李柯,楊蕾,孟令嘉
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院,北京 100038)
龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen]的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂,主要產(chǎn)于東南亞國家和我國云南等地,具有活血散瘀、止血止痛、斂瘡生肌的作用,主要用于外傷出血,跌打損傷等癥狀[1-3]。目前對龍血竭藥材的研究主要有龍血竭的化學(xué)成分[4]、高效液相色譜指紋圖譜[5]、有效成分含量測定[6-8]及部分非法染色[9]。文獻報道稱有部分不法商家為了商品的外觀色澤鮮亮,在龍血竭中摻雜非法染色劑,對人們的用藥安全產(chǎn)生一定的危害,文獻報道的龍血竭藥材中主要檢出蘇丹紅系列和808猩紅等染料[9],蘇丹紅系列是一種人工合成的偶氮型燃料[10-12],其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的苯胺和萘胺具有較強的致癌作用,歐美國家已經(jīng)明確禁止將蘇丹紅添加至食品與藥品中。目前對蘇丹紅的研究主要為食品中非法添加的檢測[13],蘇丹紅的測定方法主要有薄層色譜法[14]、紫外分光光度法[15]、液相色譜法[16]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]等。筆者參考文獻資料和中國藥典[20-21]對10批不同來源的龍血竭藥材非法染色進行研究,通過紫外光譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒別和確認,比目前現(xiàn)有文獻報道方法更全面,從定性到到定量,并對檢出的蘇丹紅Ⅳ進行含量測定的方法學(xué)驗證,為龍血竭藥材中非法染色的鑒別和蘇丹紅Ⅳ的含量測定提供實驗依據(jù),進而可以更加全面的評價龍血竭藥材的質(zhì)量,從而保證其臨床用藥的安全性和有效性。
高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀:Agilent1260-G6410型,MassHunter采集軟件,包括四元洗脫泵,DAD檢測器,美國安捷倫儀器公司。
雙頻數(shù)控超聲波清洗器:KQ-700VDB型,江蘇昆山超聲儀器公司。
電子天平:BSA-124S型,感量為0.1 mg,德國賽多利斯公司。
蘇丹紅Ⅳ:純度(質(zhì)量分數(shù))為94.0%,批號為40121,德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。
乙腈:色譜級,美國Fisher公司。
氮氣:純度(體積分數(shù))不小于99.999%,北京天昊氣體有限公司。
實驗用水為超純水。
實驗所用其它試劑均為分析純。
龍血碣藥材分別來源于云南西雙版納、廣西桂林、貴州銅仁、緬甸、泰國等東南亞地區(qū),所有藥材購自河北安國中藥材市場,藥材信息見表1。
表1 藥材的樣品信息
1.2.1 色譜
Agilent-C18XDB色 譜 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美國安捷倫科技有限公司),流動相:乙腈-0.02%甲酸溶液(體積比為95∶5),流量為1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:518 nm;進樣體積:10 μL;理論塔板數(shù)蘇丹紅Ⅳ峰計算不低于15 000。蘇丹紅Ⅳ對照品和偽品龍血竭以及龍血竭藥材的色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。
圖1 蘇丹紅Ⅳ對照品色譜圖
圖2 偽品龍血竭色譜圖
圖3 龍血竭藥材色譜圖
1.2.2 質(zhì)譜
采用三重四級桿質(zhì)譜儀進行測定;ESI離子源;正離子模式掃描;干燥氣和霧化氣:氮氣,壓力為137.9 KPa(20 psi),流量為 3.0 mL/min;加熱氣:空氣;干燥氣體溫度:300℃;毛細管電壓:3.5 kV;質(zhì)量掃描范圍:50~500 u;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;碰撞能量:30 eV;裂解電壓:110 V;蘇丹紅Ⅳ的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖見圖4、圖5。
圖4 蘇丹紅Ⅳ對照品的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片圖
圖5 偽品龍血竭樣品的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片圖
1.3.1 對照品溶液的制備
精密稱取蘇丹紅Ⅳ對照品7.50 mg置于50 mL量瓶中,加乙腈溶解定容至標線,搖勻,作為對照品儲備溶液。精密吸取上述蘇丹紅Ⅳ對照品儲備液5 mL置于25 mL量瓶中,加乙腈稀釋至標線,搖勻,配制成蘇丹紅Ⅳ質(zhì)量濃度為30 μg/mL的對照品溶液。
1.3.2 供試品溶液的制備
精密稱取上述批號200101的疑似染色龍血竭藥材粉末0.2 g,加乙腈25 mL,超聲處理10 min,靜置,放涼,采用0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
