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        免疫膠體金技術(shù)在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

        2021-12-03 07:36:37
        當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2021年24期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        王 劭

        (欽州市靈山縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西 欽州 535400)

        膠體金又被稱為金溶膠,是指在檸檬酸三鈉等還原劑的作用下,將金鹽還原成金后所形成的金顆粒懸液。膠體金具有大小均勻的特點(diǎn),在靜電作用下會(huì)處于穩(wěn)定狀態(tài)。免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物,利用特異性抗原抗體反應(yīng),在光鏡、電鏡下對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。近年來,免疫膠體金技術(shù)在臨床檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文就免疫膠體金技術(shù)在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

        1 免疫膠體金技術(shù)的概述

        1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入到免疫化學(xué)領(lǐng)域。此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)檢測(cè)方法,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)的逐漸成熟,免疫膠體金技術(shù)逐漸得到發(fā)展和完善。目前,免疫膠體金技術(shù)被臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤檢測(cè)、心血管疾病的臨床診斷、免疫系統(tǒng)評(píng)估等領(lǐng)域,并發(fā)揮著重要作用。近年來隨著臨床檢測(cè)技術(shù)的不斷完善與發(fā)展,一些學(xué)者開始嘗試將免疫膠體金技術(shù)與免疫比濁法、斑點(diǎn)滲透法等相結(jié)合,應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作中。將上述幾種檢測(cè)技術(shù)有機(jī)結(jié)合后,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)血藥濃度、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)等涉及復(fù)雜生物活性的半定量或定量檢測(cè),且具有檢出率高、檢測(cè)的速度快等優(yōu)勢(shì)。在采用免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí),不需要使用昂貴的儀器和設(shè)備,且對(duì)檢測(cè)人員工作經(jīng)驗(yàn)的要求不高,這為該技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)[1]。

        2 免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

        2.1 電鏡標(biāo)記技術(shù)

        從免疫膠體金技術(shù)早期的應(yīng)用情況來看,該技術(shù)最早被廣泛應(yīng)用于掃描電子顯微鏡鏡檢中。膠體金顆粒具有高電子密度及球形外觀等特點(diǎn),將其應(yīng)用于掃描電子顯微鏡鏡檢中能夠精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)糞便幽門螺桿菌抗原等物質(zhì)。在檢測(cè)期間,因?yàn)橹苽浞椒ǖ牟煌瑫?huì)導(dǎo)致膠體金顆粒的大小存在差異。通常情況下,膠體金顆粒的直徑為20 ~150 nm,但也有少數(shù)膠體金顆粒的直徑為3 ~19 nm。正是由于膠體金顆粒直徑的不同,在掃描電子顯微鏡鏡檢中應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)才能更好地實(shí)現(xiàn)單標(biāo)記、雙標(biāo)記及多標(biāo)記等功能,并顯示出不同的抗原。有學(xué)者制備了血小板膜糖蛋白,在采用不同粒徑的膠體金對(duì)血小板膜糖蛋白進(jìn)行標(biāo)記后,經(jīng)微波固定的方式有效地將膠體金探針定位到血小板表面及其內(nèi)部的膜糖蛋白上,取得了令人滿意的效果。趙艷秀等[2]認(rèn)為,采用免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行定性檢測(cè)、半定量檢測(cè)與定量檢測(cè)能顯著提高檢測(cè)的效率,具有先進(jìn)性。

        2.2 斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)

        斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)最早出現(xiàn)于20 世紀(jì)80年代,是在固相免疫測(cè)定法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新型檢測(cè)技術(shù)。作為一種初篩的檢測(cè)手段,斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)能滿足多種疾病的臨床檢測(cè)要求。有研究指出,采用斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)進(jìn)行糞便隱血檢測(cè)能提高診斷的靈敏度,且該技術(shù)的抗干擾能力與傳統(tǒng)的鄰甲苯胺法相比更具有優(yōu)勢(shì)[3]。有學(xué)者對(duì)斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)進(jìn)行了橫向比較,分別采用流式微球載體技術(shù)(flow microbeads assay,F(xiàn)MA)、酶聯(lián)免疫吸附法和斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)檢測(cè)血清梅毒抗體,結(jié)果顯示,用這三種技術(shù)檢測(cè)血清梅毒抗體的特異性均為100%,用FMA、酶聯(lián)免疫吸附法、斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)檢測(cè)血清梅毒抗體的靈敏度分別為100%、96%、94%[4]。由此可見,斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)在血清梅毒抗體檢測(cè)中可發(fā)揮重要的作用。該技術(shù)將膠體金作為標(biāo)記物,在不影響蛋白質(zhì)活性的前提下能夠依托其穩(wěn)定的性質(zhì)來完成有效檢測(cè),具有檢測(cè)的速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)。

