張琦，李文君，李墨浠，牛悅齊，胡婷婷，蘆春梅，王準(zhǔn)，翟亞楠，周曉

（長(zhǎng)春海關(guān)，長(zhǎng)春 130062）

焦油色素是以煤焦油為原料制成的，焦油色素制備成本低，顏色鮮艷，著色力強(qiáng)且穩(wěn)定不易褪色，在食品加工業(yè)中被廣泛采用。食用合成色素對(duì)人體可能具有致癌性，毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，許多食用合成色素在生產(chǎn)過(guò)程中還可能混入有害重金屬，人長(zhǎng)期食用會(huì)產(chǎn)生毒害。因此各國(guó)都嚴(yán)格控制其使用范圍和使用量［1-3］。

各國(guó)食用色素允許使用品種和范圍的差異，使我國(guó)出口食品中的色素含量項(xiàng)目面臨很大風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)兒童食品及藥物檢測(cè)機(jī)構(gòu)公布了關(guān)于兒童食品禁止使用8種14個(gè)項(xiàng)目的食用焦油色素及食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)的通知。韓國(guó)食品和藥物管理局已簽署了關(guān)于兒童食用色素（包括鋁色淀）被禁止使用的文件。食用焦油色素的14個(gè)項(xiàng)目包括綠3、食用焦油色素、綠3鋁湖、湖紅40、湖紅40鋁色淀、藍(lán)1、藍(lán)2鋁湖、青1、青1鋁湖、青2、青2鋁湖、黃4、黃4鋁湖、黃5、黃5鋁湖、紅3以及紅102等。我國(guó)允許使用新紅、莧菜紅、檸檬黃、靛藍(lán)、亮藍(lán)等食用合成色素，允許使用的食品種類(lèi)有果味水、果味粉，糖果、糕點(diǎn)上的彩裝、罐頭等［4-7］。

目前國(guó)內(nèi)外食品中焦油色素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)分光光度法、示波極譜法、檢測(cè)盒法、高效液相色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8-15］。薄層色譜法繁瑣費(fèi)時(shí)，測(cè)定結(jié)果偏低。紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)分光光度法這兩種方法對(duì)于二組分體系較為有效，對(duì)于多組分混合體系，需要結(jié)合數(shù)學(xué)方法。示波極譜法已被用于檢測(cè)飲料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅三種焦油色素。檢測(cè)盒法操作簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)一個(gè)樣品平均僅需要5～10 min，對(duì)幾種常用焦油色素最低檢出質(zhì)量濃度均可達(dá)到2.0 mg／L，但高濃度的乙醇、淀粉以及蛋白質(zhì)對(duì)色素的檢測(cè)有一定的干擾作用。高效液相色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可采用單一波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)檢測(cè)，結(jié)合梯度洗脫，能同時(shí)測(cè)定幾種混合色素，方法準(zhǔn)確，但必須結(jié)合樣品預(yù)處理，否則不能有效排除干擾。筆者探討并建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定果汁及乳飲料中酸性橙Ⅱ、酸性黃36、偶氮玉紅、赤蘚紅、誘惑紅、日落黃、喹啉黃、羅丹明B、柯衣定等9種焦油色素的分析方法。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法能夠有效去除干擾物質(zhì)，準(zhǔn)確測(cè)定相應(yīng)基質(zhì)中目標(biāo)焦油色素含量，可以為果汁及乳飲料中9種焦油色素的檢測(cè)提供有效的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：API 4500型，美國(guó)AB公司。

超聲振蕩器：AS10200－20L型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

分 析 天 平：（1）SQP型，感 量 為 0.1 mg；（2）AB265-S型，感量為0.01 g，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：Allegra X30R型，德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

氮吹儀：MGS-2200型，日本東京理化公司。

PH計(jì)：PH3310型，德國(guó)WTW公司。

乙腈、甲醇：質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司。

甲酸、氨水：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙酸銨、鐵氰化鉀、檸檬酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

酸性橙Ⅱ、酸性黃36、偶氮玉紅、赤蘚紅、誘惑紅、日落黃、喹啉黃、羅丹明B、柯衣定標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器工作條件

（1）液相色譜。色譜柱：Agilent Pursuit XRs 5 C18色譜柱（100 mm×2.0 mm，l3 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A相為20 mmol／L的乙酸銨水溶液，B相為乙腈；流量：0.25 mL／min；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜。電離方式：電噴霧（ESI）；電噴霧電壓：5 500 V／-4 500 V；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式：正／負(fù)離子掃描；氣簾氣（CUR）壓力：0.31 MPa(45 psi)；霧化氣（GS1）壓力：0.31 MPa(35 psi)；輔助氣（GS2）壓力：0.31 MPa(35 psi)；碰撞氣（CAD）壓力：0.15 MPa(6.0 psi)；離子源溫度：550℃；目標(biāo)化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量

續(xù)表2

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取

稱取樣品2 g（精確到0.01 g)至50 mL離心管中，加入5 mL水混勻，加入沉淀劑（鐵氰化鉀）后，4 000 r／min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液，用20%檸檬酸溶液調(diào)pH值至5，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

首先活化WAX固相萃取柱（6 mL／150 mg），依次加入6 mL甲醇、6 mL水活化固相萃取柱，將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，依次用6 mL 0.5%甲酸甲醇溶液、6 mL水清洗，棄去全部流出液，加入5 mL 25%氨化甲醇洗脫至10 mL試管中，于40℃下氮吹至近干，用甲醇定容至2.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品凈化方法的選擇

根據(jù)焦油色素的分子結(jié)構(gòu)特征，分別選取C18固相萃取柱、WAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