實驗首先取10批龍血竭藥材,按照2020年版《中國藥典》四部色素指導(dǎo)原則進行薄層色譜鑒別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2批樣品在與蘇丹紅Ⅳ薄層色譜相同的位置上顯相同顏色的斑點,但是斑點均在前沿,無法準確判斷,然后將2批染色可疑的樣品再次換展開劑進行展開,使其在較好的比移值范圍內(nèi),并增加其它系列蘇丹紅染色劑從而更加準確地判斷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇丹紅Ⅳ確實與1號和5號樣品顏色一致。接著采用液相色譜法進行判斷,供試品與蘇丹紅Ⅳ在相同的保留時間出現(xiàn)相同的色譜峰。然后通過紫外光譜圖比較,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行確認和佐證,光譜圖中供試品和蘇丹紅Ⅳ對照品均在518 nm處有最大吸收,且曲線的性狀基本一致,質(zhì)譜佐證實驗中的m/z381.9 [M+H]為蘇丹紅Ⅳ的準分子離子峰,二級碎片離子分別為m/z223.8、208.0、142.4、90.7 四個碎片離子,且5號和10號兩批樣品的質(zhì)譜二級碎片圖與蘇丹紅Ⅳ標準品一致,因此更加確定此2批龍血竭藥材進行了蘇丹紅Ⅳ的染色。
蘇丹紅Ⅳ易溶于笨、油脂和苯酚等極性較小的溶劑中,難溶于水,微溶與乙醇。目前主要有乙腈、正己烷和丙酮等溶劑進行提取的報道,食品中蘇丹紅的檢測方法也是采用正己烷進行處理,以丙酮定容后進行測定,因此本實驗對乙腈、正己烷和丙酮三種溶劑進行考察,發(fā)現(xiàn)乙腈提取色譜峰形較好,且乙腈比正己烷和丙酮毒性低,因此選擇乙腈為提取溶劑。同時本實驗參考文獻報道和食品中蘇丹紅檢測的國標方法,分別采用乙腈和水、乙腈和0.1%甲酸水溶液以及甲醇和0.1%甲酸水溶液作為流動相進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈和水溶液作為流動相,對照品的色譜峰有點拖尾;甲醇和0.1%水溶液作為流動相,蘇丹紅Ⅳ的出峰時間太長,峰形較寬;最后采用乙腈和0.1%甲酸水溶液時,色譜峰形對稱,基線平穩(wěn),理論塔板數(shù)高。采用DAD檢測器對蘇丹紅Ⅳ提取光譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在518 nm下具有最大吸收,故本實驗最終確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相,檢測波長為518 nm,對蘇丹紅Ⅳ進行檢測。
取“1.3.1”項下的對照品儲備溶液作為對照品5號溶液,采用逐級稀釋法,制成含蘇丹紅Ⅳ分別 為 1.142、3.807、12.69、42.3、141 μg /mL 的 系列對照品工作溶液,分別作為1~5號對照品溶液,然后精密吸取上述1~5號對照品溶液各10 μL,按照1.2儀器工作條件進行測定,以蘇丹紅Ⅳ的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸,計算得蘇丹紅Ⅳ的質(zhì)量濃度在1.142~141.0 μg/mL范圍內(nèi)線性方程為y=53.237x-13.628,相關(guān)系數(shù) r=0.999 9。
將1號對照品溶液進行稀釋進樣,當(dāng)S/N=3時為檢出限,得到蘇丹紅Ⅳ的檢出限為2.28 ng/mL。
取同一批號200101的疑似染色的龍血竭藥材,按照1.3.2法同時制備6份供試品溶液,然后按照1.2儀器工作條件進行測定。6份供試品中蘇丹紅Ⅳ含量測定值分別為 2.750 4、2.747 9、2.746 3、2.755 8、2.805 1、2.708 5 mg/g,平均值為 2.752 3 mg/g,計算得測定結(jié)果的相對標準偏差為1.12%,表明該方法具有良好的精密度。
取同一批號200101疑似染色的龍血竭藥材,按照“1.3.2”法制備供試品溶液,連續(xù)考察24 h,分別在 0、1、2、4、8、12、24 h 按照 1.2 儀器工作條件進行測定,記錄色譜峰面積分別為1 147.2、1 146.1、1 127.1、1 156.3、1 168.7、1 165.2、1 182.9 mAU,平均值為1156.2 mAU,計算得測定結(jié)果的相對標準偏差為1.57%,表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
精密稱取同一批號200101疑似染色的龍血竭藥材0.1 g,共18份,每6份為一組,然后分別向上述3組樣品中精密加入1.3.1配制的蘇丹紅Ⅳ對照品儲備溶液 100、200、300 μL,按照 1.3.2制備供試品溶液,在1.2儀器工作條件下進行測定,結(jié)果見表2。樣品加標色譜圖見圖6。由表2可知,樣品加標回收率為94.72%~99.21%,說明該方法具有較高的準確度。
表2 加標回收試驗結(jié)果(n=9)
圖6 樣品加標回收色譜圖
首先按2020年版《中國藥典》四部色素指導(dǎo)原則進行薄層色譜鑒別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批不同產(chǎn)地的龍血竭藥材中有2批藥材疑似是進行了蘇丹紅IV的非法染色,且2批龍血竭藥材薄層色譜均與其它批次藥材斑點不一致,推測可能是其它樹脂類藥材直接進行染色冒充正品龍血竭藥材。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對疑似染色的兩批藥材中蘇丹紅IV進行確認和測定,并進行方法學(xué)研究,穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率均符合要求,并且確認兩批藥材進行了蘇丹紅IV染色。由于目前龍血竭藥材的收錄標準中未有非法染色的檢查項目,且非法染色的蘇丹紅對人體傷害具有一定的致癌性,很大程度上威脅這患者的用藥安全,難以保證藥品的有效性,因此為了藥材的的使用安全,建議將蘇丹紅的染色鑒別增加到龍血竭藥材標準中。