蘇曉薇，張華林，張 寧，楊 犇，許維恒，張俊平 （. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福建 福州 5008；. 陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 河北 張家口 07500；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院 上海 004）

STAT3 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與眾多細(xì)胞因子和生長因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1-2]。STAT3 的活化可以通過刺激白介素-6 受體（IL-6R）、Janus 酪氨酸激酶、BCR-ABL 和SRC 家族激酶等來啟動(dòng)[3]。STAT3 經(jīng)磷酸化活化后形成同源和異源二聚體，并易位至細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用[4-6]。目前，越來越多的證據(jù)顯示，多種惡性腫瘤存在STAT3 的過度激活，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、皮膚癌和宮頸癌等，抑制STAT3 的磷酸化成為一種很有前景的治療策略。此外，STAT3還與肝損傷、纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌缺血等疾病有關(guān)[7]。盡管一些STAT3 抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但迄今為止尚未批準(zhǔn)STAT3 抑制劑用于癌癥的治療。因此，仍然迫切需要發(fā)現(xiàn)潛在的STAT3 抑制劑[8]。

SPR 是一種光學(xué)生物傳感技術(shù)，該技術(shù)利用光學(xué)測(cè)量的折射率變化，分析樣品與固定在SPR 傳感器上的分子的結(jié)合情況。因其無需標(biāo)記樣品，具有高靈敏度，能實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子間的相互作用而被廣泛運(yùn)用于醫(yī)療檢測(cè)、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品檢測(cè)等領(lǐng)域[9]。

本課題采用SPR 技術(shù)從中藥單體中篩選能與STAT3 特異性結(jié)合的小分子化合物，通過蛋白免疫印跡技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告基因考察小分子對(duì)STAT3 的抑制作用，采用分子對(duì)接技術(shù)擬合化合物與STAT3 的結(jié)合模式，明確其可能的作用位點(diǎn)，從而為STAT3 抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

DMSO（美國Sigma 公司）；EDC/NHS（GE 公司）；胰酶（美國Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Corning 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；細(xì)胞裂解液、PMSF、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris（pH=8.8）、1.0 mol/L Tris（pH=6.8）、10%SDS、TEMED、BCA 試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；硝酸纖維素膜（德國Sartorius Stedim 公司）；轉(zhuǎn)染試劑(美國Life Technology 公司)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Biacore T2000(GE 醫(yī)療生命科學(xué)公司)；電子天平（上海天平儀器廠）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；制冰機(jī)（德國Eppendorf 公司）；-80℃低溫冰箱（美國Thermo 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；離心管（美國Corning 公司）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo 公司）；移液槍（德國Eppendorf 公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HeLa 細(xì)胞（購自上海碧云天生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室凍存、培養(yǎng)）；HeLa-STAT3-Luc 細(xì)胞（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、培養(yǎng)、凍存）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Biacore 鑒定STAT3 特異性結(jié)合小分子（1）STAT3 預(yù)富集

將STAT3 純化蛋白用去離子水溶解并配成1 g/L的蛋白母液，用4 種不同pH 的醋酸鹽緩沖液（pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5）稀釋蛋白母液至50 mg/L，進(jìn)樣，于Biacore 預(yù)富集系統(tǒng)檢測(cè)不同pH 條件下蛋白STAT3 的響應(yīng)值，確定最佳蛋白偶聯(lián)條件。

（2） STAT3 偶聯(lián)

在預(yù)富集實(shí)驗(yàn)中所得最佳pH 條件下，將STAT3稀釋至50 mg/L，通過EDC/NHS 活化CM5 芯片表面羧基，然后通過羧基氨基縮合反應(yīng)將STAT3 鍵合到CM5 芯片上，乙醇胺封閉未結(jié)合的羧基，從而實(shí)現(xiàn)STAT3 偶聯(lián)到CM5 芯片上的目的。

（3）親和力分子

將中藥小分子單體化合物用DMSO 溶解，然后用PBS 稀釋成32 μmol/L （DMSO 終濃度為5%）的樣品后進(jìn)樣，流動(dòng)相為5%DMSO 的PBS 溶液，通過Biacore 系統(tǒng)分析其流過STAT3 蛋白表面的響應(yīng)值，篩選出對(duì)STAT3 響應(yīng)值較高（高于陽性對(duì)照或與其相當(dāng)）的單體化合物作為候選化合物。

（4）動(dòng)力學(xué)分析

將候選化合物濃度以二倍比進(jìn)行梯度稀釋，濃度范圍為0.062 5～64 μmol/L（DMSO 終濃度均為5%），通過Biacore 系統(tǒng)分析獲得結(jié)合響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)值與候選化合物濃度之間的量效關(guān)系繪制動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)曲線擬合情況判斷候選化合物與STAT3 的結(jié)合特異性，從而找到能與STAT3 蛋白特異性結(jié)合的小分子單體。

