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        氧化鋅納米顆粒對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物的抑制作用

        2021-12-02 09:20:32張咚咚ZakirHAYAT宋慧玲周顯青
        食品科學(xué) 2021年21期
        關(guān)鍵詞:水熱儲(chǔ)藏菌落

        張咚咚,胡 思,Zakir HAYAT,宋慧玲,周顯青

        (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,糧食儲(chǔ)藏與安全教育部工程研究中心,河南 鄭州 450001)

        玉米作為我國(guó)重要的秋糧作物,不僅被加工成多種多樣的食物,也是“飼料之王”和重要的工業(yè)原料,在人們的日常飲食和工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要位置,是我國(guó)糧食儲(chǔ)備的主要糧種之一[1]。玉米籽粒胚部較大,約占籽粒體積的1/3,營(yíng)養(yǎng)豐富,且其呼吸強(qiáng)度大、吸濕性強(qiáng)、帶菌量大、容易酸敗,同時(shí)玉米收獲時(shí)水分含量較高,易感染蟲(chóng)害等,因此玉米是主要糧食作物中最容易受到微生物侵害并出現(xiàn)發(fā)熱霉變的糧種之一[2-3]。

        無(wú)機(jī)納米材料尤其是氧化鋅納米材料,因能夠產(chǎn)生活性氧、溶出鋅離子和具備接觸效應(yīng)而具有較廣的抑菌譜,其抑菌時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境要求低、抑菌效果較好且無(wú)毒無(wú)害,已經(jīng)廣泛用于食品、包裝、防治等領(lǐng)域[4];也有納米顆粒在糧食田間的抑制真菌研究,并且氧化鋅作為添加劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)中[5-7]。在玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中鮮見(jiàn)有關(guān)氧化鋅納米顆粒(zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)的研究應(yīng)用,較多的研究結(jié)果關(guān)注玉米飼料中添加ZnO-NPs對(duì)動(dòng)物腹瀉或者腸道的影響,發(fā)現(xiàn)ZnONPs添加在飼料中相比普通氧化鋅能夠更好地控制動(dòng)物腹瀉,在上調(diào)毛螺菌科、瘤胃菌科、韋榮球菌科和鏈球菌科等益生菌豐度的同時(shí),還可下調(diào)鏈球菌科和普雷沃氏菌科比例,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率分別達(dá)到了97.9%和98.8%[8]。此外,添加ZnO-NPs有助于提高玉米飼料中鋅元素的含量。

        基于此,本實(shí)驗(yàn)采用水熱法優(yōu)化制備了一種球形ZnO-NPs,研究ZnO-NPs在玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)微生物的抑制作用,以期能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中長(zhǎng)效、廣譜、綠色微生物抑制劑提供理論依據(jù),進(jìn)一步提升我國(guó)的安全儲(chǔ)糧技術(shù)創(chuàng)新能力。

        1 材料與方法

        1.1 菌株、材料與試劑

        大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)和桔青霉(Penicillium citrinum)由本實(shí)驗(yàn)室前期從玉米中分離,現(xiàn)保藏于河南工業(yè)大學(xué)糧食儲(chǔ)運(yùn)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

        ‘鄭單958’玉米于2020年收獲于鄭州市高新區(qū)古滎村。

        氫氧化鈉 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;二水合乙酸鋅、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無(wú)水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

        1.2 儀器與設(shè)備

        DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、SZCL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;TGL-18MS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;101A-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠;水熱反應(yīng)釜(不銹鋼外殼、聚四氟內(nèi)襯)濟(jì)南恒化科技有限公司;IARffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,F(xiàn)TIR)奧譜天成(廈門)科技有限公司;Jem-2100F場(chǎng)發(fā)射能量過(guò)濾透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(配有X射線能譜儀) 日本JEOL公司;Mastersizer 3000激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司;LGL-10C真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;d8 advance X射線多晶衍射儀(X-ray powder diffractometer,XRD) 北京東方中科集成科技股份有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;HWS型恒溫恒濕箱 寧波東南儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 ZnO-NPs制備條件的優(yōu)化

