梁 偉,朱亞同,孔 蕊,柴秀偉,謝鵬東,畢 陽,*,Dov PRUSKY
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.農(nóng)業(yè)研究組織新鮮農(nóng)產(chǎn)品采后科學部,以色列 里雄萊錫安 7505101)
南瓜是重要的園藝作物,在世界范圍內(nèi)種植廣泛,據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計,2020年全球南瓜產(chǎn)量超過2 000萬 t,其中我國南瓜產(chǎn)量約占50%[1]。依據(jù)植物學性狀南瓜可劃分為中國南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(C. maxima)和美洲南瓜(C. pepo)[2],其果肉富含胡蘿卜素、維生素、氨基酸和碳水化合物[3],果皮富含果膠、纖維素和有機酸[4],是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)來源。雖然南瓜表皮堅硬,但采后遭受機械損傷后易發(fā)生腐爛[5-6]。前期觀察發(fā)現(xiàn),損傷深淺造成的南瓜腐爛程度不一,淺層或僅傷及果皮的損傷可有效修復(fù)愈合,但傷及果肉的深度損傷愈合速度緩慢,會導致腐爛的發(fā)生。因此,有必要去探究淺層和深層損傷之間存在的差異。苯丙烷代謝在愈傷過程中具有重要作用,不僅為聚酚軟木脂(suberin poly phenolic,SPP)和木質(zhì)素的合成提供底物,還能合成酚類等抑菌物質(zhì)[7]。研究發(fā)現(xiàn),果實不同部位的苯丙烷代謝存在很大差異,甜瓜果皮較果肉具有較高的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)和4-香豆酰-輔酶A連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)活力[8];梨果皮的PAL、4CL、肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)和過氧化物酶(peroxidase,POD)活力也顯著高于果肉[9];與果肉相比,柑橘果皮中PAL、C4H和CAD的表達量更高[10]。此外,桃[11]、番荔枝[12]和菠蘿蜜[13]果皮中的肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、總酚和類黃酮等苯丙烷代謝產(chǎn)物的含量均顯著高于果肉。盡管已有果皮與果肉苯丙烷代謝差異的報道,但有關(guān)南瓜果實愈傷期間果皮和果肉苯丙烷代謝及愈傷組織形成差異的研究尚鮮見報道。本研究通過對人工模擬損傷的南瓜果實在室溫黑暗條件下愈傷,分析愈傷期間果皮和果肉苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力,中間和最終產(chǎn)物含量以及H2O2含量和過氧化物酶活力變化,觀察果皮和果肉中SPP和木質(zhì)素的積累情況,比較南瓜果皮和果肉苯丙烷代謝活力和愈傷組織積累的差異,探究南瓜果實損傷后果皮和果肉愈傷組織形成的現(xiàn)象和相關(guān)機理,比較表皮和果肉的不同程度損傷對傷口愈合能力的影響,以期為南瓜采后處理提供科學依據(jù)。
‘貝貝’南瓜果實(Cucurbita maximavar.Bocchan)于2020年8月購自甘肅省蘭州市榆中縣康源現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司。
HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-30085H-II型恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DFT-50研樣機 上海谷寧儀器有限公司;CX21FSIC光學顯微鏡、CX21FS1C型正置萬能顯微鏡 日本Olympus公司;UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司;H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀設(shè)備檢測有限公司;1510型酶標儀 美國賽默飛世爾儀器有限公司;Ci6x分光光度儀日本愛色麗有限公司;CentriVap真空離心濃縮儀 美國Labconco公司;ACQUITY Arc四元梯度超快速液相色譜儀 美國Waters公司。
1.3.1 南瓜果實的人工損傷和取樣
選取外觀一致,成熟度相近,大小均勻,平均質(zhì)量為(300±50)g,無可見病害和機械損傷的南瓜果實,用泡沫箱包裝(50 個/箱),于次日運抵甘肅農(nóng)業(yè)大學采后生物與技術(shù)實驗室,在冷庫(溫度(4±2)℃、相對濕度55%~65%)中貯藏待用。
