閆可心，閆宗斌，韓金成，張雪梅，薛書江，許應(yīng)天

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

細(xì)胞膜主要是由磷脂構(gòu)成的半透性膜，具有選擇透過性，分子質(zhì)量不超過600 Da的物質(zhì)才能透過細(xì)胞膜進入到細(xì)胞中，蛋白質(zhì)、多肽和核酸等大分子物質(zhì)不易進入細(xì)胞中且難以達(dá)到足夠的濃度，故而為了實現(xiàn)跨膜的目的，需要運輸載體的輔助。雖然顯微注射、電穿孔及重組質(zhì)粒等穿膜技術(shù)早已被普遍應(yīng)用，但仍存在許多不足，比如轉(zhuǎn)運效率不高、細(xì)胞毒性大[1]。近30年來，細(xì)胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPPs）的發(fā)現(xiàn)為該領(lǐng)域提供了優(yōu)良的輸送載體，細(xì)胞穿膜肽也稱為轉(zhuǎn)運蛋白（membrane transduction peptides,MTPs）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transductions,PTDs）等[1]，是一類富含堿性氨基酸，通常帶有正電荷，pH近似中性，為包含5～30個氨基酸的小分子多肽。實驗表明它能將多種物質(zhì)如親水性蛋白質(zhì)、多肽、基因片段（RNA、DNA和反義寡聚核苷酸）和小分子藥物等通過體內(nèi)及體外的方式，在保證活性分子依然發(fā)揮作用的情況下導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，而且不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，某些CPPs甚至能夠攜帶分子穿過血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障等重要的屏障系統(tǒng)發(fā)揮作用[2]。本文就其分類、在各領(lǐng)域中國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 CPPs的分類

CPPs的種類繁多，根據(jù)序列、功能、入胞機制和來源等特點，可以對其進行不同分類，依據(jù)CPPs的來源和理化性質(zhì)進行分類比較普遍。

1.1 根據(jù)CPPs的來源

1.1.1 蛋白衍生物源自天然蛋白質(zhì)多肽區(qū)域的蛋白衍生物，主要是轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)[3]，沒有細(xì)胞特異性，在不同溫度（4～37℃）條件下有同樣的運輸效率。早在1988年，Green和Frankel已證實人免疫缺損病毒（HIV-1）的轉(zhuǎn)錄活化因子（TAT）能夠穿膜進入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)[4]，HIV TAT蛋白具有細(xì)胞穿透功能的發(fā)現(xiàn)開啟了細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的新紀(jì)元，這一發(fā)現(xiàn)對于克服細(xì)胞輸送肽和蛋白質(zhì)的挑戰(zhàn)尤其重要[5]。TAT肽是TAT蛋白的短陽離子片段，迅速成為一種流行的研究工具，用于增強生物分子向細(xì)胞內(nèi)的運輸。蛋白衍生物含有大量的精氨酸和賴氨酸殘基，且都帶正電荷。

1.1.2 人工合成CPPs利用大部分CPPs帶正電荷及賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸殘基含量豐富的特點[6]，人工合成的多聚賴氨酸和多聚精氨酸同樣具有穿膜入胞的能力[7]。目前許多具有穿透細(xì)胞能力的不同特性的人工新型CPPs在不斷被開發(fā)。

1.1.3 嵌合肽嵌合肽由CPPs與藥物通過共價連接的方式形成，為增強其靶向性，將CPPs和癌細(xì)胞核定位信號及細(xì)胞表層的多肽配體相結(jié)合，形成的嵌合肽可有較多功能。目前，應(yīng)用頻繁的多肽配體主要有RGD、YIGSR及NGR，由于其與癌細(xì)胞通過非特異性的方式識別而被廣泛應(yīng)用[8]。

1.2 根據(jù)CPPs的理化性質(zhì)

1.2.1 陽離子型一般帶有正電荷，含有堿性氨基酸，且其三維結(jié)構(gòu)不呈現(xiàn)兩親性螺旋排布的CPPs歸類為陽離子型CPPs。最具代表性的是TAT。在2000年，Mitchell研究了精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和組氨酸這幾種堿性氨基酸的低聚物的穿膜能力，總結(jié)出精氨酸的低聚物較其他同鏈長的堿性氨基酸的低聚物有更高的穿膜效率[9]。有一些被稱為核定位序列的陽離子型CPPs甚至更為特殊，它們可以通過核膜進入細(xì)胞核，但穿膜能力較弱[10]，將其與一段疏水的多肽共價連接，則可以獲得穿膜效率較高的兩親性CPPs。

1.2.2 兩親性型兩親性型的CPPs一般具有極性基團和非極性基團，因此共同具備親水性和疏水性。大多數(shù)的兩親性型CPPs含有偏多的正電荷，而其與陽離子型CPPs的主要不同在于入胞機制是由于兩親性而非正電基團[11]。

1.2.3 疏水型疏水型CPPs一般只含有非極性基團，具有較低的凈電荷數(shù)。相比于前面提到的兩種類型的CPPs，疏水型CPPs的報道相對較少，且其入胞機制尚不明確。

