王夢(mèng)婭， 金超凡， 張奉燕， 黃可佳， 賀 艷

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

脊椎動(dòng)物的肌肉生長分為限定性生長與非限定性生長，如鳥類和哺乳類的肌肉生長模式為典型的限定性生長，它們的肌纖維數(shù)量在出生前已經(jīng)固定，出生后肌肉的生長主要取決于胚胎期形成的肌纖維數(shù)量和增加已有肌纖維尺寸的大小[1-4]。不同于鳥類與哺乳類，大多數(shù)魚類的肌肉呈現(xiàn)非限定性生長模式，肌纖維數(shù)目不是固定的，兼有肌纖維數(shù)目增生(Hyperplasia)和肥大(Hypertrophy)的“馬賽克”式生長[5-8]。這種肌纖維增生和肥大對(duì)肌肉生長的貢獻(xiàn)，會(huì)因魚類種類和最終體型的不同而異[9-11]。如斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)等生長緩慢的小體型魚類，肌肉生長主要依賴于肌纖維肥大，而不是肌纖維的增生；而生長迅速的大體型魚類，如牙鲆(Parallichthysolivaceus)，肌肉的生長則既依賴于肌纖維的增生，也依賴于肌纖維的肥大[9, 12-13]。

魚類肌肉的增生過程分為兩個(gè)階段:第一階段為分層增生，主要發(fā)生在胚胎期，為不同類型肌肉分層的過程[14-15]；第二階段為“馬賽克”增生階段，主要發(fā)生在幼魚階段，此時(shí)肌纖維的橫截面會(huì)出現(xiàn)大量的新生纖維[16]。有研究指出，不同物種的“馬賽克”增生階段不同，在小型魚類如斑馬魚、青鳉中，“馬賽克”增生時(shí)間很短甚至缺失[17-18]。魚類骨骼肌占體重的40%～60%[19-20]，而在大型的快速生長的魚類中，增生一直持續(xù)到成年期甚至貫穿一生[21-24]，如非洲錘形石首魚(Atractoscionaequidens)，孵化后前幾天增生纖維約占纖維總數(shù)的93%，且增生纖維所占比率隨著魚體的發(fā)育而逐漸降低，直至達(dá)到最大體型[25]。還有一些魚類在整個(gè)胚后發(fā)育過程主要依賴肌纖維肥大生長，甚至在肌纖維停止募集后，肥大生長能夠持續(xù)進(jìn)行[26]，如金頭鯛(Sparusaurata)，從幼魚到成魚階段肌纖維直徑發(fā)生巨大變化，但其不同的發(fā)育階段肥大生長比率也存在顯著差異[27]。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)是一種冷溫性底層巖礁肉食性魚類，因肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、抗病力強(qiáng)，已成為中國北方重要的經(jīng)濟(jì)魚類[28-29]。對(duì)于許氏平鲉等重要的大型經(jīng)濟(jì)魚類，肌肉生長為生長性狀的核心，但目前針對(duì)許氏平鲉肌肉生長規(guī)律的研究甚少。本研究利用組織切片染色，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期許氏平鲉的肌肉生長特征進(jìn)行觀察及統(tǒng)計(jì)分析，掌握許氏平鲉肌肉的生長發(fā)育規(guī)律，對(duì)后續(xù)研究許氏平鲉肌肉生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用許氏平鲉樣品購買于青島貝寶海洋科技有限公司。取樣共計(jì)12次，包括許氏平鲉幼魚至性成熟階段，分別為30、40、50、60、70、80、90及100 d post-birth (dpb)、1齡魚以及性成熟后的2、3、4齡魚。每次對(duì)30尾魚進(jìn)行體長、體寬及體厚的測量，并進(jìn)行編號(hào)記錄。取樣之前，使用麻醉劑MS-222(20 mg/L)將其麻醉。幼魚(各10尾)取背鰭最后一根鰭條后的整個(gè)軀干部位，不同年齡的許氏平鲉(各5尾)取背鰭中點(diǎn)以下水平膈肌上方的肌肉樣品。樣品保存于4%多聚甲醛過夜，梯度甲醇脫水，最后保存在甲醇溶液中置于-20 ℃，用于組織切片制備。

