喻紅稠，韓長(zhǎng)志,2*

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224;2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

禾谷炭疽菌Colletotrichumgraminicola(Cesati)Wilson作為一種半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌[1-3]，該生活方式為其侵染玉米、小麥、高粱等諸多禾本科作物提供了重要的基礎(chǔ)[4-5]，由該菌引起的炭疽病，在中國(guó)、美國(guó)等國(guó)家發(fā)生非常普遍，嚴(yán)重制約著農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失[6]。據(jù)估計(jì)，該菌每年導(dǎo)致玉米產(chǎn)量降低高達(dá)40%，相當(dāng)于美國(guó)一年損失10億美元[2]。隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展[7]，該菌全基因組序列的公布，極大地促進(jìn)了中外對(duì)禾谷炭疽菌的研究，前人研究主要集中在其侵染過程、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、致病基因、生物學(xué)特性分析等方面[6,8]。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)是數(shù)量最多的一大類具有典型的七跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白受體[9]，具有7個(gè)顯著的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)[10]，存在于大多數(shù)真核生物中[11]，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要作用，即主要將胞外跨膜信號(hào)傳遞到胞內(nèi)區(qū)域[11-13]，調(diào)節(jié)細(xì)胞的一系列生理生化活動(dòng)。目前，學(xué)術(shù)界關(guān)于禾谷炭疽菌中GPCR的研究較少，本研究小組已報(bào)道了關(guān)于該菌的4個(gè)GPCR[5]、14-3-3蛋白[14]、分泌蛋白[15]、磷酸二酯酶[8]、G蛋白信號(hào)途徑相關(guān)蛋白[16]等，其他研究者也報(bào)道了禾谷炭疽菌的CgRab5A的亞細(xì)胞定位[2]、Rab蛋白家族[17]、氨基酸通透酶GAP3基因的功能[18]等研究。另外，對(duì)釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉[19]、稻瘟菌[20]、大豆疫霉等GPCR也有研究，如大豆疫霉GPCR候選編碼基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與轉(zhuǎn)錄分析，在大豆疫霉、橡樹疫霉和致病疫霉中分別已挖掘出大量的GPCR候選編碼基因[21]，為明確GPCR在一些生理生化過程中的功能解析奠定基礎(chǔ)。然而，關(guān)于禾谷炭疽菌候選GPCR的生物信息分析尚未見報(bào)道，嚴(yán)重制約植物病原絲狀真菌中GPCR相關(guān)蛋白的功能研究。前期，基于GPCR所具有的典型七跨膜結(jié)構(gòu)域特性，通過TMHMM、Philius和TOPCONS三種常用軟件對(duì)禾谷炭疽菌中全基因組蛋白序列進(jìn)行在線分析，明確該菌中具有七跨膜結(jié)構(gòu)域特征的蛋白數(shù)量有243個(gè)，進(jìn)一步結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域、預(yù)測(cè)功能分析等，最終明確該菌中含有220個(gè)候選GPCR蛋白。

基于前期所獲得的禾谷炭疽菌中220個(gè)候選GPCR蛋白序列，現(xiàn)利用SignalP、ProtParam、ProtScale以及MEGA等程序?qū)ζ湫盘?hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性以及遺傳關(guān)系等進(jìn)行分析，以期為后期分析候選GPCR蛋白在該菌中的功能研究提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

禾谷炭疽菌中220個(gè)候選GPCR蛋白序列。

1.2 方法

1.2.3 候選GPCR蛋白生物信息學(xué)分析

(1)信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用SignalP 5.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[22]在線進(jìn)行信號(hào)肽的分析。

(2)理化性質(zhì)分析。利用ProtParam (https://web.expasy.org/protpara m/)程序在線進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均親水性等[23]。

(3)疏水性分析。利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)程序在線分析蛋白質(zhì)的疏水性[23]。

(4)遺傳關(guān)系分析。利用MEGA_X_10.1.8軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[5,17]。

(5)相互作用關(guān)系分析。利用STRING v.11在線數(shù)據(jù)庫開展相互作用預(yù)測(cè)，尋找蛋白-蛋白相互作用關(guān)系[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

通過對(duì)禾谷炭疽菌中220個(gè)候選GPCR蛋白(涉及含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域但不含有信號(hào)肽序列或者含有信號(hào)肽序列的具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白)中信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，僅有7個(gè)候選GPCR蛋白含有信號(hào)肽，ID號(hào)分別為XP_008088898.1、XP_008091374.1、XP_008095233.1、XP_008095290.1、XP_008097275.1、XP_008098329.1、XP_008099709.1，所占比例為3.18%。其中，ID號(hào)為XP_008088898.1具有七跨膜結(jié)構(gòu)蛋白(TOPCONS和Philius分析)，XP_008091374.1、XP_008095233.1、XP_008099709.1等蛋白具有八跨膜結(jié)構(gòu)蛋白(TOPCONS分析)，XP_008095290.1、XP_008097275.1、XP_008098329.1是具有八跨膜結(jié)構(gòu)蛋白(TMHMM分析)。進(jìn)一步對(duì)7個(gè)候選GPCR信號(hào)肽長(zhǎng)度進(jìn)行分析，明確信號(hào)肽長(zhǎng)度集中在19～22個(gè)氨基酸，其中信號(hào)肽長(zhǎng)度最多的為19個(gè)氨基酸，蛋白數(shù)量為3個(gè)，所占比例為42.86%；其次是長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸，蛋白數(shù)量為2個(gè)，所占比例為28.57%；長(zhǎng)度為23個(gè)氨基酸、28個(gè)氨基酸，蛋白數(shù)量均為1個(gè)，所占比例均為14.29%。

