王芹 朱瑩 劉卉 胡靜靜

江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院，江蘇 南京 211800

HIV 在全球廣泛流行，到目前為止，已導致3200多萬人死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2018 年底，約有3790 萬艾滋病毒感染者［1］。沒有針對艾滋病毒感染的治愈方法，但通過抗逆轉錄藥物使病毒得到控制是最有效的方法，大部分的HIV 感染者不能接受價格高昂的逆轉錄酶抑制劑，因此尋找高效且毒性較低的新型抗艾滋病毒藥物是目前研究的熱點。

NF1 菌多糖是從NF1 細菌中提取并對其進行硫酸化修飾，分子量20~200kDa。NF1 菌多糖主要由1，3-脫水葡萄糖、少量低聚糖和其他糖類組成。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖、冬蟲夏草多糖、豬岑多糖、板藍根多糖等具有多種生物活性，比如增強免疫功能、抗腫瘤、抗凝血等［2］。但是很少報道關于從細菌中提取的多糖對HIV的抑制作用。本研究采用NF1 菌多糖進行體外抗HIV-1 活性試驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（Costar 公司和Graner公司），超凈工作臺（LABCONCO 公司），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司），倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器有限公司），超速冷凍離心機（5804R，Eppendorf 公司），超低溫冰箱（Thermo 公司），電熱恒溫水浴箱（HH-4，江蘇金壇市榮華儀器廠），精密電子天平（BS124S，Sartorius 公司），96 孔酶標板（2897，Corning 公司），酶標定量測定儀（SYNERGYHT，Bio-TeK 公司）。

1.2 主要試劑 裂解液和熒光素酶檢測試劑盒（Promega 公司），DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清（GIBCO 公司），PEI 轉染試劑，DEAE-dextran，MTT（Sigma 公司）。

1.3 細胞及病毒質粒 Env 質粒和PNL4-3 質粒，293T細胞、GHOST 細胞以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 對GHOST 細胞的毒性作用。采用MTT 法，在96孔板的每個孔加入1.0×105/mL 的GHOST 細胞懸液100μL，與不同濃度（10000μg/mL、2000μg/mL、400μg/mL、80μg/mL、16μg/mL 及 3.2μg/mL）的 NF1 菌多糖溶液混合，設6 個重復孔，同時設置不含藥物的對照孔，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱培育48h，采用MTT 比色法檢測細胞毒性。酶標儀檢測470nm 吸光值，計算細胞生長抑制率。

1.4.2 體外抗HIV-1 活性檢測。用已報道的PNL4-3 質粒和 Env 質粒共轉染 293T 細胞產(chǎn)生 Env 假病毒［3］，并對病毒液進行病毒滴度的測定［4］。假病毒感染GHOST 細胞導致熒光素酶的表達，且熒光素酶的活性與感染的病毒數(shù)量成正比，可通過檢測熒光值來確定病毒感染數(shù)量，檢測NF1 菌多糖對 R5 型毒株 JR-FL 和 X4 型毒株 HXB-2 的抑制作用，步驟如下：在96 孔板的每個孔中加入100μL不同濃度的用DMEM 培養(yǎng)基稀釋的NF1 菌多糖，每個濃度重復4 個孔，每孔加入200TCID50 的病毒液50μL，加入 100μL 含 DEAE 的 105/mL 的 GHOST 細胞懸液，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL裂解液，測熒光值，計算病毒抑制率。治療指數(shù)（T1）＝半數(shù)細胞毒性濃度（CC50）/半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.3 時間遞加分析試驗。為了進一步驗證NF1 菌多糖是在病毒入胞前還是入胞后起作用，用HIV 的入胞抑制劑Dextran sulfate，逆轉錄酶抑制劑nevirapine 和AZT 作為對照藥物，利用對病毒起作用的時間不同來檢測［5］。GHOST 細胞按 104/孔接種于 96 孔板，37℃培養(yǎng)過夜。更換新鮮培養(yǎng)基后，每孔加入26.7μg/mL 的NF1 菌多糖，同時加入陽性對照藥物0.5μg/mL 的AZT，100μg/mL 的 Dextran sulfate，2ug/mL 的 nevirapine和標準對照同等體積的培養(yǎng)基。各孔加入JR-FL 病毒液，依次在 1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h、24h 加入NF1 菌多糖，AZT，Dextran sulfate，nevirapine，新鮮培養(yǎng)基，每組設4 個復孔。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h 后檢測熒光值，計算病毒抑制率，繪制不同藥物各個時間點的病毒抑制曲線。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，實驗結果數(shù)據(jù)以表示，多組均數(shù)比較采用ANOVA 方法，組間兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NF1 菌多糖對GHOST 細胞毒性作用 NF1 菌多糖低濃度時對GHOST 細胞的毒性作用較小，NF1 菌多糖濃度為50μg/mL 時，對細胞沒有明顯的毒性作用（P>0.05），CC50約為 760μg/mL。見表 1。

