王 賢，牛 波，鄭芳昊 （. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第900 醫(yī)院, 福建 福州 50000；. 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東 廣州 5055；. 佛山市中醫(yī)院, 廣東 佛山 58000）

麻黃堿是中藥麻黃的主要有效成分，但它也可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用。麻黃堿屬于小分子生物堿，能夠通過(guò)血腦屏障對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用[1-4]。然而，有關(guān)麻黃堿神經(jīng)毒性的作用機(jī)制并不完全清楚。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)已被證實(shí)參與學(xué)習(xí)、記憶等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)[5]。突觸后致密蛋白是突觸后膜胞質(zhì)面聚集的一層均勻而致密的蛋白，其中PSD95 是主要成分之一[6]。而synapsin1 是維持突觸前膜功能的重要成分之一[7]。BNDF、PSD95 和synapsin1 與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性和功能的完備性密切相關(guān)。本研究以PC12 細(xì)胞為研究對(duì)象，考察麻黃堿的細(xì)胞毒性，同時(shí)檢測(cè)BDNF、PSD95 和synapsin1 表達(dá)水平的變化，初步探討麻黃堿引起細(xì)胞毒性的可能機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹽酸麻黃堿（批號(hào)：D03150702，赤峰艾克制藥科技有限公司）；BDNF 抗體（批號(hào)：ab108319）、PSD95 抗體（批號(hào)：ab18258）、synapsin1 抗體（批號(hào)：ab64581）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞

PC12 細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.3 儀器

電子天平（德國(guó)Sartorious 公司）；孵育箱（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（BioTek 公司）；Western blot 設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性

將培養(yǎng)瓶里的PC12 細(xì)胞接種到96 孔板上，每孔接種6 000 個(gè)細(xì)胞，用含1%FBS（胎牛血清）的RPMI 1640 培養(yǎng)12 h 后，吸棄原培養(yǎng)基，加入RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1 h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，使其終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、20 mmol，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入終濃度為0.5 mg/ml 的MTT，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 的DMSO（二甲基亞砜），輕微震蕩10 min，在酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 處的光密度(OD)值。

2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

將培養(yǎng)瓶的PC12 細(xì)胞接種到12 孔板中，用含1%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)12 h 后，吸棄原培養(yǎng)基，加入RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，使其終濃度分別為10、500、1 000 μmol，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，在倒置顯微鏡下明場(chǎng)視野觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)量變化

將6 孔板每孔接種105個(gè)PC12 細(xì)胞，用含1%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)12 h，換上基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI1640，1h 后分別加入不同濃度的麻黃堿，其終濃度分別為1、10、100、500、1 000 μmol，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，迅速將培養(yǎng)基吸棄，置于-30℃冷凍數(shù)小時(shí)，然后在冰上每孔加相應(yīng)量的RIPA（含1%磷酸酶抑制劑和1%蛋白酶抑制劑）裂解液，4℃震蕩30 min，將細(xì)胞裂解液收集到相應(yīng)離心管里，4℃低溫高速(12 000 r/min)離心10 min。取出上清，蛋白濃度檢測(cè)(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，加入相應(yīng)量的5×的上樣緩沖液和適量的RIPA 裂解液，95℃加熱10 min 制樣。制膠上樣，樣品80 V電泳結(jié)束后，400 mA 電流90 min 轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏氟乙烯膜）后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，按分子量切出相應(yīng)條帶，分別孵育相應(yīng)一抗過(guò)夜，洗滌后室溫孵育相應(yīng)二抗2 h，漂洗后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 麻黃堿對(duì)高分化PC12 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

MTT 結(jié)果如圖1 所示，麻黃堿在一定范圍內(nèi)對(duì)PC12 細(xì)胞有一定的毒性，經(jīng)擬合計(jì)算在PC12細(xì)胞中麻黃堿的IC25值為0.536 mmol，IC50值為2.8 mmol。

圖1 麻黃堿細(xì)胞活性試驗(yàn)（MTT 法）

3.2 細(xì)胞形態(tài)變化

PC12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化如圖2 所示，在20 倍鏡下觀察，隨著麻黃堿濃度的升高細(xì)胞數(shù)量與空白對(duì)照組相比逐漸減少，細(xì)胞突觸數(shù)量也隨之減少。1 000 μmol 濃度處理?xiàng)l件下，軸突長(zhǎng)度顯著減短，細(xì)胞體邊緣模糊，細(xì)胞體積顯著變小。