        1.3.1.1 水熱反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

        取20 mL 1 mmol/L的醋酸鋅溶液于燒瓶中,然后將10 mL 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CTAB加入乙酸鋅溶液中,磁力攪拌15 min;邊攪拌邊滴加20 mL 8 mmol/L的氫氧化鈉溶液,室溫下劇烈攪拌30 min,形成白色凝膠狀沉淀;然后將上述混合液在40 kHz、600 W條件下超聲15 min,轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜,恒溫120 ℃下分別保持6、12、18、24、30 h后冷卻至室溫,分別用超純水和無(wú)水乙醇洗滌3 次后進(jìn)行真空冷凍干燥,得到ZnO-NPs粉末后采用Mastersizer 3000激光粒度儀通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法(后同)測(cè)定ZnO-NPs粒徑參數(shù)(粒徑分布、平均粒徑和多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI),后同),研究水熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)ZnO-NPs粒徑的影響。

        1.3.1.2n(Zn2+)∶n(OH-)的優(yōu)化

        參考1.3.1.1節(jié)方法在20 mL 1 mmol/L乙酸鋅溶液中,分別滴加2、4、6、8、10 mmol/L不同濃度氫氧化鈉溶液20 mL,此時(shí)體系中n(Zn2+)∶n(OH-)依次為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10,恒溫120 ℃,在1.3.1.1節(jié)優(yōu)化后的水熱反應(yīng)時(shí)間下制備ZnO-NPs,測(cè)定ZnO-NPs的粒徑參數(shù),探究不同n(Zn2+)∶n(OH-)對(duì)所制備ZnO-NPs粒徑的影響。

        1.3.1.3 水熱溫度的優(yōu)化

        在1 mmol/L 20 mL乙酸鋅溶液中,按1.3.1.2節(jié)優(yōu)化后的n(Zn2+)∶n(OH-)添加NaOH溶液,分別在80、100、120、140、160 ℃下按照1.3.1.1節(jié)優(yōu)化后的水熱反應(yīng)時(shí)間制備ZnO-NPs,測(cè)定ZnO-NPs的粒徑參數(shù),探究不同水熱溫度對(duì)所制備ZnO-NPs的粒徑的影響。

        1.3.1.4 溶劑的選擇

        前述ZnO反應(yīng)體系中采用的是水作為反應(yīng)溶劑,本節(jié)實(shí)驗(yàn)中將所有的試劑溶解于無(wú)水乙醇中,以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑,其他條件都采用上述優(yōu)化后的條件,采用Jem-2100F場(chǎng)發(fā)射TEM觀察ZnO-NPs形貌,加速電壓200 kV,探究?jī)煞N溶劑對(duì)ZnO-NPs制備的影響。

        1.3.2 ZnO-NPs的表征方法

        在1.3.1節(jié)優(yōu)化后的條件下制備ZnO-NPs,然后采用以下方法表征。

        ZnO-NPs的形貌采用Jem-2100F場(chǎng)發(fā)射TEM觀察,加速電壓200 kV,同時(shí)使用配備的能譜儀(energy dispersive spectrometer,EDS)來(lái)分析納米顆粒元素組分[9]。

        采用d8 advance X射線多晶衍射儀的Kα射線轟擊Cu靶,在40 kV和30 mA條件下,Cu Kα的波長(zhǎng)為1.540 6 ?,對(duì)樣品的分析角度為20°~80°,增量為0.05(°)/s[10],探究ZnO-NPs的晶粒尺寸和結(jié)構(gòu)。

        采用ARffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀分析樣品的化學(xué)鍵結(jié)構(gòu),基線校正光譜采集范圍為4 000~400 cm-1,分辨率為1 cm-1,本實(shí)驗(yàn)中采用常規(guī)KBr壓片法測(cè)定ZnONPs的紅外光譜圖[11]。

        1.3.3 ZnO-NPs對(duì)模式細(xì)菌株抑制能力的測(cè)定

        采用瓊脂打孔法檢測(cè)了ZnO-NPs的抑菌能力。在前期研究中,本課題組從玉米表面分離出革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),作為該實(shí)驗(yàn)的模式菌株,測(cè)定ZnO-NPs對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制能力。將處于對(duì)數(shù)期的兩種細(xì)菌制備成1×106CFU/mL的菌懸液,取100 μL均勻涂在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,采用8 mm的無(wú)菌打孔器在平板中央打1 個(gè)孔。在孔內(nèi)加入100 μL不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8 mg/L)的ZnO-NPs,在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。使用數(shù)碼游標(biāo)卡尺分別測(cè)量抑菌圈直徑[12-13],用抑菌圈直徑表征ZnO-NPs對(duì)模式細(xì)菌株的抑菌能力。