表1 NF1 菌多糖對GHOST 細胞毒性

2.2 NF1 菌多糖抗HIV-1 假病毒活性 在GHOST 細胞上檢測了NF1 菌多糖對R5 毒株JR-FL 和X4 型毒株HXB-2 的抑制作用，隨著NF1 菌多糖濃度的增大，對HIV-1 的抑制作用越明顯，NF1 菌多糖抑制JR-FL毒 株的 IC50為 4.67μg/mL， 抑 制 HXB-2 的 IC50為6.75μg/mL。見表 2。

表2 NF1 菌多糖對HIV-1 假病毒毒株的抑制作用（μg/mL）

2.3 時間遞加分析試驗 非核苷類逆轉錄酶抑制劑nevirapine 和核苷類逆轉錄酶抑制劑AZT 具有極為相似的曲線，而NF1 菌多糖和入胞抑制劑Dextran sulfate具有很相似的趨勢。在病毒感染2h 后，已經(jīng)有部分病毒不能被NF1 菌多糖和Dextran sulfate 阻止，在病毒感染5h 以后，加入NF1 菌多糖和Dextran sulfate，基本能夠抑制60%的病毒，而兩種逆轉錄酶抑制劑可以抑制病毒感染一直到8h。因此，NF1 菌多糖和Dextran sulfate 一樣都是入胞抑制劑。見圖1。

圖1 時間遞加分析實驗

3 討論

艾滋病嚴重威脅著人類健康，每年有上百萬患者死于與艾滋病相關的疾病。高效聯(lián)合抗逆轉錄病毒（HARRT）雖然極大的延長了患者的壽命，但其不能徹底從患者體內(nèi)清除HIV 病毒，而且其價格昂貴，隨著耐多藥的HIV 的出現(xiàn)，使得研發(fā)新型的抗HIV 藥物勢在必行［6］。本研究采用了MTT 法檢測NF1 菌多糖對細胞的毒性，采用了假病毒系統(tǒng)測試了NF1 菌多糖對HIV-1 的抑制作用，通過檢測GHOST 細胞熒光素酶的表達水平，來評價病毒的感染情況，進而評價藥物抗病毒效果，該系統(tǒng)檢測結果穩(wěn)定，可重復性好［7］。

通過本試驗研究，MTT 法檢測NF1 菌多糖對GHOST 的毒性，CC50為 760μg/mL，在 NF1 菌多糖濃度為26.7μg/mL 時，已經(jīng)能夠抑制90%以上的R5 毒株JR-FL；濃度為29.5μg/mL 時，已能夠抑制90%以上的X4 毒株HXB-2，而GHOST 細胞有80%以上的存活率，表明NF1 菌多糖對HIV-1 的抑制作用不是由于對GHOST的毒性引起的，說明NF1 菌多糖對HIV-1 有較好的抑制作用。其對GHOST 細胞的毒性，CC50約為 760μg/mL，抑制JR-FL 毒株的 IC50為4.67μg/mL，T1為 162.7；抑制 HXB-2 毒株的 IC50為 6.75μg/mL，T1為 112.6。這個結果表明，NF1 菌多糖對細胞毒性小，抗HIV-1 的活性明顯。為了進一步研究NF1 菌多糖體外抗HIV-1 的潛在靶點，我們進行了時間點加藥實驗，結果顯示，NF1 菌多糖為一種入胞抑制劑，作用于HIV 感染的早期。

綜上所述，本研究表明NF1 菌多糖具有體外抗HIV-1 的活性，其潛在的作用靶點是在HIV 感染的早期，而且NF1 菌多糖水溶性很好，具有潛在的開發(fā)利用價值。