1.2.2 蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測(cè)化合物對(duì)STAT3 磷酸化的抑制情況

HeLa 細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，加入不同濃度的化合物，作用24 h 后，加入100 μl Western及IP 細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L PMSF），冰上裂解25 min，收集蛋白于1.5 ml 離心管，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。蛋白樣品中加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，在250 mA 恒流電下將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到NC 膜上，5%脫脂牛奶封閉，進(jìn)行一抗（p-STAT3/STAT3）、二抗孵育，結(jié)束后在紅外雙色激光成像系統(tǒng)（Odyssey）上掃膜檢測(cè)700 和800 通道激發(fā)的熒光信號(hào)，觀察各泳道中蛋白表達(dá)情況。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因鑒定化合物抑制STAT3磷酸化的作用

HeLa-STAT3-Luc 細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×105個(gè)/孔接種于24 孔板，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度化合物孵育4 h，然后加入IL-6（100 ng/ml）和IL-6R（100 ng/ml）共同刺激24 h，棄上清液，每孔加入120 μl 細(xì)胞裂解液，離心后取5 μl 上清液轉(zhuǎn)移至新的384 孔板，每孔加入25 μl 熒光素酶1 液，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，然后加入25 μl 熒光素酶2 液，再次測(cè)熒光值，定內(nèi)參。

1.4 分子對(duì)接技術(shù)

分子對(duì)接以Protein Preparation Wizard 模塊處理蛋白，選擇STAT3 蛋白與小分子抑制劑的晶體復(fù)合物6NUQ，依次去水、加氫，以LigPrep 模塊處理配體，力場(chǎng)優(yōu)化均采用OPLS2005 模式，其余參數(shù)均使用默認(rèn)；以Grid 模塊建立蛋白對(duì)接坐標(biāo)，范德華力半徑設(shè)置為1.0；采用精確對(duì)接模式（XP）的方法進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)果用PyMol 軟件作圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Biacore 系統(tǒng)預(yù)富集STAT3 蛋白

為了研究STAT3 蛋白的最佳偶聯(lián)條件，采用不同pH 的醋酸鹽緩沖液稀釋蛋白，進(jìn)行預(yù)富集分析，結(jié)果顯示STAT3 在pH4.0 的條件下響應(yīng)值最高（圖1）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH4.0 的緩沖液進(jìn)行偶聯(lián)。

圖1 不同pH 條件下STAT3 芯片富集情況

2.2 Biacore 系統(tǒng)偶聯(lián)STAT3 蛋白

取市售的STAT3 蛋白用pH4.0 醋酸鹽緩沖液稀釋至50 mg/L，通過Biacore 系統(tǒng)的內(nèi)置程序偶聯(lián)到CM5 芯片上，結(jié)果顯示STAT3 偶聯(lián)量為8 000 RU，達(dá)到預(yù)計(jì)偶聯(lián)水平（圖2）。

圖2 Biacore 系統(tǒng)STAT3 蛋白偶聯(lián)情況

2.3 篩選中藥單體小分子化合物

為了篩選能夠結(jié)合STAT3 蛋白的小分子化合物，我們將50 種中藥單體統(tǒng)一稀釋到32 μmol/L，利用Biacore 系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)合情況，通過響應(yīng)值觀察小分子與STAT3 蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同小分子化合物與STAT3 蛋白的結(jié)合存在差異（圖3），我們以陽性對(duì)照（C188-9）為標(biāo)準(zhǔn)，篩選響應(yīng)值不低于陽性對(duì)照響應(yīng)值的化合物，得到了梓醇（catalpol）、黃芩素（baicalein）、芹黃素（apigenin）、槲皮素（quercitrin）、人參皂苷（ginsenoside）、京尼平苷酸（geniposidic acid）、桑辛素（morusin）等10 多種小分子作為候選化合物，接著進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析以確定它們與STAT3 蛋白的結(jié)合特異性。

