Yousef Sultan, Naresh Magan?

（1. 英國克蘭菲爾德大學(xué)，環(huán)境和農(nóng)業(yè)食品學(xué)院，應(yīng)用真菌學(xué)團隊，英國，貝德福郡，克蘭菲爾德，MK43 0AL；2. 埃及國家研究中心食品毒素和污染物研究院，埃及，開羅 12622）

真菌生長會導(dǎo)致儲存的商品谷物和堅果的質(zhì)量和營養(yǎng)價值顯著降低。花生中的真菌腐敗還會導(dǎo)致有毒次生代謝產(chǎn)物的污染，尤其是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素B1（AFB1）是1a類致癌物質(zhì)。采前的干旱脅迫或干燥和儲存不當(dāng)會導(dǎo)致黃曲霉和寄生曲霉在花生和樹生堅果的定殖，并伴隨AFB1污染。事實上，20%～25% 的損失可能都是由腐敗霉菌和真菌毒素造成的[1-2]。

為了衛(wèi)生目的消除真菌污染物和害蟲，使用氣調(diào)貯藏、監(jiān)測揮發(fā)性有機化合物和化學(xué)熏蒸，特別是采后儲存期對筒倉都進行檢測使用[3]。然而，從食品安全的角度看，由于殘留問題和消費者接受度的問題，氣體熏蒸劑的使用受到限制。因此，已考慮采用替代方法來減少產(chǎn)真菌毒素物種的真菌污染，并嘗試減少采后損失[3]。

氣體系統(tǒng)中關(guān)鍵檢測二氧化硫（SO2）和臭氧（O3）。SO2是一種氣態(tài)食品添加劑，多年來一直是通過燃燒硫磺產(chǎn)生的煙霧作為消毒劑[4-5]。由于其抗菌特性，SO2也被歸為食品級防腐劑（E220）。它也被用作抗真菌劑，用于保存葡萄和一系列加工食品，包括干果、烘焙產(chǎn)品、早餐麥片和包括白葡萄酒在內(nèi)的飲品[6]。然而，高濃度的 SO2會對人體產(chǎn)生影響，包括肝臟和心血管疾病、皮疹和呼吸系統(tǒng)問題[7]。為了控制谷物中的霉菌和真菌毒素，Serre[8]報道，用 SO2處理小麥需要較高的濃度，因為SO2會被吸收并結(jié)合到小麥上，從而將抗真菌活性降至最低。

Magan[4-5]研究表明，在0.995和0.95的水分活度（aw）下，50 ppm溶解的SO2可阻止產(chǎn)毒素真菌（例如黃曲霉、赭曲霉和土曲霉）的生長。然而，在 0.96和 0.92 aw條件下，通常需要至少200 ppm 的 SO2才能將谷物中的真菌數(shù)量減少1～2 log CFU。Pezley[9]發(fā)現(xiàn) SO2與食物的營養(yǎng)成分結(jié)合使酵母對較高濃度的SO2具有更強的抵抗力。SO2在水中的溶解產(chǎn)物很大程度上取決于pH水平[10]。他們建議用于控制 OTA的SO2的焦亞硫酸鈉的有效劑量，在 0.985 aw時約為 650～700 ppm，在 0.965 aw時約為 400～500 ppm，0.93 aw時約為 400～450 ppm。

臭氧（O3）是一種強氧化劑和不穩(wěn)定的三原子化合物，可在低層大氣中分解為正常的氧氣（O2），而沒有任何殘留物[11]。氣態(tài)O3是一種無色氣體，在食品工業(yè)中被用作微生物和化學(xué)品的高效氧化劑和消毒劑[12]。O3氣體通過兩種方法自然產(chǎn)生，包括太陽紫外線和閃電。也可通過三種方法人工生產(chǎn)，包括紫外線、電暈放電法（CDM）和電解 O3產(chǎn)生法（EOG）。電暈放電法是當(dāng)今最常用的O3產(chǎn)生方法[3,13]。

O3氣體已廣泛用于食品行業(yè)，用于對包裝材料、原材料和存儲設(shè)施的消毒[14]。與食品中使用的其他化學(xué)品相比，O3最重要的優(yōu)勢是它無殘留。由于其半衰期很短，在大氣中約為20～50 min，在水中約為1～10 min，它會迅速分解為雙原子氧[15]。研究還發(fā)現(xiàn) O3可有效破壞毒素和進行真菌毒素脫毒，包括黃曲霉毒素[16]。

