李柯，楊蕾，孟令嘉

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038）

龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹［Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen］的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，主要產(chǎn)于東南亞國家和我國云南等地，具有活血散瘀、止血止痛、斂瘡生肌的作用，主要用于外傷出血，跌打損傷等癥狀［1-3］。目前對龍血竭藥材的研究主要有龍血竭的化學(xué)成分［4］、高效液相色譜指紋圖譜［5］、有效成分含量測定［6-8］及部分非法染色［9］。文獻(xiàn)報道稱有部分不法商家為了商品的外觀色澤鮮亮，在龍血竭中摻雜非法染色劑，對人們的用藥安全產(chǎn)生一定的危害，文獻(xiàn)報道的龍血竭藥材中主要檢出蘇丹紅系列和808猩紅等染料［9］，蘇丹紅系列是一種人工合成的偶氮型燃料［10-12］，其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的苯胺和萘胺具有較強(qiáng)的致癌作用，歐美國家已經(jīng)明確禁止將蘇丹紅添加至食品與藥品中。目前對蘇丹紅的研究主要為食品中非法添加的檢測［13］，蘇丹紅的測定方法主要有薄層色譜法［14］、紫外分光光度法［15］、液相色譜法［16］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［17］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［18-19］等。筆者參考文獻(xiàn)資料和中國藥典［20-21］對10批不同來源的龍血竭藥材非法染色進(jìn)行研究，通過紫外光譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒別和確認(rèn)，比目前現(xiàn)有文獻(xiàn)報道方法更全面，從定性到到定量，并對檢出的蘇丹紅Ⅳ進(jìn)行含量測定的方法學(xué)驗證，為龍血竭藥材中非法染色的鑒別和蘇丹紅Ⅳ的含量測定提供實驗依據(jù)，進(jìn)而可以更加全面的評價龍血竭藥材的質(zhì)量，從而保證其臨床用藥的安全性和有效性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent1260-G6410型，MassHunter采集軟件，包括四元洗脫泵，DAD檢測器，美國安捷倫儀器公司。

雙頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ-700VDB型，江蘇昆山超聲儀器公司。

電子天平：BSA-124S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

蘇丹紅Ⅳ：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為94.0%，批號為40121，德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

乙腈：色譜級，美國Fisher公司。

氮氣：純度（體積分?jǐn)?shù)）不小于99.999%，北京天昊氣體有限公司。

實驗用水為超純水。

實驗所用其它試劑均為分析純。

龍血碣藥材分別來源于云南西雙版納、廣西桂林、貴州銅仁、緬甸、泰國等東南亞地區(qū)，所有藥材購自河北安國中藥材市場，藥材信息見表1。

表1 藥材的樣品信息

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

Agilent-C18XDB色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司），流動相：乙腈-0.02%甲酸溶液（體積比為95∶5），流量為1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：518 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；理論塔板數(shù)蘇丹紅Ⅳ峰計算不低于15 000。蘇丹紅Ⅳ對照品和偽品龍血竭以及龍血竭藥材的色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 蘇丹紅Ⅳ對照品色譜圖

圖2 偽品龍血竭色譜圖

圖3 龍血竭藥材色譜圖

1.2.2 質(zhì)譜

采用三重四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行測定；ESI離子源；正離子模式掃描；干燥氣和霧化氣：氮氣，壓力為137.9 KPa（20 psi），流量為 3.0 mL／min；加熱氣：空氣；干燥氣體溫度：300℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；質(zhì)量掃描范圍：50～500 u；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；碰撞能量：30 eV；裂解電壓：110 V；蘇丹紅Ⅳ的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖見圖4、圖5。

圖4 蘇丹紅Ⅳ對照品的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片圖

圖5 偽品龍血竭樣品的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片圖

1.3 溶液的配制

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘇丹紅Ⅳ對照品7.50 mg置于50 mL量瓶中，加乙腈溶解定容至標(biāo)線，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密吸取上述蘇丹紅Ⅳ對照品儲備液5 mL置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成蘇丹紅Ⅳ質(zhì)量濃度為30 μg／mL的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取上述批號200101的疑似染色龍血竭藥材粉末0.2 g，加乙腈25 mL，超聲處理10 min，靜置，放涼，采用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘇丹紅Ⅳ的鑒別與確認(rèn)

實驗首先取10批龍血竭藥材，按照2020年版《中國藥典》四部色素指導(dǎo)原則進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2批樣品在與蘇丹紅Ⅳ薄層色譜相同的位置上顯相同顏色的斑點，但是斑點均在前沿，無法準(zhǔn)確判斷，然后將2批染色可疑的樣品再次換展開劑進(jìn)行展開，使其在較好的比移值范圍內(nèi)，并增加其它系列蘇丹紅染色劑從而更加準(zhǔn)確地判斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇丹紅Ⅳ確實與1號和5號樣品顏色一致。接著采用液相色譜法進(jìn)行判斷，供試品與蘇丹紅Ⅳ在相同的保留時間出現(xiàn)相同的色譜峰。然后通過紫外光譜圖比較，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)和佐證，光譜圖中供試品和蘇丹紅Ⅳ對照品均在518 nm處有最大吸收，且曲線的性狀基本一致，質(zhì)譜佐證實驗中的m／z381.9 ［M+H］為蘇丹紅Ⅳ的準(zhǔn)分子離子峰，二級碎片離子分別為m／z223.8、208.0、142.4、90.7 四個碎片離子，且5號和10號兩批樣品的質(zhì)譜二級碎片圖與蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品一致，因此更加確定此2批龍血竭藥材進(jìn)行了蘇丹紅Ⅳ的染色。