圖3 50 種中藥單體在Biacore 系統(tǒng)中與STAT3 蛋白結(jié)合響應(yīng)的情況

2.4 候選化合物的動(dòng)力學(xué)分析

為了驗(yàn)證候選化合物與STAT3 蛋白的結(jié)合是否為特異性結(jié)合，我們將候選化合物進(jìn)行梯度稀釋，通過Biacore 系統(tǒng)分析獲得結(jié)合響應(yīng)值，繪制動(dòng)力學(xué)結(jié)合曲線。對(duì)10 多種化合物均進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)只有芹黃素與STAT3 的結(jié)合具有特異性。芹黃素與STAT3 的結(jié)合響應(yīng)值隨著藥物濃度的增大而升高，當(dāng)濃度增大到一定值時(shí)響應(yīng)值呈水平趨勢(shì)不再變化，說明高濃度芹黃素同STAT3 的結(jié)合存在飽和現(xiàn)象，即芹黃素與STAT3的結(jié)合為特異性結(jié)合（圖4）。因此，選擇芹黃素作為可能的STAT3 抑制劑進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。

圖4 特異性結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線

2.5 Western-blot 檢測(cè)結(jié)果

動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果證實(shí)芹黃素可以特異性結(jié)合STAT3，為了確證芹黃素對(duì)STAT3 磷酸化的抑制作用，我們利用IL-6 誘導(dǎo)活化STAT3，通過Western-blot 檢測(cè)芹黃素對(duì)STAT3 磷酸化的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6 可以顯著刺激HeLa 細(xì)胞STAT3 的活化，而芹黃素能劑量依賴地抑制IL-6 誘導(dǎo)的STAT3 磷酸化，表明芹黃素可能是STAT3的抑制劑（圖5）。

圖5 Western-blot 檢測(cè)芹黃素抑制STAT3 磷酸化效果

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果

為了進(jìn)一步確證芹黃素對(duì)STAT3 的抑制作用，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究芹黃素對(duì)STAT3 轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，IL-6 刺激可以顯著促進(jìn)STAT3 的轉(zhuǎn)錄活性，10μmol/L、20 μmol/L芹黃素能夠抑制IL-6 誘導(dǎo)的STAT3 轉(zhuǎn)錄活性的增加（圖6）。以上結(jié)果表明芹黃素能夠抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步證實(shí)芹黃素是STAT3 的小分子抑制劑。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)芹黃素抑制STAT3 活化的能力

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

為了明確STAT3 與芹黃素的相互作用情況，我們采用分子對(duì)接技術(shù)分析STAT3 與芹黃素的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，芹黃素結(jié)合于STAT3 蛋白的SH2 結(jié)構(gòu)域，占據(jù)了STAT3 磷酸絡(luò)氨酸的結(jié)合口袋。與關(guān)鍵殘基Glu638、Gln644、Gly656、Lys658形成氫鍵相互作用，與Tyr657 殘基形成π-π 相互作用（圖7）。

圖7 芹菜素與STAT3 蛋白（PDB: 6NUQ）的結(jié)合模式擬合圖

3 討論

STAT3 在腫瘤中的持續(xù)激活和過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)。STAT3的活化受多種細(xì)胞因子、生長因子，生長因子受體，非受體蛋白酪氨酸激酶等多重信號(hào)分子的調(diào)控，目前已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[10]。 STAT3存在6 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括氨基末端結(jié)構(gòu)域（NTD）、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（CCD）、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、接頭結(jié)構(gòu)域、Src 同源結(jié)構(gòu)域（SH2）和羧基末端反式激活（TAD）結(jié)構(gòu)域。目前，對(duì)STAT3 的直接抑制作用可以通過破壞SH2、DBD 或NTD 結(jié)構(gòu)域來阻止功能性STAT3 二聚體的形成。STAT3 的直接抑制劑主要分為三類：肽，小分子抑制劑和寡核苷酸。間接抑制劑則通過靶向STAT3 信號(hào)通路阻斷上游信號(hào)通路（如IL-6 和JAK 通路）間接抑制STAT3[11-12]。目前，STAT3 抑制劑的研發(fā)已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

芹黃素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[13]，其在多種癌癥中（如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌等）表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的生長抑制與促凋亡作用。芹黃素不僅能夠通過內(nèi)源性與外源性凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也能通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-9 的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲[14]。但是，芹黃素與STAT3 的關(guān)系尚未研究，其對(duì)STAT3的抑制作用也沒有報(bào)道。

本研究利用表面等離子體共振技術(shù)，從50 個(gè)中藥單體中篩選出能與STAT3 特異性結(jié)合的小分子化合物芹黃素，然后運(yùn)用Western-blot、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了芹黃素對(duì)STAT3 的抑制作用。采用分子對(duì)接技術(shù)分析STAT3 與芹黃素的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果揭示芹黃素主要通過結(jié)合STAT3 的SH2 結(jié)構(gòu)域抑制其磷酸化。本研究為芹黃素抗癌作用提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為發(fā)現(xiàn)STAT3 及其他藥物靶點(diǎn)的小分子抑制劑提供了研究經(jīng)驗(yàn)。