2.2 理論等電點(diǎn)分析

對(duì)候選GPCR蛋白的理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，XP_008092362.1具有最高理論等電點(diǎn)，為10.28；XP_008099443.1具有最低理論等電點(diǎn)，為4.97，進(jìn)一步以理論等電點(diǎn)1.00為1個(gè)間隔單位，對(duì)全部候選GPCR蛋白進(jìn)行分類匯總，結(jié)果表明，上述候選GPCR蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)主要集中于9.01～10.00，其數(shù)量為78個(gè)，所占比例為35.45%；其次集中在8.01～9.00的候選GPCR蛋白有67個(gè)，所占比例為30.45%。理論等電點(diǎn)為4.01～5.00、5.01～6.00、6.01～7.00、7.01～8.00、10.01～11.00，候選GPCR蛋白數(shù)量分別為2、20、30、18、5個(gè)，所占比例分別為0.91%、9.09%、13.64%、8.18%、2.27%(圖1)。同時(shí)，對(duì)屬于酸性蛋白質(zhì)(理論等電點(diǎn)小于6.01)的候選蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其數(shù)量為22個(gè)，所占比例為10.00%；對(duì)屬于中性蛋白(理論等電點(diǎn)位于6.01～8.00)的分泌蛋白進(jìn)行分析，其數(shù)量為48個(gè)，所占比例為21.82%；對(duì)屬于堿性蛋白質(zhì)(理論等電點(diǎn)大于8.00)的候選蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，其數(shù)量為150個(gè)，所占比例為68.18%。上述結(jié)果表明，候選蛋白質(zhì)中酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)數(shù)量分布不均勻。對(duì)含有信號(hào)肽的7個(gè)候選GPCR理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析，得出理論等電點(diǎn)<6.01蛋白數(shù)量為1個(gè)(屬酸性蛋白)，理論等電點(diǎn)在6.01～8.00蛋白數(shù)量為3個(gè)(屬中性蛋白)，理論等電點(diǎn)>8.00蛋白數(shù)量為3個(gè)，7個(gè)候選GPCR多屬于中性或堿性蛋白。

圖1 禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白理論等電點(diǎn)的分布情況Fig.1 Distribution of theoretical isoelectric point of candidate GPCR protein in C.graminicola

2.3 不穩(wěn)定系數(shù)分析

通過對(duì)禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白中的不穩(wěn)定性系數(shù)分析，結(jié)果表明，XP_008097524.1的不穩(wěn)定系數(shù)值最大，其不穩(wěn)定性系數(shù)為62.26；XP_008098852.1的不穩(wěn)定系數(shù)值最小，其不穩(wěn)定性系數(shù)為21.11。不穩(wěn)定性系數(shù)主要集中在40.01～50.00，其蛋白質(zhì)有97個(gè)，所占比例為44.09%。次要集中在30.01～40.00，蛋白數(shù)量為84個(gè)，所占比例為38.18%。其余不穩(wěn)定系數(shù)在<30.00、50.01～60.00、>60.00的蛋白數(shù)量分別為12、26、1個(gè)，所占比例分別為5.45%、11.82%、0.45%(圖2)。同時(shí)，不穩(wěn)定性系數(shù)小于40.01(穩(wěn)定蛋白質(zhì))的GPCR有96個(gè)，所占比例為43.64%；不穩(wěn)定性系數(shù)大于或等于40.00(不穩(wěn)定蛋白質(zhì))的GPCR有124個(gè)，所占比例為56.36%。上述結(jié)果表明，候選GPCR蛋白在穩(wěn)定性和不穩(wěn)定性方面所占比例相當(dāng)，推測(cè)其具有不同的功能特征。

圖2 禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白不穩(wěn)定性分布情況Fig.2 Distribution of candidate GPCR protein instability in C.graminicola