O3雖然對微生物有效，特別是應(yīng)用于水基系統(tǒng)，但在食品生產(chǎn)鏈應(yīng)用時還是需要注意。O3會導(dǎo)致質(zhì)量和營養(yǎng)價值發(fā)生負(fù)面變化，特別是與脂質(zhì)氧化、顏色損失、某些維生素和酚類化合物降解有關(guān)[16-17]。它還被用于醫(yī)療應(yīng)用，包括治療糖尿病患者的足部潰瘍[18]。然而，需要注意，暴露高于自然水平的高劑量O3會有害健康，例如呼吸系統(tǒng)[19]和心血管疾病[20]。根據(jù)聯(lián)邦職業(yè)安全與健康管理局（OSHA）規(guī)定[21]，F(xiàn)DA對O3的限量是0.1 ppm 連續(xù) 8 h 或 0.3 ppm 15 min 使用。

真菌種類對O3具有不同的敏感性和耐受性，這取決于濃度（ppm）×暴露時間、孢子形態(tài)以及底物類型和水分含量的影響[11]。El-Desoky等[22]發(fā)現(xiàn)，隨著O3濃度和暴露時間的增加，黃曲霉在（PDA）培養(yǎng)基中產(chǎn)生的 AFB1量逐漸減少。他們還發(fā)現(xiàn)，暴露于 40 ppm O35～20 min 后，黃曲霉在谷物（如小麥）中產(chǎn)生的AFB1降低了55%～77%。Sahab等[23]報道，花生種子在 40 ppm O3中暴露 10 min可抑制 95%的 AFB1和 99%的AFB2。然而，在這些研究中沒有控制可用水條件。在最近對咖啡進行 O3處理以減少赭曲霉和炭黑曲霉的數(shù)量以及赭曲霉毒素 A（OTA）污染的研究中發(fā)現(xiàn)，即使?jié)舛葹?600 ppm，也難以有效降低該商品中的OTA水平[11]。

本研究的目的是：（a）研究氣態(tài) O3在 YES培養(yǎng)基不同水分活度（aw）條件下，對兩株黃曲霉（從花生中分離的EGP-B07，參考菌株SRRC-G 1907）的孢子萌發(fā)、菌絲生長和 AFB1產(chǎn)生的影響；（b）評估 O3處理對接種不同初始孢子濃度（103，105CFUS/mL）的儲存花生中黃曲霉種群的影響；（c）對儲存花生AFB1污染影響的量化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Miracloth：德國，默克公司；商品 MEA：Oxoid，英國漢普郡貝辛斯托克；55 mm培養(yǎng)皿：英國萊斯特郡拉夫堡，賽默飛世爾科技公司；電暈放電臭氧發(fā)生器，C-Lasky，型號CL-010-DS：空氣樹臭氧技術(shù)有限公司，臺灣臺北 22150；O3分析儀：美國新墨西哥州圣達(dá)菲，生態(tài)傳感器公司，型號UV 100；KS 501數(shù)字振蕩器：德國，艾卡公司；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇母液：美國賓夕法尼亞，Supelco公司；aflaprep柱：Neogene Europe，寬口徑；Agilent 1200 系列系統(tǒng)：英國伯克斯，安捷倫公司；C18 柱（Luna 5 micron，150×4.6 mm）、保護柱（4×3 mm 柱）：美國飛諾美公司；Statistica 9：美國俄勒岡州塔爾薩，StatSoft 公司。

1.2 真菌菌株

從埃及花生中分離到的黃曲霉EGP-B07用于體外或體內(nèi)接種實驗。在 MEA檢測前對真菌菌株進行傳代培養(yǎng)。用10 mL含0.05%吐溫-20的無菌蒸餾水從菌落表面洗下孢子至25 mL瓶。所得孢子懸浮液過兩層Miracloth濾布過濾。真菌孢子濃度用血細(xì)胞計數(shù)器測定，并調(diào)整至 106個孢子/mL，用于培養(yǎng)基培養(yǎng)或花生接種。黃曲霉模式菌株SRRC-G1907作為參考菌株進行實驗比較。