        1.3.4 ZnO-NPs對(duì)模式霉菌株抑制能力的測(cè)定

        在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室從玉米表面分離出黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)和桔青霉(Penicillium citrinum)作為該實(shí)驗(yàn)的模式霉菌,通過(guò)3種真菌的菌絲徑向生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)價(jià)其抗真菌活性。將3 種霉菌分別制備成孢子懸液,將ZnO-NPs分別按照0、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL添加至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基中,其中未添加ZnO-NPs為空白組。將100 μL新鮮的孢子懸浮液(1×106CFU/mL)接種于PDA培養(yǎng)基的平板中心(3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn))[14]。接種好的PDA平板在(28±1)℃孵育3 d。用數(shù)碼游標(biāo)卡尺測(cè)量真菌徑向生長(zhǎng)的平均直徑,按照下式計(jì)算對(duì)菌絲徑向生長(zhǎng)的抑制率。

        式中:C為對(duì)照組菌絲徑向生長(zhǎng)直徑/mm;T為ZnONPs處理的菌絲徑向生長(zhǎng)直徑/mm。

        1.3.5 玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物菌落總數(shù)的測(cè)定

        將玉米過(guò)篩除雜,分成6 份,每份2 kg,采用GB/T 10362—2008《糧油檢驗(yàn) 玉米水分測(cè)定》測(cè)定玉米的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù),然后將含有不同質(zhì)量濃度的ZnO-NPs懸浮液噴灑在玉米上,并在潤(rùn)麥器中旋轉(zhuǎn)攪拌,使玉米中ZnO-NPs的添加量分別為0(即對(duì)照組)、100、200 mg/kg(以玉米質(zhì)量計(jì)),根據(jù)玉米實(shí)際水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)加水量,使玉米水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%;將玉米置于溫度為35 ℃、相對(duì)濕度為80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中模擬儲(chǔ)藏,每5 d取樣檢測(cè)玉米表面微生物菌落總數(shù)變化情況。微生物菌落總數(shù)的檢測(cè)采用GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》方法。

        1.3.6 玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)

        以玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中常檢測(cè)的玉米脂肪酸值和玉米發(fā)芽率來(lái)評(píng)價(jià)ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響。玉米儲(chǔ)藏方法同1.3.5節(jié),每5 d取樣檢測(cè)各品質(zhì)指標(biāo)。其中,玉米脂肪酸值采用GB/T 20570—2015《玉米儲(chǔ)存品質(zhì)判定規(guī)則》附錄A測(cè)定,玉米發(fā)芽率采用GB/T 5520—2011《糧油檢驗(yàn) 籽粒發(fā)芽試驗(yàn)》測(cè)定。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Origin 2019b軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 ZnO-NPs制備條件的優(yōu)化結(jié)果

        2.1.1 水熱反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

        當(dāng)水熱反應(yīng)時(shí)間為18、24、30 h時(shí),ZnONPs的平均粒徑從149 nm增加到190 nm,相對(duì)應(yīng)的PDI從0.075增加到0.264。PDI越大,粒徑分布范圍就越寬,PDI越小,顆粒粒徑就越均勻。當(dāng)水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí),平均粒徑為135 nm(PDI=0.075),粒徑明顯降低,且較為均一(圖1)。結(jié)果顯示,隨著水熱反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),ZnO-NPs的粒徑總體上呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì),在水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí),達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)閆nO-NPs在水熱反應(yīng)初期徑向生長(zhǎng)和縱向生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行,隨著時(shí)間延長(zhǎng),ZnONPs的縱向生長(zhǎng)速度大于徑向生長(zhǎng)速度,長(zhǎng)徑比也在不斷增加,而ZnO-NPs的粒徑也隨著水熱反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大[15]。故本研究中選擇水熱反應(yīng)時(shí)間為6 h。

        圖1 不同水熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)ZnO-NPs粒度分布(A)和平均粒徑(B)的影響Fig. 1 Particle size distribution (A) and average particle size (B) of ZnO-NPs prepared with different hydrothermal times