2 CPPs在各領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，CPPs的研究和應(yīng)用是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點研究方向，尤其是CPPs在腫瘤治療、新藥開發(fā)、基因治療和動物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用較廣泛。

2.1 腫瘤治療領(lǐng)域

腫瘤特異性CPPs可以運載治療藥物靶向入胞，提高藥物的滲透性，遞送藥物的過程可以得到有效地改善，且對正常組織無損傷[6]。兩親性型的p28是天青蛋白的28個氨基酸片段，作為晚期實體瘤患者p53（腫瘤抑制蛋白）泛素化的非HDM2介導(dǎo)的肽抑制劑，被用于對標(biāo)準(zhǔn)治療有抗性的p53陽性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者，對難治性腫瘤有效，且患者耐受性良好[12]。多數(shù)的臨床研究表明，CPPs與藥物偶聯(lián)后，具備了在腫瘤、神經(jīng)性疾病等疾病治療中的作用，TAT連接的p53蛋白以及R11連接的p53蛋白和血球凝集素HA-2，在小鼠模型經(jīng)過腹腔注射淋巴瘤后，可促進腫瘤細(xì)胞凋亡且能延長小鼠的壽命[13]。作為一種腫瘤抑制機制，支架附著因子A（SAFA）衍生肽在調(diào)節(jié)多種SAFA分子功能、腫瘤細(xì)胞治療等方面具有潛在應(yīng)用價值[14]。此外，B-mR9對腫瘤具有特異性靶向作用，其EPR效應(yīng)可持續(xù)48 h，B-mR9/siVEGF對NCI-H460的BALB/c鼠腫瘤生長的抑制率為56.5%，治療效果優(yōu)于PEI25k和R9載體[15]。李莉等[16]合成新型穿膜肽類似物[Cys-CPT2，9]penetratin，并證明[Cys-CPT2，9]penetratin是一個新的高膜轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的CPPs，且對HeLa細(xì)胞具有抗腫瘤活性。但是，當(dāng)CPPs作用于體內(nèi)時，仍存在血漿半衰期短、生物利用度低等問題，且其內(nèi)化機制還不清楚，安全性也不能保證[17,18]。

2.2 藥物遞送領(lǐng)域

30年來，將藥物活性分子運送到細(xì)胞內(nèi)而對細(xì)胞正常生理功能不產(chǎn)生影響是一直以來人們的愿望，因此開始大量關(guān)注CPPs。CPPs在某些方向和領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)得到高度的肯定，研究成果也在逐步向臨床應(yīng)用方面轉(zhuǎn)變[2]。自TAT被發(fā)現(xiàn)以來，CPPs作為載體運輸生物大分子進入細(xì)胞的能力在體外實驗中一直在被研發(fā)，TAT連接的-半乳糖苷酶能夠向小鼠所有組織完成遞送[19]。CPPs作為藥物遞送載體使藥物進入細(xì)胞，甚至能穿透上皮細(xì)胞和血腦屏障，這一點已經(jīng)被應(yīng)用在許多疾病的治療和新藥的開發(fā)中。研究表明，將抗瘧氨基喹啉與CPPs偶聯(lián)可提供溶血偶聯(lián)物，作為不同類型的小藥物到生物大分子的載體具有較多優(yōu)勢，但由于溶血問題，CPPs似乎不適合抗瘧藥氨基喹啉的安全細(xì)胞內(nèi)遞送[20]。章衛(wèi)華等[21]通過定量細(xì)胞攝取實驗考察肺癌A549細(xì)胞對RGDD/TAT-LP的攝取效率，最后整合素受體RGD與TAT共修飾載紫杉醇（PTX）脂質(zhì)體可以認(rèn)定高表達(dá)整合素受體的腫瘤細(xì)胞，穿透腫瘤細(xì)胞膜進入腫瘤細(xì)胞，是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。然而，CPPs對細(xì)胞的選擇性不強，只借助其本身不能使藥物形成定向蓄積，作用在靶細(xì)胞或者靶組織的藥物濃度也達(dá)不到預(yù)期的效果，關(guān)于靶向載藥CPPs的研究目前主要集中在腫瘤方面，其中基本的研究思路是利用不同“刺激-響應(yīng)”策略來控制載藥CPPs進入腫瘤細(xì)胞[22]。

