陸文睿，丁華峰，倪觀太，張瑩，王慶瑋，郭楠

（皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦科，安徽 蕪湖241001）

宮頸癌發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中占首位。近年，包括中國在內(nèi)的廣大發(fā)展中國家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率一直呈逐年增高趨勢。2015年我國宮頸癌發(fā)病率為16.56／10萬［1］，現(xiàn)已證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件［2］。

microRNAs是一組具有19～25個核苷酸的非編碼RNA，與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［3］，主要通過與其靶基因的mRNA的3′－非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)［4］。microRNAs及其相互調(diào)控的下游靶基因啟動了下游信號通路，在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲等基本生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用［5－6］。近期研究發(fā)現(xiàn)miR－29a－3p的過表達(dá)抑制了HeLa細(xì)胞的遷移和增殖，并且SNIP1下游基因（HSP27、c－Myc和cyclin D1）的mRNA表達(dá)被miR－29a－3p下調(diào)［7］。本研究為進(jìn)一步探討miR－29a－3p在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，選擇miR－29a－3p作為研究對象，探討其在宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 將2019年1月至2020年1月于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦科經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌患者的宮頸組織10例作為病例組，對照組選擇因子宮良性疾病進(jìn)行全子宮切除術(shù)患者的正

常宮頸組織10例，所有患者術(shù)前均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞與試劑 人宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞株均購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（賽默飛世爾（中國）科技公司）。cDNA、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT－PCR）試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），轉(zhuǎn)染試劑、引物（廣州銳博生物科技有限公司）。CCK－8試劑盒（貝博生物科技有限公司），Transwell小室（康寧生物科技有限公司）。

1.3 qRT－PCR檢測宮頸癌組織中的表達(dá) 收集的宮頸癌組織及宮頸正常組織，進(jìn)行勻漿處理，多次反復(fù)離心后加入氯仿、異丙醇溶液、75%乙醇，最終洗滌沉淀，加入RNase－Free ddH2O。使用Trizol試劑提取總RNA。根據(jù)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用qRT－PCR儀檢測miR－29a－3p的表達(dá)量，引物序列見表1。采用2－△△Ct法計(jì)算miR－29a－3p的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與miR－29a－3p mimics轉(zhuǎn)染 將HeLa細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，SiHa細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞，接種于6孔板、每孔（2～3）×105細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至30%～50%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染說明書分別用miR－29a－3p mimic及miR－29a－3p NC分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞。采用qRT－PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.5 CCK8檢測細(xì)胞的增殖情況 實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔3×103細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。于24、48、72 h后加入10μl CCK8試劑共同培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測光密度值（OD值）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對比細(xì)胞的增殖能力變化。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲情況 以1∶6的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel，覆蓋Transwell小室的上室，將其放入37℃的孵箱中孵育2 h，使Matrigel聚合成凝膠。收集miR－29a－3p mimics及NC mimics轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，在Transwell小室上室以每孔5×105／ml細(xì)胞和200μl無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室加入500μl培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)室中的細(xì)胞和基質(zhì)，甲醇固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色溶液染色30 min，用PBS沖洗3次，取出上部小室的細(xì)胞，在高倍鏡下觀察細(xì)胞，拍照計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad、SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－29a－3p在宮頸癌組織中表達(dá)降低 qRT－PCR結(jié)果表明miR－29a－3p在宮頸癌組織中的表達(dá)量低于正常宮頸組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR－29a－3p在正常宮頸組織（NC）及宮頸癌（CC）組織中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR－29a－3p對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，qRT－PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，miR－29a－3p mimics組較對照組miR－29a－3p NC表達(dá)量明顯增高（P＜0.05），見圖2；通過CCK－8實(shí)驗(yàn)表明miR－29a－3p mimics組較對照組中宮頸癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降（P＜0.05），見圖3。

圖2 miR－29a－3p在宮頸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

圖3 CCK－8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR－29a－3p對宮頸癌SiHa細(xì)胞（A）和Hela細(xì)胞（B）增殖能力的影響

2.3 過表達(dá)miR－29a－3p對宮頸癌細(xì)胞遷移的影響 miR－29a－3p mimics組相較于對照組細(xì)胞的數(shù)目減少明顯，見圖4A；結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4B。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR－29a－3p對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

篩選出宮頸癌中有生物學(xué)意義的microRNAs來進(jìn)一步探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)理，得到了許多學(xué)者的關(guān)注。microRNAs通過靶向調(diào)節(jié)原癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移基因、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、微環(huán)境、腫瘤干細(xì)胞特性、外泌體等多個方面來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和遷移［8］。

宮頸癌的發(fā)病過程受到多種因素的調(diào)控，在發(fā)生、發(fā)展過程中會受到一些復(fù)雜的異常調(diào)控［9］。從發(fā)病機(jī)制的角度出發(fā)，尋找有意義的分子生物學(xué)靶標(biāo)研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，成為了目前的主要研究方向。microRNAs的調(diào)節(jié)功能參與所有致癌過程和對病毒感染的應(yīng)答，人乳頭瘤病毒可以誘導(dǎo)許多細(xì)胞microRNAs的異常表達(dá)，但這種失調(diào)可以作為人乳頭瘤病毒感染、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和癌癥的早期診斷的標(biāo)志物［9］。已有研究報(bào)道了microRNAs在調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖方面發(fā)揮著重要作用，Ni等［10］的研究表明miRNA－802在宮頸癌細(xì)胞和宮頸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，可以通過靶向MYLIP調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移；Yang等［11］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中miR－155的表達(dá)降低，同時(shí)miR－155作為被LncRNA UCA1調(diào)控的下游基因，參與了宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，影響了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究qRT－PCR結(jié)果顯示miR－29a－3p在宮頸癌組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR－29a－3p后可以有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。已有研究報(bào)道，miR－29a－3p影響了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展［12］；Chen等［7］發(fā)現(xiàn)miR－29a－3p的過表達(dá)抑制了宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移和增殖，本研究結(jié)論與其一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR－29a－3p在宮頸癌的發(fā)病過程中發(fā)揮著抑癌基因的作用，過表達(dá)miR－29a－3p抑制了人宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，miR－29a－3p可能成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。