表3 9種焦油色素不同固相萃取柱的回收率

HLB柱是反相固相萃取柱，吸附目標(biāo)色素回收率為70%～80%，柯依定回收率低于60%；C18柱整體回收率為60%～80%；WAX柱具有弱陰離子交換及反相兩種交換機(jī)理，9種目標(biāo)色素整體回收率為80%～90%。由表3數(shù)據(jù)可知，WAX柱整體回收率均較高，9種目標(biāo)物回收率穩(wěn)定，因此選用WAX固相萃取柱。采用0.5%甲酸甲醇溶液淋洗固相萃取柱，可除去實(shí)際樣品中部分天然色素。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

分別以甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相考察對(duì)目標(biāo)物色素的洗脫效果。有機(jī)相用甲醇時(shí)色譜峰較寬，有機(jī)相用乙腈時(shí)色譜峰變窄，因此選擇乙腈作為有機(jī)相。采用乙腈-水流動(dòng)性體系，誘惑紅、日落黃色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，部分色譜峰分離度較差，水相添加20 mmol／L乙酸銨溶液后色譜峰變得尖銳，解決了峰間分離度不佳的情況，最終采用20 mmol／L乙酸銨溶液-乙腈作為流動(dòng)相。

進(jìn)行多目標(biāo)物分析時(shí)，為滿足分離度要求，需要目標(biāo)物出峰時(shí)間適當(dāng)延后，起始流動(dòng)相采用80%乙酸銨溶液-20%乙腈保持3 min，利于較強(qiáng)極性雜質(zhì)的洗脫；11 min內(nèi)將乙腈比例由20%提高到80%，使多數(shù)目標(biāo)物色素洗脫，20%乙酸銨溶液-80%乙腈保持2 min，將極性最弱的羅丹明B、柯衣定洗脫出來(lái)，最后平衡色譜柱回歸起始流動(dòng)相80%乙酸銨溶液-20%乙腈，保持4 min。

9種目標(biāo)色素優(yōu)化后的洗脫程序見(jiàn)表1，色素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 7種負(fù)掃描模式焦油色素總離子流圖

圖2 羅丹明B、柯衣定正掃描模式色譜圖

2.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件優(yōu)化

首先用針泵將每種目標(biāo)焦油色素單獨(dú)進(jìn)樣，進(jìn)行全掃描尋找母離子，優(yōu)化去簇電壓，確定母離子；再進(jìn)行碎片離子掃描，尋找強(qiáng)度最大的幾個(gè)特征離子，并優(yōu)化碰撞能量，選擇出合適的子離子，一般為2～3個(gè)，以所選母離子及其子離子進(jìn)行MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，并再次優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，使得所選離子對(duì)靈敏度最高。本研究選擇了多對(duì)離子中強(qiáng)度高、靈敏度高的兩對(duì)離子作為定性離子，為保證目標(biāo)物的定量和定性的準(zhǔn)確性，選擇其中靈敏度最高的一對(duì)離子作為定量離子。測(cè)定時(shí)，可根據(jù)保留時(shí)間和兩對(duì)離子對(duì)進(jìn)行定性確證；采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)樣品的MRM總離子流圖中的色譜峰面積，用外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法確定的特征目標(biāo)檢測(cè)離子測(cè)定靈敏度高，選擇性好，干擾物少，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，陽(yáng)性確證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 線性方程、線性范圍與檢出限

在本研究所確定的LC-MS／MS檢測(cè)條件下，分別對(duì)多種焦油色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同濃度范圍內(nèi)制備5個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)色素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、以定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算目標(biāo)色素線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r。根據(jù)各焦油色素定性離子信噪比S／N≥3計(jì)算方法檢出限。方法的線性范圍和檢出限見(jiàn)表3。

表3 線性方程、線性范圍和檢出限

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

選擇未檢出酸性橙Ⅱ、酸性黃36、偶氮玉紅、赤蘚紅、誘惑紅、日落黃、喹啉黃、羅丹明B、柯衣定等9種焦油色素的樣品，分別添加 0.5、1.0、5.0 μg／kg的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做6次平行試驗(yàn)，計(jì)算方法的平均回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。樣品加標(biāo)色譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 7種負(fù)掃描模式焦油色素加標(biāo)色譜圖

圖4 2種正掃描模式焦油色素加標(biāo)色譜圖

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，焦油色素的回收率為78.00%～97.08%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.49%～11.27%?；厥章屎拖鄬?duì)偏差均在允許范圍內(nèi)。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了固相萃取柱-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果汁和乳飲料中酸性橙Ⅱ、酸性黃36、偶氮玉紅、赤蘚紅、誘惑紅、日落黃、喹啉黃、羅丹明B、柯衣定等9種焦油色素的分析方法。本方法利用固相萃取柱對(duì)樣品中的焦油色素進(jìn)行富集，有效去除基體干擾，以選擇離子對(duì)待測(cè)物定性，用外標(biāo)法進(jìn)行定量，開(kāi)發(fā)出了一個(gè)高效、快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)檢測(cè)多種焦油色素的分離和分析確證方法。該方法檢測(cè)下限完全滿足國(guó)內(nèi)外最高殘留限量對(duì)食品的檢測(cè)要求，能夠?yàn)榭刂品欠ㄌ砑咏褂蜕氐氖称妨魅脘N(xiāo)售市場(chǎng)提供有效的保障。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，更多新型焦油色素被非法用于食品中，繼續(xù)完善焦油色素準(zhǔn)確、快速檢測(cè)方法，對(duì)于保障人民身體健康、提高進(jìn)出口監(jiān)管的針對(duì)性和有效性，保障進(jìn)口食品安全，將起到重大意義。