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        健脾清熱活血方介導(dǎo)keap-1-Nrf2信號(hào)調(diào)控claudin-2表達(dá)干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠實(shí)驗(yàn)研究*

        2021-12-04 10:05:18羅淑娟陳小芬林逸婷
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2021年11期
        關(guān)鍵詞:健脾結(jié)腸活血

        羅淑娟 陳小芬 林逸婷 盧 鑫 張 濤

        (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院,廣西 南寧 530222;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧530011;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011)

        本課題組前期臨床研究證實(shí),健脾清熱活血方具有明確緩解輕度潰瘍性結(jié)腸炎(UC)效用,其療效與艾迪莎相仿,對(duì)于中度UC患者配合激素使用,亦有輔助作用[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健脾清熱活血方具有促進(jìn)黏膜屏障修復(fù),誘導(dǎo)炎癥緩解的效用,但其具體的機(jī)制還有待深入研究[2]。UC發(fā)病機(jī)制與氧自由基產(chǎn)生過(guò)多及脂質(zhì)過(guò)氧化有密切關(guān)系,血管活性因子即腸源性縮血管物質(zhì)活性增強(qiáng),導(dǎo)致腸道缺血,同時(shí)結(jié)腸黏膜中的炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等經(jīng)血液循環(huán)浸潤(rùn)到腸道的黏膜層、黏膜下層,引起腸黏膜受損。在還原性輔酶Ⅱ、NADPH氧化酶以及呼吸作用下產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物如O2-、OH-等,這些物質(zhì)進(jìn)一步加重腸黏膜損傷[3-5]。keap-1-Nrf2路徑是機(jī)體最主要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路之一,在促進(jìn)黏膜修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,但健脾清熱活血方是否通過(guò)介導(dǎo)keap-1-Nrf2通路調(diào)控clau?din-2表達(dá)而發(fā)揮其防治UC的效應(yīng)尚不清楚。本研究應(yīng)用三硝基苯磺酸(TNBs)制備UC模型,將健脾清熱活血方作用于上述模型,應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、環(huán)氧氯丙烷結(jié)合蛋白1(ke?ap-1)、Nrf2以及claudin-2表達(dá)變化,客觀評(píng)價(jià)健脾清熱活血方的效用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量150~180 g,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(桂)2014-02。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成,許可證號(hào):SYXK(桂)2018-0012。動(dòng)物飼養(yǎng)在恒溫房間(21~23℃),每隔12 h光暗循環(huán),自由進(jìn)食進(jìn)水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物3R福利原則。

        1.2 試劑及儀器 5%2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司(貨號(hào):P2297),10%中性甲醛、戊二醛、無(wú)水乙醇購(gòu)于廣西博仁生物試劑有限公司;Anti-keap-1、Anti-Nrf2以及Anti-claudin-2均購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司(貨號(hào):ab119403,ab31163,ab53032),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德公司(貨號(hào):GA1014),EDTA緩沖液(博士德,SN109);伊紅(中杉,S133)、蘇木素(中杉,S130)、DAB顯色試劑盒(中杉,SB1030),免疫組化濕盒(抗體孵育用),BX43F電子顯微鏡(日本OLYMPUS)、透射電鏡(日本日立H7650)等。

        1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 健脾清熱活血方(馬齒莧15 g,白術(shù)10 g,白芍15 g,水蛭10 g,三七10 g,救必應(yīng)15 g,炙甘草6 g。用蒸餾水煎煮藥液,濃縮至含生藥1 g/1.5 mL,過(guò)濾分裝4℃保存?zhèn)溆茫?。美沙拉嗪(商品名艾迪莎)?00 mg/袋,法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥集團(tuán)生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H20040727。藥物均購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥房。

        1.4 分組與造模 將90只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組,即正常組、模型組、西藥組和中藥低、中、高劑量組,每組15只。參照文獻(xiàn)報(bào)道[6],正常組除外,其余各組均采用TNBS 100 mg/kg+50%乙醇法灌腸法制備UC模型,連續(xù)灌腸3 d,休息4 d。

        1.5 給藥方法 造模開(kāi)始第7日起,模型組予等劑量生理鹽水灌胃,中藥低、中、高劑量組予健脾清熱活血方4.29、8.58、17.16 g/kg灌胃(成人用藥量的3、6、12倍,即實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積比等效劑量換算,將每天劑量折算成大鼠等效劑量作為中劑量組),西藥組予美沙拉嗪灌胃(0.4 g/kg),正常組同步飼養(yǎng)。連續(xù)給藥14 d。