1.3 研究用培養(yǎng)基

麥芽浸膏培養(yǎng)基（MEA）：商品MEA根據(jù)供應(yīng)商說明使用，其中加入少量氯霉素（250 μg/mL）以抑制細(xì)菌生長，各組分混合均勻，在121 ℃，1 atm條件下高壓滅菌15 min。培養(yǎng)基冷卻至約50 ℃時，倒入無菌的90 mm直徑培養(yǎng)皿中。冷卻凝固的平板放入密封袋，在4 ℃下最長可保存21 d。

酵母浸膏蔗糖培養(yǎng)基（YES）：在885 mL蒸餾水中加入20 g酵母提取物和瓊脂、150 g蔗糖和 0.5 g MgSO4·7H2O 制備成 YES。各組分混合均勻，高壓滅菌后，倒入55 mm培養(yǎng)皿中。4 ℃保存在密封袋中。使用前先在25 ℃下平衡。

用甘油（9.2、23和 36.8 g/100 mL）調(diào)整 YES培養(yǎng)基的水分活度。充分混合，調(diào)整水分活度至0.95、0.92 和 0.89 aw（=19.5%～13.1% m.c.）。將培養(yǎng)基倒入直徑為55 mm培養(yǎng)皿。使用Aqualab TE3儀器檢查所有培養(yǎng)基 aw水平，誤差控制在0.003 aw以內(nèi)。

1.4 臭氧的制備方法

臭氧氣體由實驗室電暈放電臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，流速為6 L/min[11]。將裝有花生的盤子或容器（無蓋）置于O3暴露室（Kilner玻璃罐）中并密封。臭氧氣體通過一根管子和腔室蓋中的相關(guān)閥門加入，并控制所需的濃度。由第二個管和 O3分析儀測量出口氣體中O3的濃度。確保在O3暴露期間獲得準(zhǔn)確的O3濃度。

1.5 臭氧暴露對黃曲霉分生孢子萌發(fā)的影響

將100 μL黃曲霉106孢子/mL等份地涂布在不同的aw水平（0.89、0.92、0.95和0.97 aw）的YES培養(yǎng)基上，并將平板放置在無蓋的O3反應(yīng)器中保持無菌。調(diào)節(jié) O3發(fā)生器使反應(yīng)室內(nèi)持續(xù)30 min 產(chǎn)生 20、40、100 和 250 ppm O3，流速為6 L/min。處理后，平板在 25 ℃培養(yǎng) 48 h。每隔12 h取下兩塊（直徑 0.8 cm）置于載玻片用乳酚棉藍(lán)染色，小心地蓋上蓋玻片，并檢查萌發(fā)情況。檢查四個隨機顯微區(qū)域以確定兩種菌株的孢子萌發(fā)情況。所有實驗均進行3次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)操作重復(fù)1次。當(dāng)芽管長度等于或大于孢子直徑時，認(rèn)為孢子已經(jīng)萌發(fā)[24]。計數(shù)萌發(fā)孢子數(shù)，并記錄其占總孢子數(shù)的百分比。

1.6 臭氧暴露對菌絲生長和AFB1產(chǎn)生的影響

在不同 aw水平的 YES培養(yǎng)基平板中，接種每株菌株的孢子懸浮液（106/mL）5 μL，并在 25 ℃下培養(yǎng)。當(dāng)兩黃曲霉菌株的菌落直徑達(dá)到 0.6～0.8 cm 時，將菌落分別暴露于 75、100、150和300 ppm 的 O36 L/min 中 30 min。隨后將處理過的平板置于25 ℃中培養(yǎng)72 h。每12 h在成直角的兩個方向上測量菌落直徑。利用菌落生長與時間的關(guān)系和線性生長階段的斜率來獲得徑向生長率mm/day。

1.7 O3對黃曲霉 EGP-B07和帶殼花生 AFB1產(chǎn)量的原位影響

帶殼花生最初在12～15 KGys（參照）下進行伽馬輻照，以殺死所有污染微生物。通過水分吸附曲線來計算花生樣品在目標(biāo) aw水平中所需的準(zhǔn)確水量[25]。將帶殼花生樣品（25 gms）置于帶微孔蓋的玻璃罐中，將其分成2組并加水以獲得0.93 aw(=16.5% m.c.)。在密封的環(huán)境室中 4 ℃下平衡過夜，期間定期混合以實現(xiàn)有效平衡，然后在25 ℃下平衡，每克花生接種103或105個孢子。三個重復(fù)樣品25 ℃下在通風(fēng)櫥中以6 L/min的流速經(jīng)100、200和400 ppm的氣態(tài)O3中，無菌暴露 30 min。對照組以相同方式暴露于空氣中30 min。處理分別在密封的環(huán)境室進行。每個環(huán)境室包括 2×500 mL 0.93 aw的甘油/水溶液，以保持大氣平衡相對濕度與帶殼花生的一致。