南瓜果實的損傷處理參照Wang Bin等[14]的方法并略作修改,果實用清水溫和洗滌3 次去泥土,再用體積分數(shù)1%的次氯酸鈉浸泡3 min進行消毒處理,用無菌水沖洗干凈,晾干后用無菌刮皮刀模擬損傷,沿著果實赤道部位刮出半徑2.0 cm、深度0.5 mm的圓形傷口(外圈損傷較淺為果皮部分,內(nèi)圈損傷較深為果肉部分)。待水分晾干后單果套發(fā)泡網(wǎng)袋,室溫(22±2)℃、相對濕度55%~60%的黑暗條件下愈傷。分別于愈傷第0、1、3、5、7天時取果皮和果肉愈傷組織及愈傷組織下3 mm厚的樣品(每個南瓜果實果皮、果肉取樣質(zhì)量分別約為2 g和3 g,每次取樣質(zhì)量不少于80 g),用液氮速凍樣品后采用DFT-50研樣機研磨成粉狀顆粒后裝入50 mL離心管,保存于-80 ℃超低溫冰箱。
1.3.2 苯丙烷代謝相關(guān)酶活力的測定
PAL活力的測定參照Kozukue等[15]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,于3 mL pH 8.8硼酸緩沖液(含40 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),2 mmol/L乙二胺四乙酸)、5 mmol/Lβ-巰基乙醇)中混合后靜置提取1 h,4 ℃、10 000×g下離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系:3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液,0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸,37 ℃水浴10 min,加入0.5 mL粗酶液,混合后迅速測定290 nm波長處的光密度值作為初始值(OD0),將混合液在37 ℃水浴鍋中保溫1 h后在290 nm波長處的OD值作為終止值(OD1),以硼酸緩沖液作為對照。以每小時OD值變化0.01為一個酶活力單位(U),酶活力以U/gmf表示。
C4H活力的測定參照文獻[16]并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,于3 mL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8,含40 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)、10 mmol/Lβ-巰基乙醇、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L抗壞血酸、2 μmol/L NADPNa2、10 μmol/L亮抑酶肽、1 mmol/L苯甲磺酰氟化物和體積分數(shù)10%的甘油)中混合后靜置提取1 h,在4 ℃、10 000×g條件下離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系:1.0 mL粗酶液,5 mL 50 mmol/L、pH 8.8 Tris-HCl緩沖液,25 ℃孵育30min,添加100 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng),測定340 nm波長處的OD值,以1 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.8)作為對照。以每小時OD值變化0.01為1 個酶活力單位(U),酶活力以U/gmf表示。
4CL活力的測定參照文獻[17]并作適當修改。 稱取1.0 g冷凍粉末,加入3 mL上海源葉生物科技有限公司的提取液,然后于4 ℃,10 000×g條件下離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系:0.45 mL 7.5 μmol/L Mg2+(硫酸鎂或氯化鎂),0.15 mL 50 nmol/mLp-香豆酸,0.15 mL 2.5 μmol/mL ATP,0.15 mL 38 nmol/mL CoA以及0.5 mL酶液。40 ℃下反應(yīng)10 min后,立即在333 nm波長處測定OD值。以每分鐘OD值變化0.001為1 個酶活力單位(U),酶活力以U/gmf表示。
CAD活力的測定參照Goffner等[18]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,于3 mL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8,含40 g/L PVP、15 mmol/Lβ-巰基乙醇、體積分數(shù)10%偏聚乙二烯和體積分數(shù)2%聚乙二醇)中混勻提取1 h,在4 ℃、10 000×g條件下離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系:0.2 mL酶提取液,0.8 mL反應(yīng)液(含10 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP),5 moml/L反式肉桂酸),37 ℃水浴30 min,0.1 mL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)(如有沉淀離心除去)后在400 nm波長處測OD值,以0.2 mL 1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)與0.8 mL反應(yīng)液作為對照。以每分鐘OD值變化0.001為1 個酶活力單位(U),酶活力以U/gmf表示。