2.2 提取溶劑和色譜條件的選擇

蘇丹紅Ⅳ易溶于笨、油脂和苯酚等極性較小的溶劑中，難溶于水，微溶與乙醇。目前主要有乙腈、正己烷和丙酮等溶劑進(jìn)行提取的報道，食品中蘇丹紅的檢測方法也是采用正己烷進(jìn)行處理，以丙酮定容后進(jìn)行測定，因此本實驗對乙腈、正己烷和丙酮三種溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈提取色譜峰形較好，且乙腈比正己烷和丙酮毒性低，因此選擇乙腈為提取溶劑。同時本實驗參考文獻(xiàn)報道和食品中蘇丹紅檢測的國標(biāo)方法，分別采用乙腈和水、乙腈和0.1%甲酸水溶液以及甲醇和0.1%甲酸水溶液作為流動相進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈和水溶液作為流動相，對照品的色譜峰有點拖尾；甲醇和0.1%水溶液作為流動相，蘇丹紅Ⅳ的出峰時間太長，峰形較寬；最后采用乙腈和0.1%甲酸水溶液時，色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)，理論塔板數(shù)高。采用DAD檢測器對蘇丹紅Ⅳ提取光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在518 nm下具有最大吸收，故本實驗最終確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，檢測波長為518 nm，對蘇丹紅Ⅳ進(jìn)行檢測。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

取“1.3.1”項下的對照品儲備溶液作為對照品5號溶液，采用逐級稀釋法，制成含蘇丹紅Ⅳ分別 為 1.142、3.807、12.69、42.3、141 μg ／mL 的 系列對照品工作溶液，分別作為1～5號對照品溶液，然后精密吸取上述1～5號對照品溶液各10 μL，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測定，以蘇丹紅Ⅳ的質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計算得蘇丹紅Ⅳ的質(zhì)量濃度在1.142～141.0 μg／mL范圍內(nèi)線性方程為y=53.237x-13.628，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9。

將1號對照品溶液進(jìn)行稀釋進(jìn)樣，當(dāng)S／N=3時為檢出限，得到蘇丹紅Ⅳ的檢出限為2.28 ng／mL。

2.4 精密度試驗

取同一批號200101的疑似染色的龍血竭藥材，按照1.3.2法同時制備6份供試品溶液，然后按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測定。6份供試品中蘇丹紅Ⅳ含量測定值分別為 2.750 4、2.747 9、2.746 3、2.755 8、2.805 1、2.708 5 mg／g，平均值為 2.752 3 mg／g，計算得測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%，表明該方法具有良好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批號200101疑似染色的龍血竭藥材，按照“1.3.2”法制備供試品溶液，連續(xù)考察24 h，分別在 0、1、2、4、8、12、24 h 按照 1.2 儀器工作條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積分別為1 147.2、1 146.1、1 127.1、1 156.3、1 168.7、1 165.2、1 182.9 mAU，平均值為1156.2 mAU，計算得測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收試驗

精密稱取同一批號200101疑似染色的龍血竭藥材0.1 g，共18份，每6份為一組，然后分別向上述3組樣品中精密加入1.3.1配制的蘇丹紅Ⅳ對照品儲備溶液 100、200、300 μL，按照 1.3.2制備供試品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。樣品加標(biāo)色譜圖見圖6。由表2可知，樣品加標(biāo)回收率為94.72%～99.21%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=9）

圖6 樣品加標(biāo)回收色譜圖

3 結(jié)語

首先按2020年版《中國藥典》四部色素指導(dǎo)原則進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批不同產(chǎn)地的龍血竭藥材中有2批藥材疑似是進(jìn)行了蘇丹紅IV的非法染色，且2批龍血竭藥材薄層色譜均與其它批次藥材斑點不一致，推測可能是其它樹脂類藥材直接進(jìn)行染色冒充正品龍血竭藥材。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對疑似染色的兩批藥材中蘇丹紅IV進(jìn)行確認(rèn)和測定，并進(jìn)行方法學(xué)研究，穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率均符合要求，并且確認(rèn)兩批藥材進(jìn)行了蘇丹紅IV染色。由于目前龍血竭藥材的收錄標(biāo)準(zhǔn)中未有非法染色的檢查項目，且非法染色的蘇丹紅對人體傷害具有一定的致癌性，很大程度上威脅這患者的用藥安全，難以保證藥品的有效性，因此為了藥材的的使用安全，建議將蘇丹紅的染色鑒別增加到龍血竭藥材標(biāo)準(zhǔn)中。