丁雯，李文靜，廖海含，張楠，周子穎，牟山琪，唐其柱，夏豪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430000)

心肌纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在心臟間質(zhì)的過度沉積，嚴(yán)重的心肌纖維化會(huì)影響左心室壁的正常功能，導(dǎo)致心臟收縮或舒張功能障礙。盡管心肌纖維化是心肌肥厚、心力衰竭等多種心臟疾病的共同病理特征，但其具體的病理機(jī)制尚未完全明確，目前也未發(fā)現(xiàn)能有效改善心肌纖維化的方法。NADPH氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)廣泛表達(dá)于心血管系統(tǒng)，且與其他在酶促反應(yīng)中附帶產(chǎn)生活性氧類的酶不同，NOX是專職產(chǎn)生活性氧類的酶。在心肌重構(gòu)的病理狀態(tài)下，NOX失調(diào)是心臟氧化應(yīng)激的重要原因之一，而長期的氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致心肌肥厚、心肌纖維化等一系列心臟病理改變。研究表明，NOX在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不容忽視的作用[1-2]。因此，明確NOX對心肌纖維化的調(diào)節(jié)機(jī)制有助于更深入地了解心肌纖維化的病理過程。現(xiàn)通過闡述NOX1、NOX2、NOX4和NOX5在心肌纖維化進(jìn)程中的作用，探討心肌纖維化的病理機(jī)制，以期為心肌纖維化的治療提供新思路。

1 NOX與心肌纖維化的關(guān)系

NOX是一種以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸為電子供體，將氧還原為超氧陰離子和過氧化氫的多亞基跨膜酶。NOX家族由催化亞基(Nox1～5、Duox1、Duox2)、調(diào)節(jié)亞基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及主要結(jié)合配偶體(Rac)組成[3]。NOX的催化亞基由多種不同的基因編碼，根據(jù)催化亞基的不同，NOX分為不同亞型，心血管系統(tǒng)主要表達(dá)的亞型有NOX1、NOX2、NOX4及NOX5，其中NOX1、NOX2、NOX4存在于心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中，而NOX5僅存在于內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中[1]。NOX家族不僅參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管生成及炎癥反應(yīng)等多種生理過程，同時(shí)也參與心肌肥厚、心肌纖維化等病理過程。病理?xiàng)l件下，NOX產(chǎn)生的活性氧類可增加數(shù)倍，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)生物大分子的功能及氧化還原狀態(tài)[2,4]。

心肌細(xì)胞胞外基質(zhì)生成與降解失衡所致的瘢痕組織生成稱為心肌纖維化。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧類參與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及金屬蛋白酶組織抑制物的表達(dá)，過氧化物通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而間接促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[5]。因此，NOX失衡導(dǎo)致的氧化還原狀態(tài)的改變與心肌組織中膠原的沉積密切相關(guān)。根據(jù)纖維化的起因，心肌纖維化可分為修復(fù)性心肌纖維化和反應(yīng)性心肌纖維化，前者主要是缺血所致的心肌細(xì)胞死亡后的修復(fù)反應(yīng)，而后者則是與肥厚型心肌病相關(guān)的間質(zhì)與血管周圍的纖維化[6]。不同起因所致的心肌纖維化中，受氧化還原調(diào)節(jié)的信號(hào)通路也不盡相同，各型NOX則通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、MMP等促纖維化通路參與纖維化進(jìn)程。

