董鴻斐，王 冰，黃 茜，原小惠，孫紅玉，湯禮軍

自1980年發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞的可塑性后，大量研究表明干細(xì)胞在促進(jìn)組織、器官愈合與再生中發(fā)揮重要作用[1-2]。為此，人們追求研究各類干細(xì)胞，主要包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神 經(jīng) 干 細(xì) 胞(neural stem cells，NSCs)和多能 干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）[3]。目前，基于干細(xì)胞的療法已在骨骼重塑、心肌損傷、帕金森病、糖尿病和眼底病變等多個疾病中研究報(bào)道，并普遍被認(rèn)為是安全、有效的[4-6]。盡管干細(xì)胞在組織修復(fù)、功能重建和器官再造等方面極具潛力，但干細(xì)胞治療還存在若干不足。通過將細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）制備成細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（extracellular matrix hydrogel，ECMH），為克服干細(xì)胞移植治療中的不足帶來了希望。在此，筆者主要探討ECMH在干細(xì)胞移植治療中的優(yōu)勢和不足。

1 ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療的原因

近年來，隨著對干細(xì)胞移植治療的研究不斷加深，也暴露出干細(xì)胞移植治療中存在的若干問題。首先，在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中，干細(xì)胞多在無任何載體的情況下通過注射器或者導(dǎo)管被注射到組織中，導(dǎo)致干細(xì)胞在注射過程中泄露及損傷的發(fā)生率較高；其次，不論干細(xì)胞移植方案如何變化，通常移植后只有少于5%的干細(xì)胞在注射部位持續(xù)存在并發(fā)揮治療作用[7]；最后，干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)處于不同的細(xì)胞微環(huán)境中，適宜的干細(xì)胞微環(huán)境有助于保持干細(xì)胞的數(shù)量并具有調(diào)控干細(xì)胞的分化成熟的作用[8-9]，但是干細(xì)胞移植部位的微環(huán)境卻常因炎癥、創(chuàng)傷和氧化應(yīng)激等因素影響變得惡劣，不利于干細(xì)胞存活及增殖分化，降低干細(xì)胞的治療效果。為改善干細(xì)胞移植過程中存在的問題，研究人員在組織工程上進(jìn)行了多方面嘗試，發(fā)現(xiàn)水凝膠可以有效改善干細(xì)胞治療中的不足。水凝膠是含水量高的高分子多聚鏈化合物材料，多聚鏈通過物理和化學(xué)的交聯(lián)作用保持結(jié)構(gòu)的完整性，從天然材料（如纖維蛋白、海藻酸鈉等）到合成材料（如聚乙二醇或聚丙烯酸等）均可制備成水凝膠[10]。在聯(lián)合干細(xì)胞治療中，水凝膠通過其可構(gòu)建類似細(xì)胞外基質(zhì)的特性，為干細(xì)胞提供適宜的微環(huán)境，從而提高干細(xì)胞移植治療效果。Moxon等[11]在生理?xiàng)l件下通過物理混合受控凝膠化將膠原蛋白原纖維摻入藻酸鹽水凝膠中，再將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cells,iPSC）衍生神經(jīng)元封裝在混合水凝膠內(nèi)，發(fā)現(xiàn)水凝膠中包封的神經(jīng)元形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并成熟為可表達(dá)突觸素的分支神經(jīng)元。還有大量研究都證明通過構(gòu)建類似細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境可以有效提高干細(xì)胞的增殖及分化[12-13]。但在人體內(nèi)，不同組織的細(xì)胞外微環(huán)境各有差異，傳統(tǒng)的水凝膠制備由于其結(jié)構(gòu)單一及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的阻斷，嚴(yán)重的限制了水凝膠與干細(xì)胞復(fù)合體在臨床中的應(yīng)用。將為不同組織提供微環(huán)境的ECM制備成ECMH，可解決的傳統(tǒng)水凝膠的缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)的水凝膠相比，由于ECMH保留了原有組織內(nèi)的膠原蛋白、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖和彈性蛋白等，因此具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)；（2）支持并連接組織結(jié)構(gòu)；（3）調(diào)節(jié)組織與細(xì)胞的相互作用。因此，ECMH有望取代傳統(tǒng)水凝膠，并廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療。