2.3 基因治療領(lǐng)域

在基因治療時將外源基因?qū)氚屑?xì)胞中是必不可少的過程[23]。目前，基因治療臨床受限于安全高效的基因載體，載體一般有病毒載體和非病毒載體兩類，相比與病毒載體，非病毒載體更有優(yōu)勢[24]。聚精氨酸通常用于功能化納米載體以進行基因治療和藥物遞送，目的是增強治療性物質(zhì)的細(xì)胞滲透性。這些活性的相對權(quán)重由構(gòu)建體的靜電荷和納米級材料的低聚狀態(tài)決定，兩者均可通過常規(guī)蛋白質(zhì)工程方法調(diào)節(jié)純化[25]。Sina Alizadeh等[26]采用HR9、Cady-2與CPPs復(fù)合形成穩(wěn)定的納米顆粒，并以非共價方式增強它們向HEK-293T細(xì)胞的遞送，實驗證明天然佐劑（Hsp27）和CPPs（HR9和Cady-2）的組合可以顯著刺激有效的免疫反應(yīng)，這對開發(fā)細(xì)胞的丙型肝炎病毒（HCV）治療疫苗是比較有前途的方法。CD2v蛋白是非洲豬瘟病毒（ASFV）EP402R基因編碼的跨膜蛋白，該蛋白含有重復(fù)的氨基酸序列（RAAS），研究表明帶有RAAS截短的CD2v蛋白可以進入中國倉鼠卵巢細(xì)胞，還可以攜帶大分子蛋白EGFP通過依賴于時間、濃度和位置的多個內(nèi)吞過程進入不同的細(xì)胞，RAAS為ASFV的研究提供了一個新的視角[27]。人工合成的新型穿膜肽也逐漸嶄露頭角，Simeon等[28]驗證了一種基于HCV基因抑制元件篩選過程中發(fā)現(xiàn)的新型CPPs—B1，它不僅有效地介導(dǎo)細(xì)胞對大分子的攝取，還能將“貨物”運送到與生物相關(guān)的細(xì)胞環(huán)境。馬意龍[29]設(shè)計并合成了一系列基于氨氧賴氨酸的新型CPPs，研究了它的生物學(xué)性質(zhì)，其結(jié)果說明一種基于氨氧賴氨酸的混合型CPPs，具有生物穩(wěn)定性高和細(xì)胞毒性低的特點，并且可以在細(xì)胞漿中均勻分布。

2.4 動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

將外源DNA導(dǎo)入動物體內(nèi)有多種方法，包括原核顯微注射、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒陽離子分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等，但這些技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率較低。近年來，由于CPPs毒性低，且它能夠相對有效地將外源DNA運送到多種哺乳動物體細(xì)胞中，使得CPPs已成為一種有用的基因轉(zhuǎn)染工具[30]。此外，CPPs也被用于將“貨物”運送到微生物細(xì)胞，如多種念珠菌、真菌病原體等[31]。許多CPPs已經(jīng)成功地將肽、寡核苷酸、蛋白質(zhì)和載藥納米顆粒等分子運送至哺乳動物細(xì)胞群體[32]。HIV-1 Nef和Hsp20-Nef蛋白是在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的，Rostami Bahareh等[33]使用新型CPPs-M918以非共價方式遞送到HEK-293T哺乳動物細(xì)胞系中，實驗表明，聯(lián)合M918的蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)染比僅用Nef或Hsp20-Nef蛋白的效率高，M918可以增加Nef和Hsp20-Nef蛋白對細(xì)胞的滲透。紅色熒光蛋白與dsRED-9K融合在一起作為CPPs，提高了蛋白的傳遞，純化的dsRED-9K能夠有效穿透源自小鼠胚胎干細(xì)胞的所有細(xì)胞譜系[34]。通過共聚焦成像、流式細(xì)胞術(shù)和MTT法檢測雞貧血病毒（CAV）VP1蛋白（CVP1）的有效細(xì)胞穿透活性，研究發(fā)現(xiàn)CVP1肽可以有效地將蛋白質(zhì)和核酸輸送到細(xì)胞內(nèi)[35]。CPPs與蛋白的聯(lián)合作用提高了蛋白的跨膜效率。徐詠婷等[36]比較了兩種常用穿膜肽TAT和R9的體外穿膜效率、對細(xì)胞影響以及小鼠活體內(nèi)不同器官的穿膜效率，結(jié)果表明制備的兩種融合蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP均能實現(xiàn)有效穿膜，兩種CPPs對細(xì)胞影響較小，且活體實驗證明兩種CPPs都能透過血腦屏障到達(dá)腦部。伏彭輝等[4]成功表達(dá)了融合蛋白EGFP（47.3 ku）和NLSEGFP-TAT（50.1 ku），純化蛋白與水牛成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)5～8 h后，EGFP蛋白不能進入細(xì)胞內(nèi)，而NLSEGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的幫助下能夠順利進入細(xì)胞內(nèi)，但未能顯著定位到細(xì)胞核內(nèi)。王立珍[37]報道TAT-Nb6融合蛋白被成功表達(dá)，該融合蛋白能夠進入豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染的細(xì)胞內(nèi)，從而在細(xì)胞中起到抗病毒的作用，為抗PRRSV新型藥物的研發(fā)開辟了新途徑。

3 展望

總之，近年來大多數(shù)的CPPs被用于腫瘤治療及藥物遞送，CPPs作為運輸載體具有重要的意義。雖然關(guān)于CPPs的內(nèi)化能力存在一些限制和不足，但它在許多疾病應(yīng)用領(lǐng)域的價值已經(jīng)得到關(guān)注和發(fā)掘，在臨床實驗中已經(jīng)展現(xiàn)了良好的潛質(zhì)，尤其在穿透血腦屏障以及上皮組織的轉(zhuǎn)運治療當(dāng)中取得了巨大進展?？梢奀PPs在腫瘤治療、醫(yī)藥學(xué)及基因治療等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。