        2.1.2 Zn2+/OH-物質(zhì)的量比的優(yōu)化結(jié)果

        當(dāng)n(Zn2+)∶n(OH-)為1∶2時(shí),ZnO-NPs的平均粒徑約為460 nm(PDI=0.567),相比其他物質(zhì)的量比條件下制備的ZnO-NPs,其粒徑明顯增大,且分布范圍更寬(圖2),這可能是溶液中OH-濃度較低,正極面的生長(zhǎng)速率大于柱面的生長(zhǎng)速率,造成前驅(qū)體反應(yīng)不完全,顆粒間出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象[16]。隨著反應(yīng)體系中OH-濃度的不斷加大,其平均粒徑逐漸變小,當(dāng)n(Zn2+)∶n(OH-)為1∶8時(shí),ZnO-NPs的平均粒徑最小,約為105 nm(PDI=0.029),且粒徑分布也更集中(圖2),這是由于在ZnO-NPs的生長(zhǎng)過(guò)程中,OH-不斷與顆粒表面進(jìn)行碰撞,濃度越大碰撞越激烈,導(dǎo)致顆粒越小[17];當(dāng)n(Zn2+)∶n(OH-)為1∶10時(shí),ZnONPs的生長(zhǎng)過(guò)程中反應(yīng)體系的Zn2+、OH-總數(shù)較多,從而使得納米顆粒形成較快,粒徑較大[18]。故本研究中選擇n(Zn2+)∶n(OH-)為1∶8。

        圖2 不同n(Zn2+)∶n(OH-)對(duì)ZnO-NPs粒度分布(A)和平均粒徑(B)的影響Fig. 2 Particle size distribution (A) and average particle size (B) of ZnO-NPs prepared with different n(Zn2+)∶n(OH-) ratios

        2.1.3 水熱溫度的優(yōu)化結(jié)果

        在不同的水熱溫度下,各離子的運(yùn)動(dòng)激烈程度明顯不同,ZnO-NPs的生長(zhǎng)速度也不同。如圖3所示,當(dāng)溫度低于120 ℃時(shí),隨著水熱溫度的升高,一方面會(huì)促使粒徑大小更為均一;另一方面會(huì)使粒徑逐漸變小,ZnO-NPs的平均粒徑從160 nm減小到93 nm,相對(duì)應(yīng)的PDI從0.201減小到0.075。當(dāng)水熱溫度為120 ℃時(shí),粒徑分布范圍較集中,粒徑為92 nm的ZnO-NPs粒度分布達(dá)到35%,且ZnO-NPs在120 ℃條件下的平均粒徑最小,溫度高于120 ℃時(shí),隨著溫度的升高,平均粒徑逐漸增大(圖3B)。這與吳長(zhǎng)樂(lè)[19]的報(bào)道一致,隨著溫度的升高,混合溶液中反應(yīng)分子的能量升高,活性分子數(shù)增多,從而促進(jìn)了分子間的相互碰撞,溶液中生成ZnO-NPs的趨勢(shì)也會(huì)變大,使得生長(zhǎng)順序上長(zhǎng)度方向的增長(zhǎng)速度大于直徑方向,因此ZnO-NPs的粒徑發(fā)生變化。故本研究中選擇最佳水熱溫度為120 ℃。

        圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)ZnO-NPs粒度分布(A)和平均粒徑(B)的影響Fig. 3 Particle size distribution (A) and average particle size (B) of ZnO-NPs prepared at different reaction temperatures

        2.1.4 溶劑的優(yōu)化結(jié)果

        不同的溶劑獲得的納米顆粒形態(tài)有明顯的差異,以水為溶劑時(shí),所制備的納米顆粒呈圓球狀(圖4A),而以乙醇為溶劑時(shí),所制備的納米顆粒呈棒狀(圖4B)。這可能是由于溶劑-晶體表面的相互作用,乙醇吸附在晶體的表面,降低了ZnO晶面的活性,抑制了正極面方向的晶體生長(zhǎng),柱面方向的生長(zhǎng)速度較快,從而形成了棒狀結(jié)構(gòu)[20-21]。綜上,本研究選擇水作為溶劑制備ZnO-NPs。

        圖4 不同溶劑制備的ZnO-NPs的TEM圖Fig. 4 TEM images of ZnO-NPs prepared with different solvents