2 NOX各亞型在心肌纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制

2.1NOX1在心肌纖維化中的作用機(jī)制 NOX1的主要功能是產(chǎn)生超氧化物，并將其迅速轉(zhuǎn)化為過氧化氫。NOX1可被多種激動(dòng)劑如促炎因子(腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β)、氧化型低密度脂蛋白等激活。此外，血管活性肽、脂多糖、血流剪切力等可上調(diào)血管壁中NOX1的表達(dá)[7-11]。NOX1復(fù)合體由催化亞基Nox1、調(diào)節(jié)亞基(p22phox、p47phox、p67phox)及Rac1構(gòu)成，在外界刺激下，p47phox的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致構(gòu)象改變，使調(diào)節(jié)亞基轉(zhuǎn)位至膜上，從而激活NOX1。生理狀態(tài)下，低水平的NOX1參與血管生成以及細(xì)胞的生長、增殖、遷移、凋亡等多種生理過程[8]。但在炎癥等病理因素刺激下，心血管系統(tǒng)中NOX1的表達(dá)顯著上調(diào)，此時(shí)遠(yuǎn)高于生理水平的NOX1產(chǎn)生過量的超氧化物，加劇心血管系統(tǒng)的病理性重構(gòu)[12]。

在Iwata等[13]的研究中，敲除NOX1基因能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中羥基脯氨酸、纖維粘連蛋白、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等促纖維化因子的升高，減輕心肌纖維化。心肌細(xì)胞以NOX1依賴的旁分泌形式分泌鈣結(jié)合蛋白S100A1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成[13]。在慢性胰腺炎、肝損傷等其他器官疾病中，NOX1也促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的膠原合成[14-16]，在糖尿病腎病中，NOX1表達(dá)的抑制減輕了腎臟纖維化[17]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，NOX1參與了自發(fā)性高血壓中醛固酮介導(dǎo)的血管纖維化[18]。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)能夠激活心肌細(xì)胞中的p47phox亞基，以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[19]，由于調(diào)節(jié)亞基p47phox的活化能夠激活NOX1，故推測NOX1很可能參與了RAAS相關(guān)的心肌纖維化。雖然既往研究揭示了NOX1的促纖維化作用，但NOX1在心肌纖維化中的確切作用尚不明確。根據(jù)NOX1在其他器官纖維化過程中的作用推測，NOX1對心臟成纖維細(xì)胞的作用可能是揭示其在心肌纖維化中確切作用機(jī)制的潛在切入點(diǎn)。

2.2NOX2在心肌纖維化中的作用機(jī)制 NOX2主要在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，生理狀態(tài)下參與血管張力調(diào)節(jié)、免疫防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，并可作為氧感受器。NOX2復(fù)合體由催化亞基Nox2、調(diào)節(jié)亞基(p22phox、p47phox、p67phox、p40phox)以及Rac組成，活化的NOX2主要位于細(xì)胞膜，以產(chǎn)生超氧陰離子為主，Rac與細(xì)胞膜的結(jié)合是NOX2激活的關(guān)鍵步驟[20]。病理狀態(tài)下，上調(diào)的NOX2通過產(chǎn)生過量的活性氧類參與病理性信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以促進(jìn)心肌重構(gòu)。已知的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NOX2的主要刺激因素有G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑(AngⅡ、內(nèi)皮素1)、生長因子、細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子-α)、機(jī)械應(yīng)力、代謝因素(葡萄糖、胰島素)等[3]。