25 ℃儲存4 d，處理前和處理后分別測定儲存帶殼花生中黃曲霉數(shù)量和AFB1水平。在MEA板上計數(shù)，每個重復(fù)取5 mg樣品連續(xù)稀釋，用無菌水+吐溫80（0.125%）稀釋為多個梯度（10-2～10-6），并取0.1 mL涂布于MEA培養(yǎng)基。將這些平板在25 ℃下培養(yǎng)5～7 d，并根據(jù)干重（g/花生）對黃曲霉種群數(shù)量進行量化。

1.8 使用高效液相色譜法（HPLC）從培養(yǎng)基和花生樣品中提取和定量AFB1

1.8.1 從培養(yǎng)基取樣

將暴露于不同 O3濃度的 YES培養(yǎng)基上菌絲菌落（5～6 塊，直徑 5 mm）轉(zhuǎn)移到 2 mL Eppendorf管中并稱重[26]。將 800 μL氯仿等量加入每個Eppendorf管，使用KS 501數(shù)字振蕩器振蕩1 h。將氯仿提取物轉(zhuǎn)移到新的液相小瓶中，空氣中干燥后使用AOAC[27]的衍生方法，然后使用HPLC進行定量分析。將200 μL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇母液，含有 200 ng B1、60 ng B2、200 ng G1和60 ng G1，氮吹干燥并衍生化。制備四種濃度HPLC上樣注射液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC的AFB1檢測限為 0.8 ng/g。

1.8.2 花生中黃曲霉毒素B1的分析

使用 aflaprep柱對來自每個處理的花生樣品的三個重復(fù)進行AFB1分析。將5 g研磨樣品與1 g鹽（NaCl）和 25 mL 60%甲醇混勻（高速 1 min）。然后通過Whatman 1號濾紙過濾，濾液收集在干凈的容器中。用磷酸鹽緩沖液（PBS）1∶1稀釋10 mL 過濾物。稀釋的提取物（20 mL=2 g 樣品）以約1.5～2.0 mL/min的速率通過適配器連接到柱上的50 mL玻璃注射器儲液罐中，在不干燥的情況下過aflaprep柱。移除50 mL玻璃注射器和適配器，將柱子完全充滿25%甲醇，然后將儲液器重新連接到適配器上。20 mL 25%甲醇以 2 mL/min的速率通過色譜柱（直到空氣通過色譜柱）。將2 mL甲醇小心推過色譜柱，并收集在 2 mL Eppendorf管中。洗脫液氮吹輕輕干燥，進行衍生化，然后進行 HPLC分析?；ㄉN子 AFB1的檢測限為 0.012 ng/g。

1.8.3 黃曲霉毒素的衍生化

將 200 μL 己烷和 50 μL 三氟乙酸（TFA）添加到裝有樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的小瓶中。將小瓶蓋上蓋子，劇烈混合（30 s）并將混合物靜置5 min。然后向混合物中加入 950 mL H2O∶乙腈（9∶1）并劇烈搖晃30 s，靜置10 min形成兩層。過濾下層水層用于分析（AOAC，2005）。

1.8.4 HPLC 條件

用于黃曲霉毒素的HPLC系統(tǒng)是Agilent 1200系列系統(tǒng)，帶有熒光檢測器（FLD G1321A）、自動進樣器ALS G1329A、控溫模塊FC/ALS therm G1330B、脫氣器 G1379B、Bin Bump G1312A、C18柱和保護柱。流動相為甲醇∶水∶乙腈（30∶60∶10, v/v/v），在 360 nm 激發(fā)波長和 440 nm 發(fā)射波長下以1 mL/min的流速運行25 min進行AFs分析。對于OTA分析，乙腈（57%）∶水（41%）∶乙酸（2%）以相同的流速在333 nm激發(fā)、460 nm發(fā)射波長下使用樣品的運行時間為15 min，OTA檢測時間為 5.75 min。