1.2 方法

1.2.1 組織切片的制備 將置于-20 ℃甲醇溶液中的肌肉樣品取出，用干凈無菌的刀片切成2～3 mm3大小的組織塊；經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明，用石蠟將組織塊進(jìn)行包埋，用徠卡RM2016手搖式切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為4～5 μm，經(jīng)60 ℃水浴展片，37 ℃烘干過夜。將切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，蘇木精-伊紅HE染色，最后用中性樹膠封片，置于室溫晾干后保存。

1.2.2 肌纖維形態(tài)學(xué)觀察分析與數(shù)據(jù)處理 隨著許氏平鲉肌肉生長發(fā)育，體軸前后、側(cè)線上下部位的肌肉生長存在差異，對(duì)于30～100 dpb幼魚，本文統(tǒng)一選取背鰭起點(diǎn)下背側(cè)第二肌節(jié)內(nèi)的肌纖維進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。通過肌纖維數(shù)目增多與肌纖維面積增大來反映肌纖維增生與肥大生長，將肌纖維面積數(shù)據(jù)中排序數(shù)值較小的部分判定為新增生肌纖維，結(jié)合肌纖維的新增數(shù)目得到增生面積。肥大面積是指已有肌纖維尺寸增大而增加的面積，運(yùn)用相對(duì)增加面積減增生面積，可得到肥大面積。而增生生長與肥大生長的貢獻(xiàn)率分別為增生面積與肥大面積在相對(duì)增加面積中所占比例。對(duì)于1～4齡的成魚，很難觀察到完成的背部橫切面，統(tǒng)一選取背鰭終點(diǎn)下、水平肌隔上方的白肌進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣本測量300根肌纖維。使用尼康A(chǔ)Z100熒光顯微鏡觀察HE染色結(jié)果，NIS-Elements Viewer圖像軟件統(tǒng)計(jì)肌纖維的直徑和面積，利用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。為了評(píng)估許氏平鲉不同年齡白肌中肌纖維增生與肥大的貢獻(xiàn)，本研究將肌纖維直徑劃分為3類：class1，d≤20 μm; class2，20 μm

2 結(jié)果

2.1 許氏平鲉幼魚肌肉生長規(guī)律分析

2.1.1 許氏平鲉幼魚肌纖維形態(tài)學(xué)觀察 為了探究許氏平鲉在幼魚期的肌肉生長規(guī)律，我們對(duì)孵化后100 d內(nèi)共計(jì)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)(30、40、50、60、70、80、90及100 dpb)的許氏平鲉的肌肉進(jìn)行組織切片制備及觀察，結(jié)果如圖1所示，肌纖維的橫切面呈現(xiàn)出不規(guī)則的多角狀(見圖1 A～D)。通過觀察不同日齡的許氏平鲉肌肉縱切圖(見圖2 A～D)可以發(fā)現(xiàn)，隨著許氏平鲉肌肉發(fā)育，肌節(jié)逐漸變寬。

(A. 30 dpb肌纖維縱切面；B. 60 dpb肌纖維縱切面；C. 80 dpb肌纖維縱切面；D. 100 dpb肌纖維縱切面。標(biāo)尺均為100 μm。A. Fibers cross section at 30 dpb; B. Fibers cross section at 60 dpb; C. Fibers cross section at 80 dpb; D. Fibers cross section at 100 dpb. Scale bar=100 μm.)

(A.30 dpb肌纖維橫切面；B. 60 dpb肌纖維橫切面；C. 80 dpb肌纖維橫切面；D. 100 dpb肌纖維橫切面。標(biāo)尺均為100 μm。A. Fibers cross section at 30 dpb; B. Fibers cross section at 60 dpb; C. Fibers cross section at 80 dpb; D. Fibers cross section at 100 dpb. Scale bar=100 μm.)