2 ECMH在干細(xì)胞移植中的優(yōu)勢

2.1 為干細(xì)胞提供適宜的細(xì)胞微環(huán)境 干細(xì)胞微環(huán)境是動態(tài)而復(fù)雜的，可以通過不同的時間節(jié)點(diǎn)和空間結(jié)構(gòu)來共同影響干細(xì)胞的表型及特征。而為干細(xì)胞提供微環(huán)境的基礎(chǔ)便是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。ECM的生化成分、力學(xué)特征及微管結(jié)構(gòu)，都具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為的能力，通過對ECM成分的調(diào)節(jié)，可使干細(xì)胞達(dá)到預(yù)期的表型?；贓CM制備的ECMH可更好的模擬干細(xì)胞微環(huán)境，從而達(dá)到提高干細(xì)胞治療效果的目的。Bordbar等[14]將羊膝關(guān)節(jié)軟骨ECMH與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培育，結(jié)果表明所制備的水凝膠具有良好的細(xì)胞友好性，可以保持干細(xì)胞存活。Wu等[15]將豬半月板通過改良的脫細(xì)胞作用和酶消化作用，制備成豬半月板組織來源的ECMH，再來培養(yǎng)牛軟骨細(xì)胞和小鼠3T3成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與聚苯乙烯培養(yǎng)比較，豬半月板ECMH能顯著提高牛軟骨細(xì)胞和小鼠3T3成纖維細(xì)胞的生存率和增殖速度。這些結(jié)果表明由于ECMH因其具有獨(dú)特的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物活性，可為干細(xì)胞提供更加適宜的細(xì)胞微環(huán)境。

2.2 對干細(xì)胞無細(xì)胞毒性 要將ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植并發(fā)揮良好的治療效果，首先需要確保干細(xì)胞可在ECMH中良好生存。因此，ECMH是否具有細(xì)胞毒性決定著移植干細(xì)胞的命運(yùn)。Getova等[16]將脂肪組織的ECM制備成水凝膠后，用于培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，來評估該ECMH的細(xì)胞毒性，連續(xù)培養(yǎng)7 d后結(jié)果顯示水凝膠內(nèi)細(xì)胞存活良好，并在ECMH中觀察到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和遷移。梁成宵等[17]用Live/Dead染色試劑盒檢測大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A細(xì)胞在肝臟ECMH中的存活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRL-3A細(xì)胞在肝臟ECMH中培養(yǎng)1 d和3 d后BRL-3A細(xì)胞黏附數(shù)量明顯多于對照組，表明肝臟ECMH并無細(xì)胞毒性。以上結(jié)果均證明ECMH無細(xì)胞毒性，可以保證干細(xì)胞良好存活和遷移，有助于提高干細(xì)胞治療效果。

2.3 協(xié)同干細(xì)胞移植后有較低免疫原性 ECMH作為干細(xì)胞組織工程支架材料并應(yīng)用于臨床疾病治療，除了需要考慮ECMH的細(xì)胞毒性，還需考慮其是否會引起移植后免疫排斥反應(yīng)。Qiao等[18]將豬心肌組織來源的ECMH聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，局部注射至急性心肌梗死后梗死邊界處的心肌中，連續(xù)觀察4 w后，發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌ECMH的組合可明顯增加血管生成，減少纖維化程度并減小梗塞面積，且未觀察到組織免疫反應(yīng)。Zhang等[19]為了評估衍生自豬膀胱組織的膀胱ECMH在大鼠腦組織中的生物相容性及免疫原性，將膀胱ECMH直接注射到正常大腦后，發(fā)現(xiàn)多種大腦組織損傷評估指標(biāo)無明顯變化，提示膀胱ECMH未引起大鼠腦組織免疫反應(yīng)。因此，ECMH具有良好的生物相容性及低免疫原性的特點(diǎn)，這也有助于協(xié)助干細(xì)胞體內(nèi)移植后發(fā)揮治療作用。