        1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)大鼠一般情況。觀察各組大鼠毛發(fā)、體質(zhì)量、耗食耗水、大便、死亡情況。2)結(jié)腸組織病理學(xué)變化。末次給藥后予10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死全部大鼠,截取距肛門(mén)8 cm處病變部位,沿縱軸切開(kāi),分別置于中性甲醛、戊二醛及液氮中備測(cè),肉眼下放大鏡觀察結(jié)腸潰瘍及其糜爛情況。3)HE染色檢測(cè)各組UC大鼠結(jié)腸組織病理改變。具體步驟嚴(yán)格按說(shuō)明操作,在光鏡下觀察標(biāo)本病理學(xué)改變并攝片。4)大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化。采用H-7650透射電鏡檢測(cè)各組UC大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡變化。5)結(jié)腸keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表達(dá)。采用免疫組化檢測(cè),具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作,由兩名病理專(zhuān)業(yè)人員采用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行圖像分析。以細(xì)胞呈棕褐色染色為陽(yáng)性結(jié)果,對(duì)照組采用PBS代替一抗。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析檢驗(yàn);若為非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)來(lái)比較兩組間差異。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組同步生長(zhǎng),造模期間各組均未見(jiàn)大鼠死亡,自造模第2日起可見(jiàn)大鼠肛門(mén)污穢、有血便殘留、食欲下降,皮毛稀疏無(wú)光澤,體質(zhì)量無(wú)明顯下降。肉眼下用放大鏡觀察見(jiàn)距肛門(mén)8~12 cm處病變最為明顯,部分糜爛表面附著少許黃白苔,予標(biāo)記后送檢病理。

        2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變 光鏡下見(jiàn)正常組結(jié)腸黏膜排列整齊,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組見(jiàn)結(jié)腸黏膜表面出現(xiàn)缺損或脫落壞死,潰瘍形成,隱窩結(jié)構(gòu)消失、膿腫形成,固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層充血腫脹;西藥組見(jiàn)結(jié)腸黏膜不同程度缺損,潰瘍形成,隱窩膿腫,黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);中藥各組見(jiàn)結(jié)腸黏膜尚完整,但存在黏膜缺損,隱窩膿腫,部分可見(jiàn)出血點(diǎn),較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)固有層。見(jiàn)圖1。

        圖1 各組UC大鼠黏膜組織病理學(xué)改變(HE染色,10倍)

        2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡情況電鏡下見(jiàn)正常組結(jié)腸上皮細(xì)胞單層柱狀排列,微絨毛發(fā)達(dá)密集,整齊排列,未見(jiàn)細(xì)胞壞死和凋亡;模型組結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛稀疏,線粒體腫脹變大,細(xì)胞間緊密連接消失,可見(jiàn)細(xì)胞處于壞死期;西藥組見(jiàn)上皮細(xì)胞單層柱狀排列,但排列欠整齊、線粒體腫脹、凋亡小體形成,局灶可見(jiàn)壞死;中藥各組見(jiàn)上皮細(xì)胞體積明顯變小、核固縮、凋亡小體形成,局灶可見(jiàn)壞死。見(jiàn)圖2。

        圖2 各組UC大鼠電鏡下結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡(8 000倍)

        2.4 各組大鼠結(jié)腸keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組結(jié)腸Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)下降,claudin-2蛋白表達(dá)上升。與模型組比較,各給藥組Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)上升,claudin-2蛋白表達(dá)下降,但西藥組與模型組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),中藥各劑量組與模型組、西藥組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),中藥低、中、高劑量組之間不存在組間差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3~圖5,表1。

        表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表達(dá)比較(IOD,±s)

        表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表達(dá)比較(IOD,±s)

        注:與模型組比較,*P<0.05;與西藥組比較,△P<0.05。

        組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 6 6 6 keap-1 6 543.92±834.83*3 352.83±833.96 3 907.27±718.01 5 412.21±622.25*△5 793.00±693.49*△5 864.43±793.03*△Nrf2 8 163.03±318.04*4 517.53±909.53 4 568.19±712.11 5 123.03±678.04*△6 578.62±634.39*△6 907.57±718.51*△claudin-2 3 352.83±633.96*8 533.08±659.29 8 413.49±617.34 6 426.86±818.79*△6 336.08±698.27*△6 123.49±578.24*△

        圖3 各組UC大鼠結(jié)腸keap-1蛋白表達(dá)(10倍)

        圖4 各組UC大鼠結(jié)腸Nrf2蛋白表達(dá)(10倍)

        圖5 各組UC大鼠結(jié)腸claudin-2蛋白表達(dá)(10倍)

