Kalliopi Mylona, Angel Medina, Naresh Magan?

（英國(guó)克蘭菲爾德大學(xué)，環(huán)境和農(nóng)業(yè)食品領(lǐng)域?qū)W院，應(yīng)用真菌學(xué)團(tuán)隊(duì)，英國(guó) 克蘭菲爾德，MK43 0AL）

榛子（Corylus avelannaL.）是一種受歡迎的樹(shù)生堅(jiān)果，主要種植在土耳其和南歐。土耳其是最大的榛子生產(chǎn)國(guó)，約占世界產(chǎn)量的 75%[1]。榛子是重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，尤其是脂質(zhì)，包括單不飽和脂肪酸、生育酚和植物酚以及酚類(lèi)化合物，所有這些成分都有益于健康[2-3]。

收獲的帶殼榛子具有良好的屏障，可以防止真菌污染和潛在的真菌毒素污染，尤其是黃曲霉毒素（AFs）。然而，榛子的干燥緩慢，尤其是自然曬干可能需要數(shù)周時(shí)間，為真菌定殖和AFs污染提供有利條件。若遇較差的儲(chǔ)存條件會(huì)加劇AFs的污染[1]。因此，包括歐盟在內(nèi)的許多國(guó)家對(duì)此類(lèi)堅(jiān)果的最大黃曲霉毒素 B1（AFB1，1a類(lèi)致癌物）和總 AFs有嚴(yán)格的法定限制，AFB1和總 AFs分別為 5 和 10 μg/kg[4]。

榛子與其他可食用種實(shí)一樣，具有生命，并在安全儲(chǔ)存和水分條件下（水分活度，aw；<0.70 aw= 7.5%～8% 水分含量（m.c.））通常進(jìn)行非常低水平的呼吸。在這些條件下，雖然真菌污染物存在，但它們無(wú)法引發(fā)腐敗或毒素污染[5-6]。然而，榛子采收時(shí)非常潮濕>25% m.c.，在干燥過(guò)程中m.c. 減少到安全水平。但是，緩慢或低效的干燥和隨后的儲(chǔ)存可能污染上真菌，特別是黃曲霉類(lèi)群（例如，黃曲霉）能在堅(jiān)果上定殖，導(dǎo)致AFs，尤其是AFB1的污染增加。這些物種喜干（嗜旱）并且由于它們能夠產(chǎn)生相關(guān)的水解酶，能在中等濕度條件下迅速定殖富含脂質(zhì)的底物[7]。這就會(huì)導(dǎo)致干物質(zhì)損失（dry matter losses，DML）、異味和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量惡化[8]。

呼吸作用已被有效地用于測(cè)量?jī)?chǔ)存商品的代謝活動(dòng)，尤其是谷物[9-14]。呼吸作用是碳水化合物的有氧氧化，由以下方程表示[15]：

這包括商品（谷物、堅(jiān)果）和伴隨微生物的呼吸作用。多年來(lái)，人們一直關(guān)注微生物和商品呼吸對(duì)總呼吸的相關(guān)貢獻(xiàn)。Seitz等[16-17]報(bào)道，在儲(chǔ)存過(guò)程中，真菌對(duì) DML的貢獻(xiàn)增加的速度取決于主要的 m.c.、溫度、籽粒損壞程度和污染商品的葉際表面真菌群落。

最近的研究表明，在一系列商品（谷物、花生）儲(chǔ)存期間CO2產(chǎn)生量的變化，可以有效地用作 DML的指標(biāo)，這可能與潛在的真菌毒素污染有關(guān)[11-12,18-20]。這些研究利用碳水化合物/脂質(zhì)的氧化會(huì)產(chǎn)生 CO2，在溫度×aw相互作用條件下的有氧呼吸速率來(lái)計(jì)算質(zhì)量損失及 DML比例。使用氣相色譜法測(cè)定的呼吸率（R）及其相關(guān)的DML可建立“儲(chǔ)存風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)”，以預(yù)測(cè)儲(chǔ)存的谷物和堅(jiān)果中的整體質(zhì)量變化和真菌毒素污染情況[8,21]。

已發(fā)現(xiàn)0.04%～2%之間的DML能影響種實(shí)質(zhì)量和與歐盟法定最大限值相關(guān)的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)[11-14,17-20]。最近對(duì)儲(chǔ)存在不同m.c.s和溫度下的帶殼花生進(jìn)行的研究量化了呼吸率和 DMLs，并將其與 AFB1污染相關(guān)聯(lián)[20]。這被用來(lái)評(píng)估不同儲(chǔ)存條件的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，這些條件會(huì)影響超過(guò)歐盟法定限制的 AFB1污染水平。盡管榛子是一種重要的食用商品，被廣泛用于烘焙食品、巧克力零食和冰淇淋的各種加工食品鏈，但目前還沒(méi)有對(duì)榛子進(jìn)行類(lèi)似的研究。