POD活力的測定參照Venisse等[19]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,加入3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(含1 mmol/L聚乙二醇,質(zhì)量分數(shù)1% Triton X-100和質(zhì)量分數(shù)4%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮,pH 5.5)混勻充分提取,4 ℃ 10 000×g條件下離心30 min,上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系:3.0 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚,500 μL粗酶液,300 μL 5 mmol/L H2O2。以蒸餾水作為對照,記錄混合反應(yīng)體系在470 nm波長處15 s~2 min的OD值。以每分鐘OD值變化1為1 個酶活力單位(U),酶活力以U/gmf表示。
1.3.3 肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和p-香豆醇、松柏醇、芥子醇含量的測定
參照Ayaz等[20]方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,加入3 mL 70%(體積分數(shù))甲醇溶液在40 Hz常溫超聲提取30 min,8 000×g離心20 min,上清液經(jīng)CentriVap真空離心濃縮儀濃縮后,用溶液(甲醇、水、冰醋酸體積比為70∶30∶1)復(fù)溶至1 mL,過0.22 μm微孔濾膜,將濾液轉(zhuǎn)移至2 mL自動進樣瓶中。采用Waters Symmetry?C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行四元梯度超快速液相色譜儀分析。色譜條件:以100%甲醇(A)和1%乙酸(B)為流動相。按0~10 min:30% A、70% B;10~12 min:45% A、55% B;12~15 min:65% A、35% B;15~18 min:30% A、70% B;18~20 min:30% A、70% B;18~20 min:30% A、70% B進行梯度洗脫,流速0.8 mL/min,進樣量5 μL。芥子酸和咖啡酸在325 nm波長處檢測,阿魏酸在322 nm波長處檢測,對香豆酸在310 nm波長處檢測,肉桂酸在276 nm波長處檢測,松柏醇在263 nm波長處檢測,p-香豆醇在273 nm波長處檢測,芥子醇在322 nm波長處檢測。通過對比標準化合物的保留時間來對其進行定性。通過內(nèi)標法對樣品峰面積進行定量,酚酸含量以μg/gmf表示。各酚酸標準曲線方程為:肉桂酸:y=57 736x-87 455,R2=0.999 1;對香豆酸:y=5 302.3x-10 503,R2=0.998 9;咖啡酸:y=51 891x-99 316,R2=0.998 7;阿魏酸:y=29 640x-51 025,R2=0.998 9;芥子酸:y=32 847x-52 047,R2=0.999 3;p-香豆醇:y=9 754.1x-19 764,R2=0.999 1;松柏醇:y=26 401x-51 211,R2=0.998 6;芥子醇:y=893.5x-17 488,R2=0.999 2。
1.3.4 總酚和木質(zhì)素水平的測定
總酚含量測定參照Scalbert等[21]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,加入3 mL 0.5%乙酸和70%丙酮進行提取,將混合液于4 ℃黑暗環(huán)境下放置24 h,4 ℃、8 000×g離心30 min,收集上清液用于總酚的測定。測定體系:1 mL提取液、2 mL福林-酚稀釋液(蒸餾水,體積比1∶10稀釋)、2 mL質(zhì)量分數(shù)7.5 % Na2CO3、50 ℃靜置5 min,以甲醇作為參比空白,測定760 nm波長處吸光度。根據(jù)沒食子酸標準曲線方程計算總酚含量(y=0.017x-0.077,R2=0.996),結(jié)果以每100 g樣品所含沒食子酸質(zhì)量計,單位mg/100 gmf。