圖2 麻黃堿對(duì)PC12 細(xì)胞形態(tài)變化的影響

3.3 麻黃堿對(duì)PC12 細(xì)胞BDNF 表達(dá)的影響

圖3 結(jié)果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細(xì)胞中BDNF 的蛋白表達(dá)量增加。當(dāng)麻黃堿濃度為500 μmol 時(shí)，BDNF 的表達(dá)量約為空白對(duì)照組的1.58 倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；而當(dāng)麻黃堿濃度高達(dá) 1 000 μmol 時(shí)，BNDF 為對(duì)照組的1.91 倍(P＜0.001)。說(shuō)明該濃度范圍內(nèi)麻黃堿可以濃度依賴(lài)性的引起PC12 細(xì)胞中BDNF 表達(dá)升高。

圖3 麻黃堿對(duì)BDNF 表達(dá)水平變化的影響

3.4 麻黃堿對(duì)PC12 細(xì)胞PSD95 表達(dá)的影響

圖4 結(jié)果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細(xì)胞中PSD95 的表達(dá)增加。麻黃堿濃度為500 μmol時(shí)，PSD95 的蛋白表達(dá)水平約為空白對(duì)照組的1.38 倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；而當(dāng)麻黃堿濃度達(dá)到1 000 μmol 時(shí)，PSD95 表達(dá)量約上升為對(duì)照組的1.52 倍(P＜0.001)。說(shuō)明該濃度范圍內(nèi)麻黃堿可以濃度依賴(lài)性的引起PC12 細(xì)胞中PSD95 表達(dá)升高。

圖4 麻黃堿對(duì)PSD95 表達(dá)水平變化的影響

3.5 麻黃堿對(duì)PC12 細(xì)胞Synapsin1 表達(dá)的影響

圖5 結(jié)果顯示，隨著麻黃堿劑量的增加，PC12細(xì)胞中synapsin1 的表達(dá)量有下降的趨勢(shì)。其中，麻黃堿濃度為500 μmol 時(shí)，synapsin1 的蛋白表達(dá)水平約為空白對(duì)照組的0.65，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；而當(dāng)麻黃堿濃度達(dá)到1 000 μmol 時(shí)，synapsin1 表達(dá)量下降至對(duì)照組的0.53(P＜0.001)。說(shuō)明麻黃堿在該濃度范圍內(nèi)可以引起PC12 細(xì)胞中synapsin1 表達(dá)降低。

圖5 麻黃堿對(duì)synapsin1 表達(dá)水平變化的影響

4 討論

麻黃歷來(lái)被中醫(yī)冠以“解表第一要藥”，是治療外感風(fēng)寒表實(shí)證的重要中藥，主要用于風(fēng)寒感冒，胸悶喘咳，風(fēng)水浮腫等，麻黃湯就是以麻黃為君藥的治療表寒實(shí)證的代表名方。然而前期研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠連續(xù)灌胃麻黃，可以造成大鼠不同腦區(qū)損傷，其中對(duì)額葉皮層影響較大，HE 染色結(jié)果甚至觀察到神經(jīng)元凋亡早期的形態(tài)學(xué)改變[8-9]。已經(jīng)證實(shí)麻黃中對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮毒性作用的主要成分是麻黃堿。麻黃堿的神經(jīng)毒性可能與升高興奮性谷氨酸水平有關(guān)，過(guò)量的興奮性谷氨酸能引起多巴胺神經(jīng)末梢的破壞和額葉皮層、丘腦、邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)變性。為了明確麻黃引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的機(jī)制，本研究中將麻黃堿單體作為研究對(duì)象，考察其在體外細(xì)胞模型中的毒性作用。