本研究的目的是（a）量化呼吸速率，（b）干物質(zhì)損失，（c）AFB1污染包括自然污染的榛子以及儲(chǔ)存之前附加接種黃曲霉毒素的榛子，并首次建立了DMLs與AFB1污染之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

露點(diǎn)/水活度計(jì)AQUALAB 4TE系列：美國(guó)華盛頓，Decagon Instruments；伽馬輻照：12 kGy，英國(guó)斯溫登 Syngergy Health；40 mL 透明玻璃揮發(fā)性有機(jī)物分析（VOA）小瓶：Supelco 23188；免疫親和柱：奧地利圖倫，Romer。

1.2 榛子和水分吸附曲線

生榛子：土耳其馬爾馬拉研究中心TUBITAK MAM。將已知體積的無(wú)菌水（0～2 mL）加入到40 mL玻璃通用瓶中的5 g自然污染帶殼榛子樣品中。將其密封、劇烈搖晃并在4 ℃下儲(chǔ)存過(guò)夜以平衡水分。然后在室溫（T）下平衡樣品，使用露點(diǎn)/水活度計(jì) AQUALAB 4TE系列測(cè)量每個(gè)子樣品的aw值。通過(guò)添加水量（mL）與測(cè)量的aw值作圖確定水吸附曲線。曲線用于確定每組實(shí)驗(yàn)達(dá)到目標(biāo) aw水平所需的確切水量。之后，通過(guò)在105 ℃的烘箱中干燥16 h來(lái)測(cè)定樣品的m.c。

對(duì)于黃曲霉接種實(shí)驗(yàn)，成批榛子（500 g× 4）最初經(jīng)過(guò)伽馬輻照以殺死所有微生物，并儲(chǔ)存在4 ℃的密封袋中直至使用。在此輻射劑量下，堅(jiān)果保留了萌發(fā)能力，但沒(méi)有真菌污染[21]。還為輻照過(guò)的生榛子制作了水分吸附曲線。

1.3 自然污染的帶殼榛子的儲(chǔ)存方式對(duì)干物質(zhì)損失的影響

將自然污染的帶殼榛子樣品（160 g）置于500 mL Duran燒瓶中表面消毒。參照吸濕曲線，添加無(wú)菌水以獲得0.70（對(duì)照）、0.85、0.90和0.95（=5%、10%、12.5%和18% m.c.濕重基）的目標(biāo)aw值，4 ℃下儲(chǔ)存 24 h。每種處理四個(gè)重復(fù)（10 g），置于40 mL透明玻璃揮發(fā)性有機(jī)物分析（VOA）小瓶中，小瓶具可密封PTFE蓋，內(nèi)置硅膠隔墊，以便于稍后從頂空氣體采樣。將相同aw水平的榛子樣品與 2 × 500 mL 甘油/水溶液的燒杯一起放在12-L聚丙烯環(huán)境室中培育，保持與每個(gè)aw處理值相對(duì)應(yīng)的大氣目標(biāo)平衡相對(duì)濕度（ERH）。榛子樣品培育 5 d。

本研究中使用的儲(chǔ)存處理溫度范圍為 15～30 ℃，aw范圍為 0.70～0.95。每 24 h 測(cè)量一次二氧化碳（CO2）產(chǎn)量。采樣方法涉及使用氣相色譜測(cè)量頂部空間中積累的 CO2，如 Mylona &Magan（2011）所述[11]。CO2百分比濃度用于計(jì)算（a）以mg CO2（kg/h）為單位的呼吸（R）速率，（b）儲(chǔ)存 5 d后 CO2的總累積量和（c）總DML[11]。

1.4 測(cè)量接種黃曲霉榛子儲(chǔ)存期間的呼吸活動(dòng)、干物質(zhì)損失和黃曲霉毒素B1污染

從榛子中分離出已知產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株1217，由土耳其TUBITAK MAM友情提供。該菌株在MEA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)5～7 d。黃曲霉孢子懸浮液用作儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)的接種物。用無(wú)菌環(huán)接種，將分生孢子置于 10 mL含有 0.01% Tween 80的無(wú)菌水中。劇烈搖動(dòng)獲得孢子懸浮液。通過(guò)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器用無(wú)菌水稀釋調(diào)節(jié)濃度至 5×107個(gè)孢子/mL。