木質(zhì)素水平測定參照Morrisson[22]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,加入3 mL預(yù)冷的95%的乙醇溶液后離心,取沉淀物依次用95%乙醇溶液、乙醇-正己烷(1∶2,V/V)各沖洗3 次后置于烘箱中干燥,干燥物加入1 mL質(zhì)量分數(shù)25%溴化乙酰-冰醋酸溶液,70 ℃恒溫水浴 30 min,加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L的羥胺鹽酸后離心取上清液0.5 mL,冰醋酸定容至5 mL,280 nm波長處測定OD值。木質(zhì)素水平用每克樣品的OD280nm表示。
1.3.5 H2O2含量的測定
H2O2含量的測定參考Prochazkova等[23]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末,加入丙酮后提取10 min,4 ℃離心30 min取上清液用于含量測定。反應(yīng)體系:1 mL上清液、100 μL 20%(質(zhì)量分數(shù))TiCl4、100 μL質(zhì)量分數(shù)20%濃氨水,混合液反應(yīng)10 min后,離心10 min,取沉淀用丙酮洗滌3 次,加2.0 mL 1 mol/L H2SO4溶液進行溶解,測定410 nm波長處的OD值,通過H2O2標準曲線(y=0.748 8x+0.006,R2=0.997)計算H2O2含量,單位為μmol/gmf。
1.3.6 聚酚軟木脂及木質(zhì)素沉積情況觀察
SPP的沉積情況觀察參照Lulai等[24]的方法并作適當修改。用不銹鋼雙面刀片垂直于果皮和果肉傷口表面切出厚度0.2~0.3 mm左右的薄片。將切片置于載玻片上,滴加蒸餾水并蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察拍照,激發(fā)波長340~390 nm,接收波長420 nm。
木質(zhì)素的沉積觀察參照文獻[25]并作適當修改。在垂直于果皮和果肉傷口表面切出0.2~0.3 mm的薄片,蒸餾水沖洗8 次,置于載玻片上滴加質(zhì)量分數(shù)1%間苯三酚溶液及濃鹽酸染色1 min,在光學顯微鏡下拍照觀察。
果皮和果肉的SPP和木質(zhì)化細胞層的厚度參照van Oirschot等[26]的方法,光學顯微鏡下觀察拍照后通過IS Capture軟件測定。
上述測定至少重復(fù)3 次。全部數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件處理,實驗結(jié)果用平均值±標準誤表示,通過SPSS 24.0軟件中的Duncan檢驗進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。
肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸是構(gòu)成愈傷組織主要成分SPP的重要單體。愈傷期間,果皮和果肉中的肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸和總酚含量隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的含量顯著高于果肉,第7天時分別高出果肉29.17%、10.25%、28.76%和17.22%(P<0.05)(圖1A、C、D、F)。果皮和果肉的p-香豆酸和芥子酸含量呈單峰型變化,果皮的含量顯著高于果肉,第5天時達到峰值,分別高出果肉24.76%和14.15%(P<0.05)(圖1B、E)。上述結(jié)果表明,愈傷期間,南瓜果皮的肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸以及總酚的合成速率和積累量顯著高于果肉。
圖1 愈傷期間南瓜果皮和果肉肉桂酸(A)、p-對香豆酸(B)、咖啡酸(C)、阿魏酸(D)、芥子酸(E)和總酚(F)含量的變化Fig. 1 Changes in contents of cinnamic acid (A), p-coumaric acid (B),caffeic acid (C), ferulic acid (D), sinapic acid (E) and total phenolics (F) in pumpkin peel and pulp during wound healing
肉桂醇、松柏醇和芥子醇是構(gòu)成愈傷組織主要成分木質(zhì)素的3 種重要單體。愈傷期間,果皮和果肉中的p-香豆醇含量在愈傷前期趨于穩(wěn)定,第5天時迅速上升,果皮中含量顯著高于果肉,第7天時果皮中含量高出果肉20.81%(P<0.05)(圖2A)。果皮和果肉的松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素水平隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的含量顯著高于果肉,第7天時分別高出果肉35.35%、22.47%和32.83%(P<0.05)(圖2B~D)。上述結(jié)果表明,愈傷期間南瓜果皮的p-香豆醇、松柏醇、芥子醇以及木質(zhì)素的合成速率和積累量顯著高于果肉。