        2.2 ZnO-NPs的表征結(jié)果

        2.2.1 TEM表征結(jié)果

        在透射電子顯微鏡下,所制備的ZnO-NPs類似球形,形態(tài)相似,大小相對(duì)均一,分散性較好(圖5)。在TEM圖像中,隨機(jī)選定200個(gè)納米顆粒,對(duì)其絕對(duì)粒徑進(jìn)行測(cè)量分析,測(cè)得平均粒徑為(33±2)nm,動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得ZnO-NPs平均粒徑為93 nm(PDI=0.024)。

        圖5 ZnO-NPs的TEM圖Fig. 5 TEM images of ZnO-NPs prepared under optimized conditions

        2.2.2 EDS表征結(jié)果

        所制備的納米顆粒經(jīng)過(guò)EDS能譜分析,可以確定納米顆粒中所含元素的種類及相對(duì)含量。結(jié)果表明所制備的ZnO-NPs中只含有鋅一種金屬元素,除此之外還有非金屬元素氧(其他元素都是超薄碳膜上所攜帶的)(圖6A),沒(méi)有其他雜質(zhì)元素峰的存在,且Zn原子和O原子分布均勻(圖6B),表明所制備的納米顆粒元素組成中只含有Zn和O兩種元素,較為純凈,沒(méi)有其他雜質(zhì)元素存在。

        圖6 ZnO-NPs的EDS(A)及Mapping圖譜(B)Fig. 6 EDS profile (A) and Mapping image (B) of ZnO-NPs

        2.2.3 XRD分析結(jié)果

        所制備ZnO-NPs的晶體結(jié)構(gòu)中具有明顯的ZnO特征峰(圖7),且譜峰與ZnO標(biāo)準(zhǔn)圖譜[22]完全一致。圖譜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的雜質(zhì)峰,說(shuō)明所制備的納米顆粒為ZnO,并且純度較高。

        圖7 ZnO-NPs的XRD圖譜Fig. 7 XRD pattern of ZnO-NPs

        2.2.4 FTIR分析結(jié)果

        FTIR可以用來(lái)分析化合物和材料獨(dú)特的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)模式,是化合物和材料鑒定的有力表征工具。所制備ZnO-NPs的紅外光譜譜圖中(圖8),在3 430 cm-1處有1 個(gè)明顯的特征峰,這是3 500~3 200 cm-1處的—OH伸縮振動(dòng)峰,可能是與鋅離子配位的-OH基團(tuán)引起的,也可能是納米顆粒表面的水引起的[23];在1 629 cm-1和472 cm-1處的特征峰是Zn-O鍵的特征吸收峰,主要是ZnO-NPs表面羥基或橋連羥基的伸縮和彎曲振動(dòng)吸收峰。

        圖8 ZnO-NPs的FTIR圖Fig. 8 FTIR spectrum of ZnO-NPs

        2.3 ZnO-NPs對(duì)模式細(xì)菌的抑制效果

        不管是對(duì)金黃色葡萄球菌還是大腸桿菌,納米顆粒周圍都有明顯的抑菌圈,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更明顯(圖9),這表明所制備的ZnO-NPs對(duì)細(xì)菌具有明顯的抑菌效果。在對(duì)不同添加量ZnO-NPs的抑菌測(cè)試中發(fā)現(xiàn),隨著添加量的提高,其抑菌圈直徑不斷增加,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更為明顯(表1)。也有較多文獻(xiàn)表明,ZnO-NPs的抑菌效果會(huì)隨著細(xì)菌種類和濃度的不同而不同[24-25]。金黃色葡萄球菌比大腸桿菌對(duì)ZnO-NPs更為敏感也表明在對(duì)細(xì)菌的抑制過(guò)程中,革蘭氏陽(yáng)性菌會(huì)比陰性菌更為敏感。這可能是由于革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中含有大量的肽聚糖和磷壁酸,易與ZnONPs產(chǎn)生的活性氧結(jié)合,從而導(dǎo)致菌體結(jié)構(gòu)被破壞[26],因此更容易受到抑制,這主要是細(xì)胞生理、細(xì)胞壁構(gòu)成和新陳代謝不同所致。此外,ZnO-NPs會(huì)釋放出Zn2+,Zn2+先吸附到細(xì)菌的細(xì)胞壁,破壞細(xì)胞壁并且干擾肽聚糖的合成,阻礙細(xì)胞壁的修復(fù)形成。之后,Zn2+進(jìn)一步穿透細(xì)胞壁,與蛋白質(zhì)或其他陰離子基團(tuán)結(jié)合,破壞膜的代謝和結(jié)構(gòu),Zn2+還能穿透細(xì)胞膜滲入到細(xì)胞的內(nèi)部,抑制細(xì)菌正常的代謝反應(yīng),造成細(xì)菌的死亡或產(chǎn)生功能障礙[27-28]。