2.1.2 許氏平鲉幼魚肌纖維形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析 不同日齡許氏平鲉背側(cè)第二肌節(jié)內(nèi)肌纖維的生長特征如表1所示，結(jié)果表明在30～100 dpb期間，隨許氏平鲉體長、肌纖維數(shù)目、直徑及橫截面積隨著生長天數(shù)的顯著增加，體長由(1.10±0.13) cm 增至(5.33±0.25) cm(n=10)，肌纖維數(shù)目由(229.83±6.73)個(gè)增至(527.18±13.40)個(gè)(n=10)，而肌纖維總面積也由(11 657±748.39) μm2增至(334 013.99±2 098.31) μm2(n=10)。通過組織切片觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示(見圖3)，在30～100 dpb期間，許氏平鲉背側(cè)第二肌節(jié)內(nèi)肌纖維相對(duì)增加面積、肥大面積以及增生面積在相對(duì)增加面積中所占的比例在不同時(shí)期表現(xiàn)不同。30～70 dpb期間，肌纖維增生生長的相對(duì)貢獻(xiàn)率較低，70～90 dpb期間，肌纖維相對(duì)增加數(shù)目逐漸增多，增生面積在相對(duì)增加面積中所占比例逐漸上升，在90 dpb時(shí)增生生長貢獻(xiàn)率為(36±1.27)%(n=10)(見圖4)?？傊麟A段許氏平鲉的肌纖維肥大面積在相對(duì)增加面積中所占比例均高于增生面積。因此許氏平鲉早期肌肉生長發(fā)育主要依賴肌纖維的肥大生長。

圖4 許氏平鲉不同日齡肌纖維肥大生長與增生生長貢獻(xiàn)比例

圖3 許氏平鲉不同日齡肌肉發(fā)育變化趨勢

表1 不同日齡許氏平鲉生長性狀及肌纖維形態(tài)的統(tǒng)計(jì)分析

2.2 許氏平鲉成魚肌肉生長規(guī)律分析

2.2.1 不同年齡許氏平鲉肌纖維形態(tài)學(xué)觀察及統(tǒng)計(jì)分析 為了掌握許氏平鲉成魚的肌肉生長發(fā)育規(guī)律，我們制備了1、2、3、4齡的白肌組織切片并進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖5所示，可以看出，許氏平鲉的肌纖維直徑和橫截面積隨年齡推移而逐漸增大，且肌纖維之間的空隙也逐漸增寬。如圖(見圖5 A′～B′)所示，1齡及性成熟后的2齡的許氏平鲉白肌中存在明顯的“馬賽克”增生現(xiàn)象，而在 3、4齡的許氏平鲉白肌中肌纖維增生現(xiàn)象不明顯(見圖5 C′～D′)。對(duì)不同年齡許氏平鲉肌纖維直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(見圖5)，許氏平鲉白肌中新生纖維(直徑小于20 μm)所占比例隨著年齡增大而逐漸降低，在1齡許氏平鲉白肌中新生纖維所占比例為80%左右，其余部分為直徑20～50 μm的肌纖維；在2齡的許氏平鲉白肌中，直徑為20～50 μm的肌纖維占比最多，而新生纖維與直徑大于50 μm的肌纖維所占比例相當(dāng)；在3齡的許氏平鲉白肌中，同樣是直徑為20～50 μm的肌纖維占比最多，但直徑大于50 μm的肌纖維占比明顯增多；而在4齡的許氏平鲉白肌中，直徑大于50 μm的肌纖維占比最多，但肌肉中依然存在新生的肌纖維。

(A～D分別為1～4齡許氏平鲉的耳石示意圖；A′～D′分別為1～4齡許氏平鲉白肌橫切示意圖。標(biāo)尺為100 μm。A～D represents the otolith of the black rockfish from 1 to 4 years old，respectively. A′～D′ represents cross section of white muscle of the black rockfish from 1 to 4 years old; Black star indicates the mosaic area. Scale bar=100 μm.)