圖2 愈傷期間南瓜果皮和果肉p-香豆醇(A)、松柏醇(B)、芥子醇(C)含量和木質(zhì)素水平(D)的變化Fig. 2 Changes in contents of p-coumaroyl alcohol (A), coniferyl alcohol (B), sinapis alcohol (C) and levels of lignin (D) in pumpkin peel and pulp during wound healing
SPP和木質(zhì)素是愈傷組織的重要成分。愈傷期間,果皮和果肉的SPP的積累速度和積累量均逐漸增加,果皮和果肉的積累差異出現(xiàn)在第3天,之后果皮的積累速度和積累量始終高于果肉(圖3A)。同樣,果皮和果肉的SPP細胞層厚度隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的細胞層厚度在愈傷期間始終顯著高于果肉(P<0.05),第7天時高出果肉17.55%(圖3C)。愈傷期間,果皮和果肉的木質(zhì)素積累速度和積累量均逐漸增加,果皮和果肉的積累差異出現(xiàn)在第3天,之后,果皮積累速度和積累量均高于果肉(圖3B)。同樣,果皮和果肉的木質(zhì)素細胞層厚度隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的細胞層厚度在愈傷期間始終顯著高于果肉(P<0.05),第7天時高出果肉24.37%(圖3D)。上述結(jié)果表明,愈傷期間,果皮較果肉具有更快的SPP和木質(zhì)素積累速率和更高的積累量。
圖3 愈傷期間南瓜果皮和果肉的SPP(A)和木質(zhì)素積累(B)以及SPP(C)和木質(zhì)素(D)細胞層厚度的變化Fig. 3 Changes in SPP (A) and lignin (B) accumulation and thickness of SPP (C) and lignin (D) cell layers in pumpkin peel and pulp during wound healing
苯丙烷代謝關(guān)鍵酶的活力對酚類物質(zhì)的合成具有重要作用。愈傷期間,果皮和果肉的PAL和C4H活力均呈單峰型變化,果皮的活力始終高于果肉,在第5天和第3天時分別達到峰值,分別高出果肉24.71%和31.76%(P<0.05)(圖4A、B)。果皮和果肉的4CL和CAD活力隨愈傷時間的延長總體不斷增加,果皮的活力顯著高于果肉,第5天和第7天分別出現(xiàn)峰值,分別高出果肉21.65%和20.62%(P<0.05)(圖4C、D)。上述結(jié)果表明,愈傷期間南瓜果皮比果肉具有更高的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力。
圖4 愈傷期間南瓜果皮和果肉PAL(A)、C4H(B)、4CL(C)和CAD(D)活力的變化Fig. 4 Changes in activities of PAL (A), C4H (B), 4CL (C) and CAD (D)in pumpkin peel and pulp during wound healing
H2O2含量和POD活力在一定程度上反映了SPP和木質(zhì)素單體的聚合水平。愈傷期間,果皮和果肉的H2O2含量隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的H2O2含量始終顯著高于果肉(P<0.05),第7天時果皮的H2O2含量高出果肉32.75%(P<0.05)(圖5A)。果皮和果肉的POD活力隨愈傷時間的延長不斷增加,果皮的POD活力始終顯著高于果肉(P<0.05),第7天時果皮的POD活力高出果肉39.93%(圖5B)。上述結(jié)果表明,愈傷期間南瓜果皮比果肉具有更高的H2O2含量和POD活力。
圖5 愈傷期間南瓜果皮和果肉H2O2含量(A)和POD活力(B)的變化Fig. 5 Changes in H2O2 content (A) and POD activity (B) in pumpkin peel and pulp during wound healing
苯丙烷代謝既為SPP和木質(zhì)素提供所需的底物,也可產(chǎn)生具有抗菌活性的酚類物質(zhì)[7]。PAL作為苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶,催化L-苯丙氨酸脫氨基生成反式肉桂酸[27],反式肉桂酸在C4H作用下羥基化生成p-香豆酸,p-香豆酸在香豆酸-3-羥基化酶作用下經(jīng)過羥基化和酯化生成咖啡酸,咖啡酸經(jīng)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶生成阿魏酸,阿魏酸首先羥化生成5-羥基阿魏酸,接著在5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶作用下催化生成芥子酸,這些酚酸是SPP合成的重要單體[28-29]。