        圖9 ZnO-NPs對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈Fig. 9 Inhibitory zones of ZnO-NPs against E. coli and S. aureus

        表1 ZnO-NPs對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄菌的抑菌圈直徑Table 1 Diameters of inhibition zones of ZnO-NPs against E. coli and S. aureus

        2.4 ZnO-NPs對(duì)模式真菌的抑制效果

        ZnO-NPs的濃度及真菌種類對(duì)抑菌特性有明顯影響,如圖10、表2所示,隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的不斷增加,霉菌的活性受到明顯抑制,其菌絲徑向生長(zhǎng)直徑不斷減小,當(dāng)ZnO-NPs質(zhì)量濃度大于0.25 mg/mL時(shí),隨著ZnO-NPs質(zhì)量濃度的增加,ZnO-NPs對(duì)黑曲霉、黃曲霉和桔青霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果明顯增強(qiáng),說(shuō)明ZnONPs的抗真菌能力具有一定的濃度依賴性。ZnO-NPs對(duì)3種真菌的抑制作用有明顯的差異。這可能是由于菌體在ZnO-NPs的作用下產(chǎn)生活性氧,活性氧與真菌相互作用,促進(jìn)菌絲體的變異,從而達(dá)到抑制真菌的作用[29-31]。

        圖10 不同質(zhì)量濃度ZnO-NPs對(duì)黃曲霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌活性Fig. 10 Antifungal activity of ZnO-NPs against A. flavus, A. niger and P. citrinum

        表2 不同質(zhì)量濃度的ZnO-NPs對(duì)3 種真菌的生長(zhǎng)抑制率Table 2 Inhibitory rates of ZnO-NPs on the growth of three fungi

        2.5 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物菌落總數(shù)的影響

        2.5.1 ZnO-NPs對(duì)細(xì)菌菌落總數(shù)的影響

        在溫度為35 ℃、相對(duì)濕度為80%的儲(chǔ)藏條件下,經(jīng)過(guò)30 d的儲(chǔ)藏,玉米表面細(xì)菌菌落總數(shù)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,對(duì)照組中菌落總數(shù)從初始的6.54×104CFU/g迅速增加到5.40×105CFU/g,而在不同ZnO-NPs添加量下,細(xì)菌菌落總數(shù)均明顯減少,且添加量越高其抑制作用越明顯(圖11)。這一結(jié)果與圖9、表1中ZnO-NPs對(duì)兩種模式細(xì)菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用的結(jié)果一致。在儲(chǔ)藏30 d內(nèi),實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)菌菌落總數(shù)全程低于對(duì)照組,表明添加的納米顆粒具有持續(xù)的抑菌特性,在玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中,能夠持續(xù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖有抑制作用。

        圖11 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中細(xì)菌菌落總數(shù)的抑制作用Fig. 11 Inhibitory effect of ZnO-NPs on bacterial colony counts

        2.5.2 ZnO-NPs對(duì)真菌菌落總數(shù)的影響

        在溫度為35 ℃、相對(duì)濕度為80%的儲(chǔ)藏條件下,經(jīng)過(guò)30 d的儲(chǔ)藏,玉米表面真菌菌落總數(shù)在儲(chǔ)藏前期相對(duì)比較平穩(wěn),在5.00×104CFU/g上下浮動(dòng)。隨后,對(duì)照組中真菌菌落總數(shù)顯著增加,而添加了ZnO-NPs的玉米真菌菌落總數(shù)增加量較少(圖12)。這表明納米顆粒在抑制細(xì)菌的同時(shí),對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中有較大破壞力的真菌也有明顯的抑制作用。這一結(jié)果與圖10、表2中ZnO-NPs對(duì)3 種模式真菌有抑制作用的結(jié)果一致,同時(shí),在玉米儲(chǔ)藏的30 d內(nèi),其菌落總數(shù)一直處于較低水平,表明ZnO-NPs的添加對(duì)真菌有持續(xù)的抑制作用。