3 討論

3.1 許氏平鲉幼魚肌肉生長發(fā)育規(guī)律研究

魚類肌肉生長發(fā)育不同于哺乳動(dòng)物僅存在肌纖維增大的肌肉生長方式，而是既可以通過“馬賽克”增生的方式增加肌纖維的數(shù)量，又可以通過增加肌纖維的尺寸大小達(dá)到肌肉肥大生長的目的[8,25]。因此，分析肌肉生長過程中肌纖維的數(shù)目、直徑及面積大小的變化成為探究魚類肌肉生長發(fā)育的重要方法[30]。魚類肌肉生長發(fā)育過程中肌肉的生長速率存在種間差異，本文通過對(duì)許氏平鲉幼魚階段肌肉生長發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，30～100 dpb期間，許氏平鲉的體長、肌纖維的數(shù)目、直徑及橫截面積隨著日齡的增加而顯著增大，且在各發(fā)育階段的肥大面積與增生面積所占比重不同，肥大生長的相對(duì)貢獻(xiàn)率明顯高于增生生長，因此許氏平鲉幼魚肌肉發(fā)育階段的主要?jiǎng)恿κ羌±w維肥大，但同時(shí)存在肌纖維數(shù)目的增加。在研究黑鱸(Micropterussalmoides)白肌的發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，整個(gè)發(fā)育階段都可以觀察到肌纖維增生的現(xiàn)象，但新生纖維的比例在不斷降低，說明在黑鱸幼魚成長為成魚的過程中，還是以肌纖維的肥大為主[25]。而鱖魚(Sinipercachuatsi)肌肉生長發(fā)育的過程中，隨著日齡的增加，肌纖維增生與肥大對(duì)肌肉生長的相對(duì)貢獻(xiàn)率存在較大差異。在1～9 dpb肥大面積占比快速增加，而增生面積大幅度下降；隨后9～15 dpb期間，增生生長呈現(xiàn)上升趨勢，肥大生長逐漸下降；而在15～41 dpb階段，肌纖維的肥大面積比例再次快速上升，增生面積比例逐漸降低后趨于平穩(wěn)，由此可見，鱖魚發(fā)育后期骨骼肌生長的主要方式為肌纖維肥大[31]。

3.2 許氏平鲉成魚肌肉發(fā)育規(guī)律研究

脊椎動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育過程中，如果存在大量直徑<20 μm 的肌纖維，代表肌纖維數(shù)目增加的生長方式較活躍[9,30]，如果缺乏直徑<20 μm的肌纖維，則代表肌肉對(duì)肌纖維的募集能力消失，肌纖維數(shù)目不再增加[32]。多項(xiàng)研究證明，大體型硬骨魚的肌肉生長呈現(xiàn)兼有肌纖維數(shù)目增加和肌纖維肥大的無限生長模式[30]。比如牙鲆、褐鱒(Salmontrutta)等，其生長速度較快，肌肉生長的動(dòng)力包括肌纖維的肥大與肌纖維增生[12-13]。而許多體型較小的魚類，比如斑馬魚，胚后肌肉生長僅來源于肌纖維的肥大[5, 33]。本研究通過對(duì)不同年齡許氏平鲉白肌的組織學(xué)觀察，初步探究了成魚肌肉的生長規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，在1齡的許氏平鲉白肌中，新生肌纖維所占比例最大，表明在1齡到性成熟的生長階段，許氏平鲉肌纖維募集能力最強(qiáng)。隨著年齡的增加，新生肌肉纖維所占比例逐漸下降，然而在4齡的許氏平鲉白肌中，我們同樣也觀察到存在直徑小于20 μm的肌纖維。據(jù)此，我們推測許氏平鲉肌肉呈現(xiàn)無限生長模式，且不同年齡許氏平鲉的肌肉都具備募集肌纖維的能力，但這種能力會(huì)隨生長而逐漸減弱。

綜上所述，本研究對(duì)許氏平鲉幼魚及成魚的肌肉生長特征及規(guī)律進(jìn)行了初步探究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，許氏平鲉肌肉的生長來源于肌纖維數(shù)目的增加及肌纖維肥大，且在早期肌肉發(fā)育過程中肌纖維肥大占主要優(yōu)勢。新增生而來的肌纖維存在于各個(gè)年齡的許氏平鲉中，包括性成熟以后的個(gè)體，這為許氏平鲉肌肉呈現(xiàn)無限生長提供了證據(jù)，為后續(xù)研究其肌肉無限生長的分子調(diào)控提供了基礎(chǔ)。