1.9 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計顯著性使用Statistica 9確定。黃曲霉的CFU和 AFB1水平（ng/g）的值對數(shù)化后用于分析。增長率平均值、黃曲霉的log10CFUs和log10AFB1濃度通過方差分析（ANOVA，二元和三元分析）確定（P<0.05）。Fisher’s LSD 方法（α=0.05）也用于比較處理組和對照組之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理對在培養(yǎng)基中黃曲霉孢子萌發(fā)的影響

圖1顯示了接種培養(yǎng)48 h前一黃曲霉菌株經(jīng)不同濃度O3處理30 min的效果。兩菌株都顯示相似的結(jié)果，總體來說，除 0.92 aw外，孢子萌發(fā)率隨著O3劑量的增加而逐漸降低，并隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，尤其是黃曲霉SRRC-G 1907菌株。培養(yǎng) 36 h內(nèi)，該菌株在 O3的 40 ppm（46%～64%）下的萌發(fā)率高于 20 ppm（23%～34%）。0.92 aw下24 h后的萌發(fā)孢子情況，可以通過顯微鏡鏡檢和兩菌株平板給予證實。黃曲霉SRRC-G 1907的孢子萌發(fā)對臭氧較之EGP-B07更敏感。除了在 0.89 aw 和 100 ppm 48 h 后的情況，在所有aw水平下，兩菌株在100和250 ppm的培養(yǎng)期間內(nèi)，孢子均未能萌發(fā)。統(tǒng)計上，培養(yǎng)時間（h）、aw、菌株類型及他們之間二、三和四方的相互作用對黃曲霉孢子萌發(fā)（%）的影響是顯著的。氣態(tài) O3處理、時間和 aw對兩菌株的孢子萌發(fā)率都有最顯著影響。

圖1 臭氧濃度（ppm）對YES培養(yǎng)基黃曲霉EGP-B07的孢子萌發(fā)48 h的影響Fig.1 Effect of ozone concentration (ppm) on spore germination of A. flavus EGP-B07 on YES media over periods of 48 hrs

2.2 臭氧暴露對菌絲生長的影響

圖2顯示了100和300 ppm O3對兩黃曲霉菌株菌落生長和菌絲體擴展的影響。處理后 3 d，O3對兩菌株的菌絲擴展延伸的影響相對較小，但在較低的aw水平（0.89和0.92 aw）下效果更明顯。在 0.89和 0.92 aw時，O3的處理使黃曲霉菌株EGP-B07的生長速度顯著降低，黃曲霉菌株SRRC-G 1907的生長僅在 0.92 aw下明顯。統(tǒng)計結(jié)果表明 aw、菌株類型和 O3是影響菌絲延伸的重要因素。

圖2 黃曲霉EGP-B07和 SRRC-G 1907在YES上25 ℃培養(yǎng)3 d的相對生長率Fig.2 Relative growth rate of A. flavus EGP-B07 and strain SRRC-G 1907 on YES media at 25 ℃ for 3 days

圖3顯示了在不同aw條件下培養(yǎng)3 d后，O3處理對黃曲霉EGP-B07和SRRC-G 1907的生長菌落產(chǎn)生AFB1的影響。與對照組（0 ppm）相比，使用300 ppm的O3劑量下，黃曲霉EGP-B07在0.89、0.95 aw下，SRRC-G 1907 在 0.89、0.97 aw下產(chǎn) AFB1能力顯著降低。AFB1最大減少量（2.3 log10ng/g）發(fā)生在 0.89 aw的黃曲霉 EGPB07中。黃曲霉在YES培養(yǎng)基中產(chǎn)AFB1水平的統(tǒng)計分析表明，除aw和菌株相互作用外，臭氧化、aw、菌株類型、兩方和三方相互作用都具有統(tǒng)計學(xué)意義。主要影響由菌株、aw和O3決定。

圖3 臭氧暴露對黃曲霉EGP-B07和SRRC-G 1907菌株在YES上25 ℃培養(yǎng)3 d后產(chǎn)生AFB1的影響Fig.3 Effect of ozone exposure on AFB1 produced by A. flavus EGP-B07 and SRRC-G 1907 strains on YES media at 25 ℃ after 3 days incubation