        圖12 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌菌落總數(shù)的抑制作用Fig. 12 Inhibitory effect of ZnO-NPs on fungal colony count during maize storage

        2.6 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏品質(zhì)指標(biāo)的影響

        2.6.1 ZnO-NPs對(duì)玉米脂肪酸值的影響

        玉米在儲(chǔ)藏過(guò)程中,本身仍然具有生理活性,通過(guò)分析玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中的脂肪酸值和發(fā)芽率的變化情況,以評(píng)估ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)指標(biāo)的影響。其中,脂肪酸值是判定玉米是否宜存的一項(xiàng)重要指標(biāo),可根據(jù)玉米脂肪酸值來(lái)判斷玉米品質(zhì)的劣變程度。經(jīng)過(guò)30 d儲(chǔ)藏,不同處理組玉米的脂肪酸值從初始的32.17 mg/100 g升高到最終的50 mg/100 g左右,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),玉米脂肪酸值明顯升高,添加ZnO-NPs后,與對(duì)照組相比,其脂肪酸值無(wú)明顯變化(圖13)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中脂肪酸值的差別不明顯,表明ZnONPs的添加并不會(huì)引起玉米脂肪酸的劣變,也有可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中玉米儲(chǔ)藏時(shí)間較短,玉米脂肪酸值變化較小。在后續(xù)研究中,有必要進(jìn)一步延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期,探索ZnO-NPs可以對(duì)玉米長(zhǎng)期儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)的影響。

        圖13 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中脂肪酸值的影響Fig. 13 Effect of ZnO-NPs on fatty acid value of maize during storage

        2.6.2 ZnO-NPs對(duì)玉米發(fā)芽率的影響

        發(fā)芽率可以反映玉米種子的生活力,發(fā)芽率高的種子具有較強(qiáng)的生活力。發(fā)芽率一方面與種子的水分含量有關(guān),水分含量越高,種子越難以發(fā)芽;另一方面也能反映玉米胚的完整性。經(jīng)過(guò)30 d的儲(chǔ)藏,玉米的發(fā)芽率在儲(chǔ)藏前期維持在80%左右,儲(chǔ)藏后期對(duì)照組有一定的下降,添加ZnO-NPs后,其發(fā)芽率相對(duì)較高(圖14),表明ZnO-NPs對(duì)玉米有一定的保護(hù)作用,可能是由于ZnONPs抑制了玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng),從而保護(hù)了玉米胚的完整性,促進(jìn)了發(fā)芽率的提高。

        圖14 ZnO-NPs對(duì)玉米儲(chǔ)藏不同時(shí)間后發(fā)芽率的影響Fig. 14 Effect of ZnO-NPs on germination rate of maize during storage

        3 結(jié) 論

        為解決玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物快速生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致的發(fā)熱、霉變、真菌毒素超標(biāo)的問(wèn)題,本研究采用水熱法優(yōu)化制備了1 種具有抑菌能力的ZnO-NPs,期望能夠用作玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中的微生物抑制劑。經(jīng)過(guò)對(duì)ZnO-NPs制備條件的優(yōu)化,最終確定了n(Zn2+)∶n(OH-)為1∶8、水熱溫度120 ℃、恒溫水熱6 h、以水為溶劑的制備條件,該條件下所制備的納米顆粒為球形,平均粒徑93 nm(PDI為0.024),且經(jīng)過(guò)EDS、XRD、FTIR表征,所制備的納米顆粒不含雜質(zhì)元素,具有ZnO-NPs所特有的晶體結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵特征。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ZnO-NPs對(duì)2 株模式細(xì)菌和3 株模式真菌具有明顯的抑菌效果。將所制備的ZnO-NPs添加到玉米中,儲(chǔ)藏30 d內(nèi),ZnONPs能夠有效抑制玉米表面的細(xì)菌菌落總數(shù)和真菌菌落總數(shù),對(duì)玉米脂肪酸值無(wú)明顯影響,對(duì)發(fā)芽率有一定的提升作用。綜上,優(yōu)化制備的ZnO-NPs能夠抑制玉米表面的微生物生長(zhǎng)繁殖,有望作為一種新型微生物抑制劑應(yīng)用于玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中,實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米表面微生物生長(zhǎng)繁殖的長(zhǎng)期抑制,加強(qiáng)玉米的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

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