參照水吸附曲線，用無(wú)菌水將消毒過(guò)罐中的榛子（每批100 g）調(diào)節(jié)至0.85、0.90和0.95 aw（=10%、12.5%和18% m.c.）。實(shí)際添加的水量略少以便添加接種體。在 4 ℃平衡過(guò)夜，處理組25 ℃平衡。然后將 0.2 mL等分的黃曲霉接種體加入榛子處理樣品中，并充分混合。將每個(gè)aw處理的四個(gè)重復(fù)放置在40 mL玻璃瓶中，并再次放入之前所述的環(huán)境室中培育。每個(gè)aw水平的處理和重復(fù)分別在15、20、25和30 ℃下培育。

每24 h，將用于不同處理和重復(fù)的玻璃瓶用含有硅膠隔膜（Supelco 23188）的PTFE蓋密封1 h，然后用頂空注射器采集氣體樣品。氣樣注入GC進(jìn)行 CO2定量。取樣后，取下蓋子，樣品返回到每溫度和aw水平各自的環(huán)境室。每天重復(fù)該程序。

1.5 干物質(zhì)損失計(jì)算

使用前面詳述的碳水化合物/脂質(zhì)的有氧氧化方程。通過(guò)消耗的氧氣與產(chǎn)生的二氧化碳的比率計(jì)算呼吸商，來(lái)確定干物質(zhì)損失（DML）。依方程式，每公斤谷物中 14.7 g CO2相當(dāng)于 1%的DML。計(jì)算了自然污染的榛子和附加接種黃曲霉孢子的榛子的不同儲(chǔ)存處理的DML。

通過(guò)整合呼吸率與時(shí)間數(shù)據(jù)，確定DML百分比（%）與時(shí)間曲線關(guān)系。儲(chǔ)存周期時(shí)間分24 h，每個(gè)周期的CO2量通過(guò)呼吸率計(jì)算。每個(gè)周期的CO2總量為儲(chǔ)存期間產(chǎn)生的 CO2總量，用于計(jì)算DML。

1.6 黃曲霉毒素B1定量

在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，榛子處理組/重復(fù)組在60 ℃下干燥48 h，研磨并在4 ℃下儲(chǔ)存，等待進(jìn)一步分析。將5 g子樣品與10 mL 70%乙醇混合，置于振蕩器上1 h。使用含有10 mL去離子水的注射器過(guò)濾，并將總共 5 mL的濾液加到免疫親和柱上，濾液以3 mL /min的流速通過(guò)柱子。用20 mL去離子水以5 mL/min的流速洗滌柱子，空氣通過(guò)注射器至少3次。結(jié)合到柱子上的黃曲霉毒素用1 mL甲醇以0.5 mL/min的流速洗脫。將黃曲霉毒素收集到Eppendorf小瓶（2.5 mL）中并轉(zhuǎn)移到琥珀色玻璃液相小瓶中。

HPLC分析∶流動(dòng)相由水∶甲醇∶乙腈（6∶3∶2）組成；每升加入 350 mL 4 M 硝酸和 0.120 g溴化鉀。流速為1 mL/min，柱溫為22 ℃。一式三份進(jìn)樣 100 mL的樣品。熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 430 nm。使用 PTFE 管（30 cm）用電化學(xué)產(chǎn)生的溴進(jìn)行柱后衍生，以增強(qiáng)黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度。為此，在色譜柱和熒光檢測(cè)器之間放置了一個(gè)提供100 mA電流的電化學(xué)池。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)。使用Microsoft Office Excel 2007和軟件包STATISTICA 9分析數(shù)據(jù)。平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差已在所有試驗(yàn)中計(jì)算，并在圖中用豎線表示或包含在三維圖例中。

DML和毒素分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析：Shapiro-Wilk，W正態(tài)性檢驗(yàn)用于評(píng)估總DML和毒素?cái)?shù)據(jù)的正態(tài)性，而數(shù)據(jù)內(nèi)方差的同質(zhì)性通過(guò)Levene檢驗(yàn)評(píng)估。對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，以穩(wěn)定方差由Shapiro-Wilk W檢驗(yàn)重新評(píng)估的及其正態(tài)性。通過(guò)單因素和雙因素方差分析（ANOVA）分析正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以確定各因素（aw和溫度）及其相互作用（aw×T）對(duì)變量影響的顯著性。通過(guò)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)等級(jí)分析對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換仍非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。

DML和毒素產(chǎn)生數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性：制作了DML數(shù)據(jù)與黃曲霉毒素 B1的散點(diǎn)圖。Spearman秩和檢驗(yàn)用于確定每種情況下兩個(gè)變量之間相關(guān)性的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然污染的榛子