Wang等[21]發(fā)現(xiàn)，與8月齡大鼠相比，30月齡大鼠心臟中的NOX2表達(dá)水平顯著升高，CTGF轉(zhuǎn)錄增加、心肌纖維化面積顯著增大、MMP-2與金屬蛋白酶組織抑制物的表達(dá)失衡，且血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素原、血管緊張素1型受體等RAAS組成因子表達(dá)增加，同時(shí)連續(xù)注射AngⅡ28 d的8月齡大鼠的心肌纖維化改變與30月齡衰老大鼠一致。在Johar等[22]的研究中，皮下注射AngⅡ2周后小鼠心臟表現(xiàn)出NOX2活性增加，間質(zhì)纖維化面積增大，纖維粘連蛋白、前膠原Ⅰ、CTGF、MMP-2等促纖維化因子表達(dá)增強(qiáng)；而在NOX2-/-小鼠的心臟中以上表現(xiàn)卻被抑制，且螺內(nèi)酯通過抑制醛固酮受體間接抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的心臟NOX2活性的增強(qiáng)以及間質(zhì)纖維化面積的增加。以上研究提示，RAAS的激活可以上調(diào)NOX2的表達(dá)，而后者則繼續(xù)促進(jìn)促纖維化因子的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成與降解的失衡，NOX2在RAAS誘導(dǎo)的心肌纖維化中發(fā)揮著重要的推動(dòng)作用。Zhao等[23]在阿霉素誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠表現(xiàn)出心肌纖維化區(qū)域縮小、促纖維化基因如前膠原Ⅲα、TGF-β、CTGF等表達(dá)減少以及MMP-9活性降低。在阿霉素誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激中，Lin等[24]用抗氧化劑黃芪甲苷抑制了心臟中NOX2的表達(dá)，心肌纖維化面積也隨之減少，推測NOX2在阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化中發(fā)揮促進(jìn)作用，抗氧化劑對氧化應(yīng)激的抑制作用可能在一定程度上抑制了NOX2的激活。此外，Yin等[25]還發(fā)現(xiàn)，NOX2可通過活性氧類/p38通路介導(dǎo)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化。綜上，NOX2促進(jìn)了AngⅡ、阿霉素及異丙腎上腺素等多種病理刺激下的心肌纖維化。區(qū)別于動(dòng)物心臟纖維化模型中人為干預(yù)的單一性，人體心臟疾病中心肌纖維化的發(fā)展常受到神經(jīng)體液等多因素的調(diào)控，考慮到NOX2廣泛參與了不同刺激誘導(dǎo)的心肌纖維化并且是多種促纖維化通路的共同下游效應(yīng)物，NOX2有望成為治療心肌纖維化的重要靶點(diǎn)。

Li等[26]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)端非梗死心肌組織中NOX2的激活增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)了心肌梗死后左心室的心肌纖維化進(jìn)程。Looi等[27]發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死模型中，與野生型小鼠相比，NOX2-/-小鼠心肌收縮功能改善，左心室擴(kuò)張、心肌細(xì)胞肥厚、細(xì)胞凋亡、間質(zhì)纖維化明顯減少、MMP-2活性降低。進(jìn)一步研究表明，心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)NOX2小鼠的CTGF、核因子κB、MMP等促纖維化因子表達(dá)增加，間質(zhì)纖維化明顯增加，而內(nèi)皮細(xì)胞特異性過表達(dá)NOX2小鼠與野生型小鼠細(xì)胞的心肌纖維化水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[28]。因此，NOX2對纖維化的促進(jìn)作用有細(xì)胞特異性，與內(nèi)皮細(xì)胞的NOX2相比，心肌細(xì)胞的NOX2在心肌梗死后心肌纖維化等一系列心室重構(gòu)過程中發(fā)揮著重要的作用。在心肌梗死模型中，內(nèi)皮細(xì)胞特異性過表達(dá)NOX2小鼠的心肌纖維化程度與野生型小鼠并無差異；但在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚與纖維化中，內(nèi)皮細(xì)胞特異性過表達(dá)NOX2小鼠心臟卻表現(xiàn)出內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，而這種內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)也促進(jìn)了心肌纖維化進(jìn)程，使心臟在保留收縮功能的同時(shí)發(fā)生了左心室舒張功能障礙[29]。由此可見，NOX2在心肌纖維化中的作用不僅有細(xì)胞特異性，還取決于纖維化的起因，具有通路特異性。作為研究較多的NOX家族亞型，NOX2在心肌纖維化中的作用是目前心肌纖維化研究的熱點(diǎn)之一，也為心肌纖維化的治療提供了重要靶點(diǎn)。