2.3 臭氧對儲存帶殼花生的黃曲霉種群和黃曲霉毒素B1污染的原位影響

圖4顯示了不同初始?xì)鈶B(tài) O3接種量對黃曲霉種群變化的影響。從花生中分離出的產(chǎn)毒素真菌數(shù)量顯著減少，尤其是在200和400 ppm O3條件下。與處理前相比，減少量從 0.8到 2.2 log CFUs/g，特別是在更高初始接種量（105個孢子/g）的帶殼花生中，表現(xiàn)更顯著。統(tǒng)計學(xué)上，所有因素及其相互作用都顯著影響了黃曲霉的種群數(shù)量（log10CFUs/g）。初始接種濃度是影響種群的主要因素，其次是O3處理。

圖4 臭氧處理30 min（6 L/min）對儲存4 d前后帶殼花生分離出的黃曲霉EGP-B07種群的影響Fig.4 Effect of ozone treatment for 30 min at 6 L/min on isolation of viable populations of A. flavus EGP-B07 from shelled peanuts before and after storage for 4 days

圖5顯示了儲存前兩種不同初始濃度黃曲霉孢子（103、105個孢子/g）的殼花生經(jīng)O3處理后，其AFB1污染的情況。100和400 ppm的O3劑量顯著降低了接種105個孢子/g的樣品中的AFB1。然而，400 ppm O3，可顯著減少接種103個孢子/g樣品的 AFB1。結(jié)果統(tǒng)計表明，只有培養(yǎng)時間，O3和時間的相互作用顯著（P<0.05）影響 AFB1的產(chǎn)生。

圖5 帶殼花生在0.93水活度下儲存4 d后，以6 L/min的速度氣態(tài)臭氧暴露30 min，對不同初始接種物AFB1污染的影響Fig.5 Effect of gaseous ozone exposure of shelled peanuts for 30 min at 6 L/min on AFB1 contamination with different initial inoculums after 4 days storage at 0.93 water activity

3 討論與結(jié)論

3.1 對萌發(fā)的影響

本研究中使用了兩株黃曲霉菌株來評估氣態(tài)O3抑制孢子萌發(fā)的功效。黃曲霉EGP-B07是從埃及花生中分離出來的，黃曲霉SRRC-G 1907是參考菌株。暴露于O3氣體能抑制分生孢子萌發(fā)，濃度>100 ppm 可在48 h完全抑制萌發(fā)。一般來說，與菌株 SRRC-G 1907相比，菌株 EGP-B07在<100 ppm的劑量下對O3暴露更具抵抗力。

很少有研究分析體外 O3對不同 aw水平下的絲狀真菌的影響，對黃曲霉進行相關(guān)研究更少。Zotti等[28]報道，用 O3處理黃曲霉菌落（生長 3 d）3 h能完全抑制分生孢子的活力。然而，O3處理的效果隨著菌落培養(yǎng)時間（6和9 d）的增加而降低。此外，發(fā)現(xiàn)黑曲霉比黃曲霉對O3處理更敏感。然而，最近的研究表明，來自曲霉屬Circumdati和Niger類群的物種可耐受高達(dá)500 ppm的O3[11]。Hudson和 Sharma[29]將無菌塑料托盤蓋表面上的13種不同真菌物種，包括黃曲霉和黑曲霉，暴露于臭氧（35 ppm）中 20 min。他們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過 48 h的培養(yǎng)，大多數(shù)真菌的 3 log10CFUs失活。Beuchat等[30]研究了臭氧對懸浮液中產(chǎn)毒黃曲霉和寄生曲霉的滅活作用。他們發(fā)現(xiàn)，在pH 5.5和7.0下，黃曲霉的D值（殺死90%分生孢子所需的時間）為1.72和1.54 min；寄生曲霉的D值分別為2.08和1.71 min。然而，液體懸浮液與干分生孢子或暴露于不同aw水平分生孢子有很大的不同，僅對極少數(shù)物種進行過驗證[11,31]。事實上，Mylona等[31]發(fā)現(xiàn)，雖然O3暴露最初抑制輪枝鐮孢菌分生孢子的萌發(fā)，但隨后它們可以通過 DNA修復(fù)機制恢復(fù)，繼續(xù)菌絲生長并產(chǎn)生伏馬毒素。因此，可能需要進行長期實驗來檢查黃曲霉中的這些過程。