        2.3 膠體金免疫層析技術(shù)

        免疫層析技術(shù)是一種免疫檢測(cè)技術(shù),其特點(diǎn)是應(yīng)用抗原- 抗體免疫學(xué)反應(yīng)和層析反應(yīng),可快速、準(zhǔn)確地完成相應(yīng)的檢測(cè)工作。早在20 世紀(jì)90 年代,有學(xué)者就在免疫膠體金技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),找到了一種更加便捷、高效的檢測(cè)技術(shù),即膠體金免疫層析技術(shù)。有學(xué)者以膠體金為標(biāo)記物制備赤霉素單克隆抗體- 膠體金偶聯(lián)物,以競(jìng)爭(zhēng)抑制模式制備赤霉素膠體金免疫層析試紙條,用該試紙條對(duì)豆芽中的赤霉素進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,用該試紙條對(duì)豆芽中的赤霉素進(jìn)行檢測(cè)的檢出限為100 μg/kg,靈敏度為98%,特異性為97%,假陰性率為2%,假陽性率為3%[5]。有學(xué)者對(duì)膠體金免疫層析法在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了分析,總結(jié)其優(yōu)勢(shì)為:1)可提高診斷的靈敏性。例如,在采用膠體金免疫層析法對(duì)蛋白A 抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí),樣品在經(jīng)過狹窄的硝酸纖維素膜后能將被檢測(cè)物質(zhì)濃縮,因此可顯著提高檢測(cè)效率和診斷的靈敏性。2)可提高診斷的特異性。在采用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)通常選擇純品為抗原,可提高診斷的特異性。另外,檢測(cè)時(shí)所用膠體金顆粒的直徑越小,檢測(cè)的效果越好[6]。3)具有很好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。4)被膠體金標(biāo)記的樣品在4℃的環(huán)境中可儲(chǔ)存2 年以上,且無信號(hào)衰減的現(xiàn)象。在采用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí),膠體金的穩(wěn)定性是影響最終檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。近年來隨著膠體金制備工藝的逐漸成熟(例如優(yōu)化了膠體金標(biāo)記的最佳條件和膠體金顆粒懸浮的最佳配方等),膠體金的穩(wěn)定性得到了顯著提升。此外,隨著膠體金免疫層析技術(shù)的不斷完善,一些學(xué)者開始將該技術(shù)應(yīng)用于疫情檢測(cè)工作中。梁秋光等[7]利用膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)含鼠疫的45 份陽性血清進(jìn)行檢測(cè),最終的檢測(cè)結(jié)果顯示,這45 份樣品的檢測(cè)結(jié)果均呈陽性。

        3 免疫膠體金技術(shù)在半定量與定量檢測(cè)中的應(yīng)用

        膠體金本身的顏色以粉紅色、紅色為主。通常情況下,采用光學(xué)傳感器或在肉眼下可直接觀察到膠體金顏色的變化,故通過免疫膠體金技術(shù)可實(shí)現(xiàn)半定量及定量檢測(cè)。

        3.1 免疫膠體金技術(shù)在半定量檢測(cè)中的應(yīng)用

        在免疫膠體金技術(shù)出現(xiàn)后不久,就有學(xué)者嘗試采用該技術(shù)進(jìn)行半定量檢測(cè)。采用免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行半定量檢測(cè)的依據(jù)是:硝酸纖維素膜的顯色面積與抗體濃度呈正相關(guān)。有學(xué)者建立了一種伴有質(zhì)控點(diǎn)的免疫金滲濾技術(shù),用于半定量檢測(cè)人尿中的微量白蛋白,結(jié)果證實(shí),用該技術(shù)半定量檢測(cè)人尿中微量白蛋白的結(jié)果可靠,且方便快捷,特別適合中、小醫(yī)院和門診使用[8]。