2.3NOX4在心肌纖維化中的作用機(jī)制 NOX4是心血管系統(tǒng)中表達(dá)量最多的NOX家族成員，由催化亞基Nox4與p22phox結(jié)合而成，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜上，其產(chǎn)生的活性氧類以過氧化氫為主。與其他NOX亞型不同，NOX4的激活不需要Rac或其他胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞基的參與，生理狀態(tài)下NOX4在體內(nèi)可以持續(xù)保持低水平的活性，其產(chǎn)生的低水平的活性氧類還可作為第二信使參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、自噬等過程。但在心力衰竭、心臟壓力超負(fù)荷等病理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞線粒體中的NOX4上調(diào)，活性氧類增加，線粒體蛋白被氧化，線粒體功能障礙導(dǎo)致的電子泄漏又導(dǎo)致了活性氧類的增加[30]，所以作為線粒體氧化應(yīng)激的重要來源，NOX4是心臟壓力超負(fù)荷期間氧化應(yīng)激和心功能障礙的關(guān)鍵介質(zhì)。

心臟特異性過表達(dá)NOX4的轉(zhuǎn)基因小鼠在13～14月齡時(shí)表現(xiàn)出左心室功能下降，心臟過氧化物水平升高以及纖維化增加[31]。不同于生理水平NOX4的正常生理功能，高于生理水平的NOX4表現(xiàn)出對衰老心臟纖維化的不利影響。研究表明，多種激動(dòng)劑(如TGF-β、AngⅡ)和細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)(如壓力負(fù)荷、缺氧、心肌缺血)等均可上調(diào)NOX4的表達(dá)，其中TGF-β可在多種類型的細(xì)胞中上調(diào)NOX4的表達(dá)[30,32]。TGF-β促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以誘導(dǎo)心肌纖維化，TGF-β基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的抗心肌纖維化和抗心肌肥厚效應(yīng)[33]。在高血壓大鼠的心臟中，TGF-β的抑制伴隨NOX表達(dá)的下調(diào)與膠原蛋白表達(dá)的減少[34-35]。Cucoranu等[36]的研究證明，在心臟成纖維細(xì)胞中，NOX4產(chǎn)生的活性氧類通過長期促進(jìn)Smad2/3的磷酸化，上調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在心臟特異性過表達(dá)TGF-β的小鼠中，心室成纖維細(xì)胞與心房成纖維細(xì)胞中NOX4表達(dá)量的差異導(dǎo)致了兩者膠原蛋白沉積量的差異[37]。NOX4基因敲除能夠消除TGF-β引起的心臟成纖維細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白與膠原蛋白表達(dá)的增加[38]。Goh等[39]用線粒體靶向抗氧化劑處理經(jīng)TGF-β刺激的心臟成纖維細(xì)胞后，成纖維細(xì)胞的線粒體氧化應(yīng)激明顯改善、NOX4被抑制，同時(shí)細(xì)胞中TGF-β/Smad通路蛋白顯著下調(diào)，并伴隨CTGF和膠原蛋白的減少。綜上，NOX4是TGF-β誘導(dǎo)的心肌纖維化的重要下游效應(yīng)物，而依賴于NOX的氧化還原信號(hào)也可以正反饋的方式調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。雖然這一正反饋調(diào)節(jié)已在腎小管上皮細(xì)胞中得到了證實(shí)[40]，但仍需要進(jìn)一步研究以確認(rèn)在心肌成纖維細(xì)胞中是否也存在同樣的正反饋調(diào)節(jié)。

Zhao等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中，心肌中上調(diào)的NOX4通過激活蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/核因子κB信號(hào)通路推動(dòng)心肌纖維化。在酒精性心肌病大鼠中，腎素受體通過激活心臟成纖維細(xì)胞中的NOX4增加膠原合成，促進(jìn)心臟纖維化與心功能惡化[42]。此外，AngⅡ通過激活NOX4依賴的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞遷移[43]。抑制醛固酮降低NOX4的活性，從而減少過氧化氫誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的遷移與增殖[44]。RAAS中的AngⅡ、腎素受體及醛固酮均可通過NOX4促進(jìn)心肌纖維化。NOX4也是RAAS的下游效應(yīng)物，并在RAAS誘導(dǎo)的心肌纖維化中扮演重要角色，所以對NOX4的干預(yù)極有可能會(huì)對心臟纖維化的發(fā)展產(chǎn)生較大影響。生理狀態(tài)下NOX4持續(xù)激活，如何將心臟中NOX4的激活控制在既不影響生理功能又不加劇纖維化或許是下一步研究的難點(diǎn)。