        3 討論

        本課題組在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,傳承全國(guó)名老中醫(yī)胡珂、謝建群、馬貴同等教授臨證經(jīng)驗(yàn),指出潰結(jié)當(dāng)以“脾虛為本,濕熱瘀毒為標(biāo)”為基本特點(diǎn)。脾虛無(wú)以運(yùn)化水液,聚濕成痰,痰隨氣而升無(wú)處不致,日久阻塞經(jīng)絡(luò),化為瘀血,痰瘀互結(jié),損傷腸絡(luò);而潰結(jié)之所以反復(fù)發(fā)作,其關(guān)鍵在于“濕”“熱”“瘀”之邪留于體內(nèi),沒(méi)有得到徹底根除,每遇外感或內(nèi)傷的誘因而復(fù)發(fā),如“邪氣或動(dòng)或靜,其痢乍發(fā)乍止”,由此提出“健脾清熱活血”的基本大法。

        基于“提高UC黏膜愈合質(zhì)量是減少UC復(fù)發(fā)關(guān)鍵所在”的理念[6-7],本研究從氧化應(yīng)激介導(dǎo)炎癥持續(xù)角度出發(fā),探討健脾清熱活血方介導(dǎo)keap-1-Nrf2通路調(diào)控claudin-2表達(dá)干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究。健脾清熱活血方主要由救必應(yīng)、馬齒莧、白術(shù)、白芍、水蛭、三七、炙甘草等藥物組成,以救必應(yīng)瀉火解毒、清熱利濕、行氣止痛、涼血止血,歸于大腸經(jīng),直抵病所為君藥,馬齒莧、水蛭、三七活血化瘀、祛腐生新為臣,佐以白術(shù)健脾益胃、燥濕和中,芍藥甘草緩急止痛,全方共奏清熱活血、健脾和胃之功效。筆者通過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)與模型組比較,治療組所見(jiàn)黏膜損傷程度較模型組有不同程度改善,部分可見(jiàn)出血點(diǎn),較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)固有層。表明健脾清熱活血方藥具有減少組織損傷、促進(jìn)修復(fù)黏膜、緩解潰結(jié)炎癥,防治潰瘍性結(jié)腸炎的效用。

        反復(fù)炎癥刺激形成氧化應(yīng)激產(chǎn)生的線粒體內(nèi)的活性氧(ROS)爆發(fā)直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能,是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)[8]。keap-1-Nrf2-ARE路徑是機(jī)體最主要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路之一,參與機(jī)體炎癌轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及黏膜修復(fù)等多方面[9]。Nrf2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,廣泛存在于機(jī)體多個(gè)組織器官中,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷結(jié)合蛋白1(keap 1)是Nrf2的重要受體,生理狀態(tài)下,Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中,與keap 1結(jié)合,處于被抑制狀態(tài),當(dāng)受到氧化應(yīng)激信號(hào)刺激后,Nrf2迅速與變構(gòu)的keap 1解耦連,以穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核,與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚物,并與一順式作用元件即抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,結(jié)合ARE上的GCTGAGTCA位點(diǎn),參與下游一系列Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控。ARE是一個(gè)特異的DNA啟動(dòng)子結(jié)合序列,位于所調(diào)控的抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的5′端啟動(dòng)序列[10-11]。Claudin蛋白家族作為反映腸黏膜屏障最重要的生物標(biāo)記物,在維護(hù)腸黏膜屏障完整中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[12]。claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的主要骨架,不同的claudin分子對(duì)緊密連接的通透性有不同的影響。一部分claudin分子可以形成特異性離子通道而增加上皮、內(nèi)皮通透性,稱(chēng)為“l(fā)eaking”claudin,包括claudin-2、claudin-10等[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組 keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)明顯下降,claudin-2蛋白表達(dá)上升,說(shuō)明UC炎癥持續(xù)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化應(yīng)激水平下降,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)、超載,導(dǎo)致細(xì)胞壞死、損傷,加重炎癥的進(jìn)程,甚至異型增生。同時(shí)也反映腸上皮通透性增加,由此可能造成大量的抗原通過(guò)受損腸黏膜屏障滲入腸道內(nèi),與食物抗原交互反應(yīng)而導(dǎo)致炎癥持續(xù),導(dǎo)致靶器官受損。治療后,治療組keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)上升,claudin-2蛋白表達(dá)下降,說(shuō)明健脾清熱活血方可能通過(guò)促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性的反應(yīng)性氧化應(yīng)激的清除而達(dá)到緩解炎癥的效用。

        總的來(lái)說(shuō),本次研究初步證實(shí)健脾清熱活血方通過(guò)上調(diào)keap-1、Nrf2表達(dá),下調(diào)claudin-2表達(dá),修復(fù)黏膜屏障減少抗原刺激而發(fā)揮防治UC的效用。

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