PC12 細(xì)胞源于鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，在結(jié)構(gòu)上和功能上與神經(jīng)元有高度相似的地方，因其可重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究。本研究首先考察了不同濃度麻黃堿對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響，確定了麻黃堿引起細(xì)胞毒性的濃度范圍。在此基礎(chǔ)上，分別考察不影響細(xì)胞存活率情況下（IC25值以下濃度）及顯著影響細(xì)胞存活率情況下（IC25值以上濃度），麻黃堿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相關(guān)功能蛋白的影響。

BDNF 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的肽生長(zhǎng)因子的一員。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BDNF 在大腦海馬的CA1區(qū)可通過(guò)促進(jìn)興奮性突觸的發(fā)育來(lái)增強(qiáng)突觸強(qiáng)度。同時(shí)，BDNF 可以在皮層神經(jīng)元中增加介導(dǎo)中樞神經(jīng)中快速興奮性突觸傳遞的AMPA 受體的表達(dá)，提高動(dòng)物興奮性[10-13]。而外源性的BDNF 則可以通過(guò)增強(qiáng)突觸間的傳遞，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元的興奮性[14]。以上研究表明，BDNF 與神經(jīng)細(xì)胞的興奮性密切相關(guān)。PSD95 定位于突觸后膜，是高電子密度的半圓形區(qū)域形成的突觸后致密區(qū)的主要組成部分之一。研究發(fā)現(xiàn)在海馬神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)PSD95可以促進(jìn)成熟谷氨酸能突觸以及谷氨酸受體的活性[6,15]。PSD95 鏈接了興奮性受體NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受體）和下游信號(hào)分子，并且在神經(jīng)元成熟以及突觸的形成中發(fā)揮著重要作用[16]。盡管在多數(shù)神經(jīng)退行性病變中，提高BDNF 和PSD95的表達(dá)水平可以顯著改善行為學(xué)，但是也有研究表明在生理狀態(tài)下，神經(jīng)元的過(guò)度激活會(huì)引起神經(jīng)元的功能的減退甚至導(dǎo)致神經(jīng)損傷。由于BDNF 和PSD95 與神經(jīng)元興奮性關(guān)系密切，在前期的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，表明麻黃堿灌胃給藥會(huì)引起大鼠自主活動(dòng)的增加，并激活神經(jīng)元，故我們?cè)诳疾炻辄S堿產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制時(shí)，檢測(cè)了BDNF 和PSD95 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著麻黃堿濃度的增加，BDNF 和PSD95 的表達(dá)水平濃度依賴(lài)性地升高，當(dāng)濃度達(dá)到500 μmol 時(shí)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明麻黃堿可以引起體外神經(jīng)細(xì)胞模型的興奮狀態(tài)。

與此同時(shí)，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)一定劑量的麻黃堿會(huì)引起PC12 細(xì)胞突觸數(shù)量下降和長(zhǎng)度減短，說(shuō)明麻黃堿會(huì)引起突觸丟失。文獻(xiàn)研究表明，synapsin1 是突觸的重要標(biāo)志物，可以反應(yīng)突觸形態(tài)上的完整性和功能[7]。由此，我們?cè)诳疾炻辄S堿對(duì)PC12 細(xì)胞形態(tài)影響的同時(shí)，采用Western blot檢測(cè)了synapsin1 的表達(dá)水平。梯度濃度麻黃堿處理PC12 細(xì)胞后synapsin1 的表達(dá)變化結(jié)果表明隨著麻黃堿處理濃度的增加，synapsin1 的表達(dá)水平降低，當(dāng)濃度達(dá)到500 μmol 時(shí)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明麻黃堿有一定的細(xì)胞毒性的同時(shí)，也可以引起神經(jīng)細(xì)胞的突觸毒性，突觸蛋白的丟失可能也是引起神經(jīng)細(xì)胞毒性的原因之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明麻黃堿可以對(duì)PC12 細(xì)胞產(chǎn)生毒性。與正常細(xì)胞相比，麻黃堿處理組的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯的變化，BDNF和PSD95 等與興奮性相關(guān)的蛋白表達(dá)出現(xiàn)了明顯升高，而與突觸功能有關(guān)的蛋白synapsin1 表達(dá)出現(xiàn)了明顯下降，說(shuō)明麻黃堿產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用的機(jī)制與BDNF、PSD95 及synapsin1 的表達(dá)變化有關(guān)。