2.4 有助于干細(xì)胞存活 基于干細(xì)胞的療法可用于治療多種疾病和損傷，目前主要應(yīng)用于臨床治療的多為間充質(zhì)干細(xì)胞，其治療作用通常歸因于間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)或促進(jìn)組織修復(fù)的作用[23]，因此保持干細(xì)胞的存活及增殖對干細(xì)胞治療效果有決定性作用。Jang等[21]分別使用豬心臟ECMH和膠原兩種不同的材料與人源心臟祖細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)心臟ECMH更能增強(qiáng)人源心臟祖細(xì)胞的存活、增殖和分化。Lin等[22]通過將豬外周神經(jīng)脫細(xì)胞化后制備成ECMH用來培養(yǎng)施旺細(xì)胞(Schwann's cell)，發(fā)現(xiàn)豬外周神經(jīng)ECMH中的細(xì)胞外基質(zhì)成分和其納米纖維結(jié)構(gòu)特征有助于促進(jìn)施旺細(xì)胞存活和增殖。Ozpinar等[23]通過使用豬直皮ECMH與I型膠原水凝膠分別培養(yǎng)人源性肥大細(xì)胞來觀察豬直皮ECMH對肥大細(xì)胞代謝活性、細(xì)胞活力和受體表達(dá)的影響，結(jié)果在豬直皮ECMH中培養(yǎng)時，人源肥大細(xì)胞表現(xiàn)出不同的代謝活性，同時與肥大細(xì)胞成熟/激活相關(guān)的免疫球蛋白E（IgE）受體也被上調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相較于傳統(tǒng)水凝膠，ECMH可明顯提高干細(xì)胞生存率并有助于干細(xì)胞增殖，是一種良好的干細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.5 具有誘導(dǎo)干細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的作用 干細(xì)胞移植治療的成功還取決于干細(xì)胞在移植后是否能夠保持其增殖、分化和表型的能力。Bordbar等[14]將羊膝關(guān)節(jié)軟骨ECMH與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同構(gòu)建干細(xì)胞復(fù)合體，觀察到嵌入在水凝膠內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成軟骨細(xì)胞。Zhang等[24]將制備的人胎盤ECMH與高傳代（P8）直皮乳頭細(xì)胞（dermal papilla cells，DPCs）混合成球體后，發(fā)現(xiàn)P8-DPCs在傳代表達(dá)缺失的與毛誘導(dǎo)能力相關(guān)的基因表達(dá)得到了恢復(fù)，進(jìn)一步將水凝膠-干細(xì)胞復(fù)合體移植于裸鼠皮下，兩周后觀察到毛發(fā)再生，而單純細(xì)胞移植組無毛發(fā)再生現(xiàn)象，證明人胎盤ECMH可通過活化表達(dá)關(guān)鍵基因來調(diào)節(jié)DPCs的形態(tài)和功能，使原本不能表達(dá)的與毛誘導(dǎo)能力相關(guān)的基因表達(dá)得到了恢復(fù)。以上研究表明，ECMH具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)干細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的能力。

3 ECMH在干細(xì)胞移植治療中面對的問題

目前，ECMH由于其類似組織的物理特性、獨(dú)特的3D環(huán)境結(jié)構(gòu)特性及出色的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，已被認(rèn)為是干細(xì)胞培養(yǎng)的黃金標(biāo)準(zhǔn)[25]。隨著ECMH在干細(xì)胞培養(yǎng)和移植方面應(yīng)用普及，其優(yōu)勢逐漸得以體現(xiàn)，但將人體組織來源的ECMH應(yīng)用于臨床治療，尚處于生物材料學(xué)領(lǐng)域的起步階段。此外，ECMH的臨床應(yīng)用還需面對以下問題：（1）由于ECMH制備的原材料為動物組織和器官，在臨床應(yīng)用中應(yīng)盡可能降低組織來源差異引起的免疫反應(yīng)，所以理想的材料為人體組織，這使得ECMH的原材料供應(yīng)成為一個首要障礙；（2）從人體組織中獲取ECM必須面對個體間變異所產(chǎn)生的組織差異性，差異性的來源包括年齡、性別、種族等多個方面，這些差異極大的降低了ECMH的生產(chǎn)重復(fù)性，這種生產(chǎn)批次間的變異影響了其臨床應(yīng)用；（3）由于ECM結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)的多元化并不利于找們理解細(xì)胞外信號及ECM組分在細(xì)胞器形成中的作用，這些問題導(dǎo)致在干細(xì)胞治療中，很難根據(jù)干細(xì)胞種類及應(yīng)用部位選擇最適合的ECMH。

4 ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植的展望

將ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞的體內(nèi)移植，在臨床中的可行性仍未明確，但已有大量的文獻(xiàn)綜述表明ECMH在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用潛力。隨著合成和加工技術(shù)的發(fā)展，ECMH的設(shè)計(jì)將不斷更新。動態(tài)ECMH的發(fā)展不僅可以為干細(xì)胞提供良好的微環(huán)境，還將為干細(xì)胞提供更加多元的外部觸發(fā)因素（例如光、聲音）[26]。這些動態(tài)特性可以更加深層次的影響干細(xì)胞的生物信號傳導(dǎo)和力學(xué)結(jié)構(gòu)形態(tài)，為干細(xì)胞治療提供更好的助力。