛋白含量為響應(yīng)值，使用Design-Expert8.0.5 軟件，選取料水比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）及發(fā)酵時間（D）為自變量，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面法對試驗結(jié)果進行優(yōu)化，以確定最佳的發(fā)酵工藝條件。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于30 ℃進行固態(tài)發(fā)酵，48 h 后每隔12 h 檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵時間對可溶性蛋白含量的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種分別于28、30、32、34 ℃進行固態(tài)發(fā)酵，84 h 后檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵溫度對可溶性蛋白含量的影響

2.1.3 物料比對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮分別以4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 的比例混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進行固態(tài)發(fā)酵，84 h 后檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表4。

表4 物料比（玉米蛋白粉：麩皮）對可溶性蛋白含量的影響

2.1.4 接種量對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后分別接入1%、5%、8%、10%、15%的混合菌種于32 ℃進行固態(tài)發(fā)酵，84 h 后檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表5。

表5 接種量對可溶性蛋白含量的影響

2.1.5 料水比對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比分別為1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進行固態(tài)發(fā)酵，84 h 后檢測發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表6。

由單因素試驗結(jié)果可以看出，可溶性蛋白含量最高的單因素條件分別為：物料比7：3，料水比1：1.2，發(fā)酵時間84 h，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量15%。但15%接種量與5%接種量的可溶性蛋白提高不是很大，綜合考慮經(jīng)濟因素，初步確定多菌種固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白飼料的工藝條件為：物料比（玉米蛋白粉：麩皮）7：3，料水比1：1.2，發(fā)酵時間84 h，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量5%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.1 模型的建立與顯著性分析 在單因素試驗基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計，選取原料物料比例為7∶3、混菌比例為1∶1∶1，以料水比例（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因子，以可溶蛋白含量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計4 因素3 水平響應(yīng)面試驗，以優(yōu)化發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的工藝參數(shù)，結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸模型方差分析，結(jié)果見表8。

表8 回歸模型方差分析

用Design-Expert.V8.0.5 軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸方程擬合，獲得以感官評分為目標函數(shù)的二次回歸擬合方程：

Y=12.56 +1.11A +0.25B +0.098C +0.30D +0.13AB-0.055AC-0.025AD+0.080BC-0.035CD-0.29A2-0.034B2+0.051C2-0.31D2。

由表8 可知，用響應(yīng)面法建立的二次回歸模型極顯著（P ＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.0892＞0.05），說明所得模型擬合程度較好，該回歸模型能夠很好地對響應(yīng)值進行預(yù)測。一次項B、一次項D、二次項A2和二次項D2為顯著（P ＜0.05），一次項A 為極顯著（P ＜0.01），交互項不顯著（P ＞0.05）。各因素對發(fā)酵玉米蛋白粉飼料可溶蛋白含量的影響強弱次序為料水比例（A）＞發(fā)酵時間（D）＞接種量（B）＞發(fā)酵溫度（C）。

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果 各因素交互作用對可溶性蛋白影響的響應(yīng)面圖見圖1。

圖1 各因素交互作用對可溶性蛋白影響的響應(yīng)面

2.2.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化與驗證結(jié)果 經(jīng)Design-Expert8.0.5 軟件優(yōu)化處理后，得到發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的最佳工藝條件為：原料物料比例7∶3、混菌比例1∶1∶1、料水比例1：1.3、接種量6%、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間87.08 h。

為了驗證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性，將響應(yīng)面優(yōu)化方案修約后的工藝條件進行3 組平行發(fā)酵試驗，3 個試驗組發(fā)酵飼料中可溶蛋白含量平均值可以達到13.77%，與理論預(yù)測值13.8894%的相對誤差為0.85%，與試驗結(jié)果相符。

3 結(jié)論

以多菌種組合進行固態(tài)發(fā)酵玉蛋白粉飼料的制備，通過單因素及響應(yīng)面試驗確定了最佳發(fā)酵工藝條件為：將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比為1：1.3，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入6%的混合菌種（枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合），于33 ℃條件下固態(tài)發(fā)酵87.08 h。在此條件下，發(fā)酵飼料中可溶蛋白含量可達13.77%，可用于發(fā)酵玉米蛋白粉生產(chǎn)飼料。