3.2 對體外生長和AFB1產(chǎn)生的影響

通常，無論濃度如何，無論aw水平如何，這兩菌株的生長速度相對不受 O3暴露的影響，但aw水平似乎是一個更重要的非生物因素。黃曲霉EGP-B07 在 0.89、0.95 aw和黃曲霉 SRRC-G 1907在 0.89、0.97 aw 的較高 O3（300 ppm）劑量下，AFB1的產(chǎn)生受到顯著影響。將黃曲霉 EGP-B07暴露在 0.89 aw，300 ppm 的 O3抑制效果最好（2.3 log10ng/g）。Mason 等[15]將 O3（5 d）應(yīng)用于黃曲霉和串珠鐮刀菌培養(yǎng)物。他們發(fā)現(xiàn)瓊脂表面上的孢子和菌絲生長完全被O3抑制。Vijayanandraj等[32]報道了O3抑制了黑曲霉?fàn)I養(yǎng)菌絲體的生長，但對孢子萌發(fā)沒有任何影響。這可能部分歸因于色素沉著，可以保護分生孢子免受O3的損害。有人提出，在溶解有機和無機物質(zhì)的情況下，O3的有效性會降低，因為它們對微生物具有抵抗 O3的保護作用[21]。

對AFB1生產(chǎn)的影響而言，Zotti等[28]報道，將黃曲霉菌落暴露于 O3可通過對黃色素的漂白作用間接減少毒素的產(chǎn)生。基于Shier等[33]研究，菌落的黃色蒽醌色素可能是合成黃曲霉毒素所需的生物中間體，或是未利用的分支途徑產(chǎn)物。

3.3 臭氧對儲存花生中黃曲霉種群和AFB1產(chǎn)量的原位影響

在本研究中，O3處理對帶殼花生的初始孢子接種量的影響（103和105分生孢子/g）。一般來說，初始接種量越低，O3濃度越高，抑制效果越好。在較低的接種量水平下，200和400 ppm的劑量完全抑制了儲存帶殼花生中的分生孢子產(chǎn)生。同時，接種105個孢子/g的花生中，400 ppm顯著降低了 2.2 log CFUs/g。Giordano 等[34]最近的研究表明，從應(yīng)用之日起，31 ppm的O3處理5 h就能夠成功抑制巴西堅果上產(chǎn)毒素的曲霉物種的活力。此前，對玉米的研究表明，用50 ppm O3處理玉米3 d后，玉米表面的寄生曲霉污染減少了63%[35]。

在接種 103/105分生孢子/g后立即用 O3處理花生樣品，在接種和暴露于O3后的AFB1污染水平即刻影響相對較小。然而，儲存4 d后，由于黃曲霉接種物的定殖，AFB1污染顯著增加。使用400 ppm的O3劑量預(yù)儲存確實顯著抑制了兩種初始接種水平的帶殼花生的 AFB1生產(chǎn)。有研究使用14和32.5 ppm的低O3濃度處理巴西堅果完全抑制了AFB1的產(chǎn)生，處理24 h后完全抑制了產(chǎn)黃曲霉毒素的真菌生長[34]。然而，沒有研究初始aw的影響以及與O3暴露的相互作用。

Wang等[36]研究表明，在降解赭曲霉毒素 A（OTA）形成方面，濕法O3熏蒸谷物比干法更有效。OTA 暴露于 30 ppm O3120 min 或暴露于60 ppm O390 min 后降解[37]。當(dāng)暴露于 20～40 ppm O320 min 時，人工接種的受污染小麥（10 μg/kg）中AFB1的降解率為84%～86%[37]。

O3已被確認(rèn)為用為食品加工的 GRAS[3,38]。此外，O3確實會迅速（半衰期20～50 min）分解為分子氧而不留下任何殘留物[35]。然而，它可以有效延長不同商品的儲存期[39]。需要注意處理富含脂質(zhì)的商品，因為在高O3處理濃度下可能會出現(xiàn)一些污染。最好以較低濃度較長時間處理此類商品以獲得所需效果。然而，O3使用上并不是很友好，需要有效的安全規(guī)程和設(shè)備，以確保在使用過程中不會降解。另外，O3可能對橡膠管和密封件具有很強的腐蝕性，因此 PTFE管和不銹鋼或類似的容器材料可有效用于商業(yè)用途[3]。

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