        3.2 免疫膠體金技術(shù)在定量檢測(cè)中的應(yīng)用

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展帶動(dòng)了免疫膠體金技術(shù)的變革。當(dāng)前,不少醫(yī)院在臨床檢測(cè)工作中開始大面積推廣使用膠體金免疫定量檢測(cè)儀。該儀器的出現(xiàn)進(jìn)一步提高了免疫膠體金技術(shù)的檢出效率,并推動(dòng)了定量檢測(cè)技術(shù)的完善與發(fā)展。采用免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)的原理是:將硝酸纖維素膜上檢測(cè)線的顏色變化及待測(cè)物質(zhì)濃度的線性比例與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比,可獲得最終的定量分析結(jié)果[9]。膠體金試劑條對(duì)于不同物質(zhì)的顯色過程是動(dòng)態(tài)變化的,且試劑條的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)變化。近年來臨床上在采用免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí),為了能夠進(jìn)一步提升檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度,開始嘗試使用一種新的定量檢測(cè)方法,即T/C(檢測(cè)線/ 質(zhì)控線)法。與采用傳統(tǒng)的免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)相比,采用T/C 法進(jìn)行定量檢測(cè)有助于降低溫度、時(shí)間等外部因素對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響[10]。

        4 免疫膠體金技術(shù)與新技術(shù)的結(jié)合

        4.1 免疫膠體金技術(shù)與魯米諾檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合

        魯米諾又叫發(fā)光氨,是一種化學(xué)熒光分子,其被單氧氧化后可發(fā)出藍(lán)光并被肉眼所察覺。魯米諾試劑可以顯現(xiàn)出極微量的血跡形態(tài)(潛血反應(yīng)),故魯米諾檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于刑事偵查、生物工程、化學(xué)示蹤等領(lǐng)域。有學(xué)者在魯米諾探針的基礎(chǔ)上開發(fā)出了具有良好響應(yīng)特性的單探針,經(jīng)魯米諾的還原作用成功制備了雙響應(yīng)魯米諾還原膠體金,最終的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),雙響應(yīng)魯米諾還原膠體金可在靜電相互作用下標(biāo)記抗體[11]。有學(xué)者建立了小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)P停瑢?duì)魯米諾還原膠體金的檢測(cè)價(jià)值進(jìn)行研究,結(jié)果證實(shí),使用魯米諾還原膠體金能夠更快速地完成對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè),且膠體金中的發(fā)光體所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)能夠達(dá)到定量檢測(cè)的要求;化學(xué)發(fā)光信號(hào)的線性范圍為0.1 ~100 ng/mL,檢出限為0.033 ng/mL,與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比檢出限更低;從成本方面來看,應(yīng)用魯米諾還原膠體金時(shí)由于不需要使用復(fù)雜的光學(xué)儀器,故其在價(jià)格上也具有優(yōu)勢(shì)[12-13]。

        4.2 免疫膠體金技術(shù)與表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的結(jié)合

        表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced raman spectra,SERS)與紅外光譜同屬于分子振動(dòng)光譜,可反映分子的特征結(jié)構(gòu)。SERS 技術(shù)具有超敏感性和非破壞性的特點(diǎn),是一種新型的生物檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)的生物檢測(cè)技術(shù)相比,SERS 技術(shù)可為生物檢測(cè)提供全面的“分子指紋”,能夠用于檢測(cè)樣品中的固有信號(hào)。SERS 技術(shù)的檢測(cè)原理是:在應(yīng)用該技術(shù)時(shí),可將待測(cè)分子吸附在粗糙的納米金屬材料表面,使待測(cè)物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)多達(dá)14 個(gè)數(shù)量級(jí),這不僅能完成特定范圍內(nèi)的分子檢測(cè),還能用于單個(gè)根元素的檢測(cè)[14]。針對(duì)該技術(shù)的優(yōu)勢(shì),目前醫(yī)學(xué)界開發(fā)出了一種新型的免疫探針,由拉曼探針分子、新霉素單克隆抗體和雙標(biāo)記膠體金組成。該免疫探針可獲得更強(qiáng)的拉曼信號(hào),能在短時(shí)間內(nèi)完成臨床檢測(cè),且檢出限低至0.285 pg/mL,明顯低于常規(guī)免疫膠體金技術(shù)2.73 ng/mL 的檢出限[15]。

        5 小結(jié)

        在臨床檢測(cè)領(lǐng)域,免疫膠體金技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。免疫膠體金技術(shù)通過與諸多先進(jìn)的臨床檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合,能夠充分滿足復(fù)雜條件下臨床檢測(cè)的需求,這也是未來臨床檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的新方向。

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