袁保明，翟新國，劉德強，李曉霄，金艷壽

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056000；2.云南曲靖陸良縣板橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南曲靖 655602；3.易門縣六街辦事處農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南玉溪 651107）

沙門菌在嚴重危害著公共衛(wèi)生安全的同時， 也給畜牧業(yè)和肉制品加工業(yè)造成了極其嚴重的經(jīng)濟損失[1]。 據(jù)報道，被感染的豬是屠宰場和加工環(huán)節(jié)最主要的污染源[2]。 某縣生豬屠宰場的屠宰環(huán)節(jié)表面進行樣品的采集， 按照GB4789，4-2010[3]中分離程序?qū)Σ杉瘶悠愤M行沙門菌分離及耐藥性實驗。 此次將重點探究沙門菌在屠宰場每個環(huán)節(jié)中沙門菌的分離， 通過污染現(xiàn)狀及耐藥性實驗研究為防控措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采樣時間自2019 年9 月至2021 年10 月，采集9 次樣品，采樣時間間隔約為1 月/次，樣品來源于云南省紅河州某縣生豬屠宰場進行采集，此屠宰場每天屠宰數(shù)在100～200 頭，為某縣供應(yīng)80%以上豬肉食品。 采集樣品共計1530 份（見表1）。 實驗器具都經(jīng)過滅菌或消毒，采取無菌操作，采樣過程中為防止被污染，每次采樣結(jié)束后盡快將樣品送往實驗室進行處理。

表1 某縣生豬屠宰場采樣數(shù)量 （單位：份）

1.2 主要實驗試劑及材料

麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂，均購于北京某技術(shù)有限責任公司。 緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS 瓊脂均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司， 沙門菌顯色培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

按照中華人民共和國國家標準GB4789.4-2010 進行分離鑒定[4]，具體操作如下：

1.4 細菌分離培養(yǎng)

在超凈工作臺中， 樣品使用生理鹽水，按0.0001、0.001、0.01、0.1 和1 五個等比例梯度進行稀釋。 將稀釋的樣品，均勻涂布在BS、SS 瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃孵化箱內(nèi)培養(yǎng)24 小時，得到單個細菌菌落。 37℃培養(yǎng)24 小時進行細菌分離培養(yǎng)。

1.5 沙門菌分離結(jié)果

從1530 份屠宰場樣品中分離出沙門菌共計272 株，總分離率為17.8%。 每次樣品中沙門菌的分離率都維持在比較穩(wěn)定水平； 不同批次不同屠宰場樣品中沙門菌分離率略有波動。 4、5、6 樣 品 沙門菌污染率相比高，不同的屠宰場分離數(shù)量（見表2）。

表2 某縣生豬屠宰場分離數(shù)量

1.6 沙門氏菌革蘭氏染色篩選

菌落經(jīng)過分離純化后，挑選形態(tài)典型的單個菌落，根據(jù)革蘭氏染色后的單個細菌菌體的形態(tài)，來篩選沙門氏菌。油鏡下觀察，革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)紫色，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色，這樣篩選出陰性菌，大致作出篩選。

1.7 生理生化鑒定

將分離得到的272 株疑似菌株的革蘭氏染色陰性細菌進行生化鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有272株細菌的生化鑒定結(jié)果符合沙門菌生化鑒定標準，均能分解葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸；根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》來確定所屬的種。

1.8 沙門菌的PCR 鑒定

利用PCR 方法對沙門菌種屬特異性基因invA 進行檢測，測系引物（見表3）。

表3 測系引物

反應(yīng)條件：94℃預變性5 分鐘；94℃變性1分鐘；55℃退火1 分鐘；72℃延伸1 分鐘； 共25個循環(huán)，最后72℃再延伸10 分鐘；4℃保存。 經(jīng)PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用PCR 檢測疑似菌株攜帶invA 的情況，均能檢出invA 基因，通過PCR 擴增沙門氏菌特異性基因invA，得到特異性片段，與預期結(jié)果相符。

2 沙門菌分離鑒定結(jié)果分析

云南省紅河州某縣生豬屠宰場， 在各個屠宰環(huán)節(jié)中嚴格按照屠宰程序， 某縣生豬屠宰場的衛(wèi)生條件較好。9 次屠宰場樣品中的沙門菌分離率無較大的波動， 但是沙門菌的分離率在屠宰場環(huán)節(jié)中波動較大， 其中設(shè)施設(shè)備及其屠宰刀具是屠宰場中重要的工具， 是容易引起細菌交叉污染， 調(diào)查結(jié)果顯示屠宰刀具環(huán)節(jié)中存在交叉污染， 以此建議屠宰場應(yīng)該給屠宰環(huán)節(jié)配備2～3 套屠宰工具， 交替使用時對屠宰刀具進行徹底浸泡消毒， 防止屠宰場由于屠宰刀具帶來的交叉污染情況的發(fā)生。

另外， 沙門菌可以通過被污染的屠宰人員的手或其手套進行傳播。 屠宰流程中，胴體上的沙門菌的檢出率降低， 這是由于屠宰操作的清洗環(huán)節(jié)可以降低胴體污染。

3 討論

生豬屠宰場的采樣分離研究發(fā)現(xiàn)， 云南省紅河州某縣生豬在待宰圈等待屠宰期間也會造成交叉污染，待宰圈的清洗時清洗水的流動也會造成沙門菌的交叉污染。 其中屠宰時流水線上的污染主要來自于屠宰環(huán)節(jié)放血環(huán)節(jié)、燙毛環(huán)節(jié)、脫毛環(huán)節(jié)、劈半環(huán)節(jié)、 拋光環(huán)節(jié)等機械設(shè)施及其人工屠宰活動區(qū)域的污染， 其原因是屠宰操作時的不規(guī)范也會造成沙門菌的交叉污染， 有可能操作工人也會攜帶沙門菌進入屠宰場， 徹底消毒是解決的核心。

許多研究表明， 在放血環(huán)節(jié)豬體表面會受到高水平的污染， 當攜帶沙門菌的豬胴體經(jīng)過各個屠宰環(huán)節(jié)時會通過屠宰人員的手或刀具將沙門菌傳遞到其他胴體產(chǎn)生交叉污染[4]。 綜上可見在屠宰流水線上最重要的是對屠宰操作的嚴格執(zhí)行及其日常屠宰場的衛(wèi)生消毒管理， 及其標準化培訓是實現(xiàn)控制沙門菌污染的有力保障措施。