2.4NOX5在心肌纖維化中的作用機(jī)制 NOX5僅由催化亞基Nox5構(gòu)成，是一種鈣依賴的NOX亞型，主要在血管中表達(dá)，分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等核周細(xì)胞器中。NOX5產(chǎn)生的活性氧類為超氧化物與過氧化氫。生理狀態(tài)下，NOX5可引起的血管收縮[45]，并在多種類型的細(xì)胞中調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NOX5絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化可調(diào)控NOX5對鈣離子的敏感性，多種蛋白激酶(如蛋白激酶C、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2)可影響NOX5的磷酸化，促炎轉(zhuǎn)錄因子(如核因子κB、激活蛋白-1)能夠上調(diào)NOX5的表達(dá)[46]。

在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死以及主動(dòng)脈瘤等疾病中，血管中NOX5的表達(dá)增加[46-48]。在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)NOX5增加了環(huán)氧合酶2的表達(dá)與前列腺素E2的合成，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[49]，心肌細(xì)胞特異性表達(dá)人源NOX5加重了心臟壓力超負(fù)荷小鼠的左心室肥厚、間質(zhì)纖維化和收縮功能障礙[50]。NOX5廣泛參與了心血管系統(tǒng)疾病的病理過程，并很可能促進(jìn)了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟病理性重構(gòu)。此外，NOX5的過表達(dá)能夠促進(jìn)人肝星狀細(xì)胞的增殖與纖維化反應(yīng)[51]，而內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)人源NOX5加重了糖尿病小鼠的腎纖維化[52]。由于心肌纖維化是多種心臟疾病的共同表現(xiàn)，再加上NOX5參與了腎臟與肝臟的纖維化，推測NOX5可能參與了心肌纖維化過程。由于NOX5不同于其他NOX亞型的結(jié)構(gòu)以及鈣依賴特性，可能在心肌纖維化中發(fā)揮與其他NOX亞型不同的作用。但由于嚙齒類動(dòng)物缺乏NOX5的表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的缺乏在一定程度上限制了NOX5的基礎(chǔ)研究，目前尚不清楚NOX5在心肌纖維化中的確切作用。

3 小 結(jié)

作為活性氧類的重要來源，心血管系統(tǒng)中的NOX通過不同的作用機(jī)制促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)程。但也有研究認(rèn)為，在應(yīng)對慢性壓力負(fù)荷的心臟適應(yīng)中，心肌細(xì)胞中的NOX4能夠保留心肌毛細(xì)血管的密度，通過增加血管生成起心臟保護(hù)作用[53-54]。在心臟的缺血再灌注損傷中，NOX2與NOX4可作為心肌適應(yīng)缺氧的生理性感受器，產(chǎn)生低水平的活性氧類，并通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α和過氧化物酶體增殖物激活受體α發(fā)揮心肌保護(hù)作用[55-56]。所以NOX產(chǎn)生的活性氧類既可以促進(jìn)心肌纖維化，在心肌重構(gòu)中表現(xiàn)出不利作用，也可以在心肌的慢性缺氧適應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)作用，而其是否表現(xiàn)出不利作用取決于活性氧類的基礎(chǔ)水平，這可能是臨床上單純使用非特異性抗氧化劑抑制活性氧類治療心肌纖維化結(jié)果不理想的原因之一。作為專職產(chǎn)生活性氧類的酶，NOX調(diào)節(jié)方式的復(fù)雜性為心肌纖維化提供了一種細(xì)胞、組織或通路特異性的潛在治療方式。在未來的研究中，對特定NOX亞型的調(diào)控可能是未來心肌纖維化治療的新方向。