生成的酚酸在4CL的催化下分別生成肉桂酸-CoA、香豆酸-CoA、咖啡酸-CoA、阿魏酸-CoA和芥子酸-CoA,這些酚酸-CoA在CCR的催化下分別形成芥子醛、松柏醛和香豆醛,又經(jīng)CAD作用轉(zhuǎn)化形成p-香豆醇、松柏醇、芥子醇和香豆醇等木質(zhì)素合成的底物,然后在POD和漆酶催化下分別形成對-羥基苯基木質(zhì)素、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素和紫丁香基木質(zhì)素[30-31]。本研究中,愈傷期間果皮較果肉具有更高的PAL、C4H、4CL和CAD活力(圖4),該結(jié)果與在甜瓜果實中觀察到的類似[8]。此外,愈傷期間果皮中的肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和總酚(圖1)以及p-香豆醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素(圖2)含量高于果肉,該結(jié)果與在西瓜果實中觀察到的結(jié)果類似[32]。代謝組學分析表明,香蕉果皮中莽草酸、苯丙氨酸和阿魏酸等物質(zhì)的豐度顯著高于果肉[33],莽草酸是苯丙氨酸的合成前體,苯丙氨酸是苯丙烷代謝的底物,阿魏酸又是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)[34-35]。有報道表明,柑橘果皮的脫落酸水平顯著高于果肉[36],而脫落酸在激素水平上對馬鈴薯塊莖愈傷具有促進作用[37]。柑橘的轉(zhuǎn)錄因子CsMYBF1在果皮中高表達,參與了酚類物質(zhì)的合成[38]。酚類物質(zhì)合成集中于果皮的主要原因是酚類物質(zhì)積極參與了對外界病原菌侵染和紫外輻射的抵御[39]。因此,南瓜果皮可能是由于具有較高的脫落酸和轉(zhuǎn)錄因子水平,激活了苯丙烷代謝關(guān)鍵酶基因,從而促進了更多的酚類物質(zhì)合成。
SPP和木質(zhì)素是果實傷口處愈傷組織的主要成分[14]。SPP主要由羥基肉桂酸及其衍生物阿魏酸通過酯鍵和醚鍵連接形成[40],具有減少水分蒸騰,抑制病原菌侵染的功能[41]。木質(zhì)素主要由肉桂醇、松柏醇和芥子醇聚合形成,具有強化細胞壁,增加機械強度,維持植物細胞壁結(jié)構(gòu)完整性,形成物理屏障抑制病原菌的侵染和擴展的功能[42]。H2O2和POD在SPP和木質(zhì)素單體聚合過程中具有重要作用[43-44]。H2O2在愈傷中具有雙重作用,既可作為信號分子激活防衛(wèi)反應(yīng),也可作為氫供體參與木質(zhì)素單體與芳香結(jié)構(gòu)域的氧化交聯(lián)[45]。H2O2主要來源于NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX),NOX通過轉(zhuǎn)移電子產(chǎn)生超氧陰離子,后者由于存活時間很短,很快在超氧化物歧化酶的作用下被歧化成H2O2[46]。本研究中愈傷期間果皮H2O2的積累量要顯著高于果肉(P<0.05)(圖5A),該結(jié)果與在甜瓜和葡萄果實中觀察到的類似[47-48]。由于南瓜果皮中Ca2+含量顯著高于果肉[49],而鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPK)能夠感知Ca2+濃度并與其結(jié)合而被激活,CDPK再通過磷酸化下游的NOX,導致超氧陰離子的產(chǎn)生[46]。有研究發(fā)現(xiàn),甜瓜和蘋果果皮中的SOD活力和轉(zhuǎn)錄水平均高于果肉,表明果皮具有更強的超氧陰離子歧化能力[47,50]。因此南瓜果皮中較高濃度的Ca2+可能參與了H2O2生成。作為重要的氧化還原酶,POD被損傷所顯著誘導[41]。該酶一方面參與了木質(zhì)素單體的氧化聚合[51],另一方面又可產(chǎn)生大量H2O2,直接抑制病原菌的侵染[52]。本研究中愈傷期間果皮的POD活力高于果肉(圖5B),該結(jié)果與在甜瓜和西葫蘆上觀察到的結(jié)果類似[47,53]。南瓜果皮中POD活力較高的原因與其直接參與抵御生物和非生物脅迫密切相關(guān)[52]。
愈傷期間,南瓜果皮的肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和總酚以及p-香豆醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素合成水平顯著高于果肉,這主要是因為果皮較果肉具有更高的苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL和CAD的活力。同時,果皮的H2O2含量和POD活力也顯著高于果肉,通過氧化交聯(lián)導致了果皮部位SPP和木質(zhì)素沉積速率以及積累量顯著高于果肉。綜上所述,雖然南瓜果實果皮和果肉遭受損傷后均有愈傷反應(yīng),但果皮的愈傷能力更強。發(fā)生在表皮的損傷可以通過愈傷徹底修復(fù),而傷及果肉的愈傷效果不徹底,會導致貯藏期間腐爛的加重。因此,南瓜果實在采后處理中應(yīng)盡量減少傷及果肉的損傷。