表1顯示了一系列水分活度（aw）條件對(duì)經(jīng)25和30 ℃下培養(yǎng) 120 h后的自然污染榛子平均呼吸率和總 DML的影響。研究表明，在這兩個(gè)溫度下，呼吸速率和 DML都隨著可用水的增加而增加。值得注意的是，在相對(duì)安全的儲(chǔ)存條件（0.70 aw）下，即使在兩個(gè)溫度下與非常低的相關(guān) DML培育 120 h后，呼吸也很少發(fā)生。在0.85 aw，呼吸速率和 DML都開(kāi)始增加，并在兩溫度下最濕的0.95 aw處理中觀察到最高值。值得注意的是，在最大可用水處理中，溫度增加到30 ℃時(shí)，呼吸速率是25 ℃時(shí)的兩倍多。

表1 在(a) 25和(b) 30 ℃培養(yǎng)120 h后，水分活度和儲(chǔ)存溫度對(duì)自然污染榛子的累積呼吸速率和平均總干物質(zhì)損失（DML ± SE）的影響Table 1 Effect of water activity and temperature of storage on accumulated respiration rates and mean total dry matter losses(DML ±SE) of naturally contaminated hazelnuts after 120 h incubation at (a) 25 and (b) 30 ℃.(a)

2.2 接種黃曲霉的榛子

在不同水分活度×溫度條件下儲(chǔ)存對(duì)呼吸、干物質(zhì)損失和黃曲霉毒素 B1污染的影響。圖1顯示了25 ℃下 aw對(duì)接種了黃曲霉的儲(chǔ)存榛子的平均呼吸率的短時(shí)影響。在0.95 aw時(shí)黃曲霉定殖最為迅速。在15～30 ℃下的數(shù)據(jù)用于計(jì)算接種了額外黃曲霉的榛子的DMLs。圖2顯示了在aw×溫度的相互作用條件下，黃曲霉定殖對(duì)儲(chǔ)存榛子DMLs的影響。無(wú)論儲(chǔ)存溫度如何，15～20 ℃時(shí)的呼吸率都非常低。僅在25和30 ℃以及≥0.90 aw時(shí)才有顯著的DMLs。

圖1 接種黃曲霉在25 ℃和三種不同水分活度下儲(chǔ)存的榛子呼吸時(shí)間變化（SEmax = 80.41）Fig.1 Temporal changes in respiration of stored hazelnuts inoculated with A. flavus and stored at 25 ℃ and three different water activities (SEmax = 80.41)

圖2 與儲(chǔ)存溫度×水分活度相關(guān)的接種黃曲霉的儲(chǔ)存榛子的干物質(zhì)損失（SEmax = 0.9）Fig.2 Dry matter losses of stored hazelnuts inoculated with A. flavus in relation to storage temperature ×water activity (SEmax = 0.9)

圖3顯示了在15～30 ℃下不同aw水平的接種黃曲霉對(duì)榛子 AFB1污染水平的影響。圖中清楚地表明，在 20～30 ℃ 0.90 aw下產(chǎn)生了大量的AFB1，在 0.85 aw時(shí)毒素污染顯著減少。在15～20 ℃時(shí)，在 0.80 和 0.85 aw下沒(méi)有 AFB1產(chǎn)生。在產(chǎn)生 AFB1的地方，其含量均高于歐盟立法限制 5 μg/kg。

圖3 儲(chǔ)存溫度和水分活度對(duì)接種黃曲霉榛子10天后污染的影響Fig.3 Effect of storage temperature and water activity on contamination of hazelnuts inoculated with A. flavus after 10 days

圖4采用了依據(jù) DMLs和 AFB1污染的榛子處理方面的所有數(shù)據(jù)，并檢驗(yàn)了這些數(shù)據(jù)與歐盟立法限制標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性，表明 AFB1和 DMLs之間存在顯著的正相關(guān)。紅色虛線表示置信限。在大約 0.8%～1.0% DML時(shí)，存在超過(guò)歐盟法定限制的重大風(fēng)險(xiǎn)，即堅(jiān)果中AFB1的最大污染。

圖4 黃曲霉毒素B1和干物質(zhì)損失（%）之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation between aflatoxin B1 and Dry Matter Losses (%)

3 討論與結(jié)論

這項(xiàng)研究表明，在不同溫度和可用水條件下儲(chǔ)存的自然污染的土耳其帶殼榛子顯著影響了相對(duì)呼吸速率和產(chǎn)生的CO2總量。CO2產(chǎn)生水平（約775 和 2 600 mg CO2/kg/h）在 25 和 30 ℃的 0.95 aw（=18% m.c.）情況下明顯更高。此前，Garcia-Cela等[20]的研究表明，帶殼花生的最佳呼吸活動(dòng)發(fā)生在 30～35 ℃時(shí)，30 ℃的總累積 CO2水平約為2 080 mg CO2/kg/h，這些堅(jiān)果的脂質(zhì)和堅(jiān)果的呼吸作用都很高，相關(guān)的自然菌群可能會(huì)影響整體呼吸活動(dòng)。在其他谷物商品中，也發(fā)現(xiàn)水稻、糙米和玉米的總呼吸活性在≥0.95 aW時(shí)最佳，尤其是在30～35 ℃接種黃曲霉時(shí)表現(xiàn)明顯[14,19]

總累積CO2用于量化不同儲(chǔ)存條件下的相對(duì)DMLs。在 0.95 aw時(shí)大約 10%發(fā)生在 25～30 ℃。Garcia-Cela等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在 30～35 ℃和0.95 aw時(shí)，殼花生中的 DMLs約為 14%～15%。在玉米上的研究表明，在這些條件下，DML發(fā)生高達(dá)17%。相比之下，水稻和糙米接種黃曲霉時(shí)，DMLs分別為3.5%和20%[19]。未加工的水稻可受到外部保護(hù)層的保護(hù)，與加工過(guò)的糙米相比，減少了真菌的潛在侵入。

在本研究中，在0.95 aw和20～30 ℃下，附加接種黃曲霉能導(dǎo)致最大的呼吸活性和 DMLs。這相當(dāng)于在30 ℃和0.95 aw下質(zhì)量損失約為10%。附加接種并沒(méi)有導(dǎo)致貯藏榛子中的 DML顯著升高。這與小麥、玉米或帶殼花生形成鮮明對(duì)比，他們?cè)诮臃N產(chǎn)毒真菌時(shí)DMLs要高得多[12,14]。

在 20～30 ℃中，AFB1的產(chǎn)量在 0.90 aw時(shí)明顯高于 0.85 或 0.80 aw。這表明，在<0.85 aw時(shí)，產(chǎn)生這種致癌真菌毒素的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，尤其是在 15～20 ℃時(shí)，更是如此。依據(jù) DMLs和 AFB1在不同 aw×溫度條件下產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)繪制的圖，提供了有關(guān)毒素污染超過(guò)法定限制的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的有用信息。圖中清楚地表明，在 0.6%～1%DML下，榛子的污染將超過(guò)推薦的最大污染水平。這說(shuō)明干物質(zhì)的微小損失會(huì)導(dǎo)致 AFB1污染超過(guò)法定限制，從而可能導(dǎo)致此類(lèi)批次可能被拒。

這也表明，儲(chǔ)存的土耳其帶殼榛子由真菌腐敗造成損失的耐受較低，尤其在無(wú)效的干燥方式更是如此。榛子富含脂質(zhì)，從而吸濕性很強(qiáng)。因此，它們通?？梢栽诓珊髢?chǔ)存期間干燥后重新吸收環(huán)境中的水分，從而導(dǎo)致產(chǎn)毒素腐敗真菌的定殖。此前對(duì)谷物的研究發(fā)現(xiàn)，A型和B型單端孢霉烯、玉米赤霉烯酮（小麥）和伏馬毒素水平（玉米）引起的約1%的霉菌毒素污染就超過(guò)了歐盟立法限制[11-14,22]。對(duì)于花生等富含脂肪酸的堅(jiān)果，AFB1超過(guò)法定限制的污染水平為 0.56%[20]。因此，堅(jiān)果的耐受性可能比谷物低得多。如果榛子被有效干燥到安全的水分含量，它可能會(huì)更好，保護(hù)堅(jiān)果肉不被真菌毒素定殖和污染。然而，需要注意的是，堅(jiān)果和外殼之間的內(nèi)部空間有時(shí)可以為嗜干真菌如黃曲霉的生長(zhǎng)提供微環(huán)境，這種情況特別容易在外殼因害蟲(chóng)或在收獲和干燥階段受損時(shí)發(fā)生[23]。巴西堅(jiān)果中就發(fā)現(xiàn)這種情況，從而導(dǎo)致殼堅(jiān)果中的 AFB1污染增加[24]。這些研究信息可以被有效地從風(fēng)險(xiǎn)管理的角度加以利用，為人類(lèi)消費(fèi)或動(dòng)物飼料使用，制定出低、中和高風(fēng)險(xiǎn)的不同分類(lèi)類(lèi)別[13]。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http:// lyspkj.ijournal.cn）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。