2.4 疏水性特征分析

對(duì)上述220個(gè)候選GPCR進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果表明，親水性蛋白質(zhì)(親水性值小于0)，蛋白數(shù)量為45個(gè)，所占比例為20.91%；疏水性蛋白(親水性值大于0)，蛋白數(shù)量為174個(gè)，所占比例為79.09%。進(jìn)一步對(duì)上述蛋白親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，明確親水性最強(qiáng)的有18種氨基酸殘基，存在較多的是R(精氨酸)、E(谷氨酸)、K(賴氨酸)3種氨基酸殘基，蛋白數(shù)量分別為50、38、32個(gè)，所占比例分別為20.66%、15.70%、13.22%(圖3)；疏水性最強(qiáng)的有13種氨基酸殘基，存在較多的是L(亮氨酸)、V(纈氨酸)、I(異亮氨酸)、A(丙氨酸)4種氨基酸殘基，蛋白數(shù)量分別為52、50、37、32個(gè)，所占比例分別為22.32%、21.46%、15.88%、13.73%(圖4)。

圖3 禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白親水性和疏水性氨基酸殘基分布情況Fig.3 Distribution of hydrophilic and hydrophobic amino acid residues of candidate GPCR proteins in C.graminicola

對(duì)具有信號(hào)肽的7個(gè)候選GPCR進(jìn)行親水性分析，均屬于疏水性蛋白，親水性最強(qiáng)氨基酸為S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、P(脯氨酸)、Y(酪氨酸)、K、E、R共7種氨基酸，存在較多的是S，疏水性最強(qiáng)氨基酸C(半胱氨酸)、F(苯丙氨酸)、V、T、G(甘氨酸)、I、S共7種氨基酸，其數(shù)量均衡。

2.5 遺傳關(guān)系分析

對(duì)220個(gè)候選GPCR蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源序列分析并進(jìn)行遺傳關(guān)系解析，結(jié)果表明，禾谷炭疽菌中候選GPCR明顯分為三大類(圖4中的A、B、C，ID號(hào)為紅色的蛋白是7個(gè)具有信號(hào)肽的候選GPCR)，其中最多的是假定蛋白(hypothetical protein)。為了進(jìn)一步明確上述蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域與遺傳關(guān)系之間的關(guān)系，從上述三大類候選GPCR蛋白中各選擇5個(gè)蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，均無明顯的保守結(jié)構(gòu)域，僅含有數(shù)量不等的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖5)。

圖4 禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白的遺傳關(guān)系Fig.4 Genetic relationship of candidate GPCR proteins in C.graminicola

圖5 禾谷炭疽菌中部分候選GPCR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域情況Fig.5 Conserved domains of candidate GPCR proteins in C.graminicolas

2.6 相互作用關(guān)系分析

前人研究發(fā)展，蛋白質(zhì)主要通過自身或是與其他蛋白質(zhì)等形成復(fù)合體來執(zhí)行生物學(xué)功能。通過STRING在線分析蛋白——蛋白互作關(guān)系，明確不同蛋白之間存在著較為緊密的關(guān)系(圖6)，進(jìn)一步選擇具有核心相互作用關(guān)系的GLRG_05787、GLRG_04512、GLRG_04171、GLRG_10567、GLRG_02030、GLRG_00022、GLRG_07391、GLRG_05683、GLRG_18008、GLRG_18009、GLRG_03657、GLRG_05394、GLRG_05322、GLRG_01849、GLRG_03748、GLRG_00376、GLRG_08672、GLRG_02620、GLRG_05948、GLRG_08500、GLRG_04939、GLRG_09992、GLRG_03678、GLRG_06302、GLRG_04841、GLRG_11173、GLRG_03011、GLRG_02235、GLRG_04562以及GLRG_05637、GLRG_06940等蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，上述蛋白存在著較為緊密的相互作用關(guān)系(圖7)，該研究結(jié)果為進(jìn)一步解析禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白的互作用關(guān)系提供重要的理論參考。

圖6 候選GPCR蛋白互作關(guān)系Fig.6 Candidate GPCR protein interaction

圖7 禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白互作關(guān)系分析Fig.7 Analysis of interaction between candidate GPCR proteins in C.graminicola

3 結(jié)論與討論

GPCR作為僅具有七跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白，對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用，其會(huì)影響著真菌一系列的生理生化作用。前人對(duì)于GPCR蛋白的預(yù)測(cè)分析，僅能依靠跨膜結(jié)構(gòu)域、同源比對(duì)等開展相關(guān)工作，同時(shí)，對(duì)于蛋白理化性質(zhì)、信號(hào)肽等研究也開展了諸多生物信息學(xué)分析軟件的開發(fā)利用等。本研究基于前期所獲得禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白序列，利用較為成熟的生物信息學(xué)分析軟件開展了上述蛋白的信號(hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性以及保守結(jié)構(gòu)域等方面的研究工作，有效地實(shí)現(xiàn)了該菌中候選GPCR蛋白性質(zhì)明確，為進(jìn)一步開展該菌中GPCR蛋白找尋及功能分析提供了重要的理論支撐。

與前期所開展的蛋白生物信息學(xué)分析相比，研究較好地實(shí)現(xiàn)了GPCR蛋白的信號(hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性和遺傳關(guān)系等特性分析，與前期利用釀酒酵母中GPCR蛋白序列為基礎(chǔ)根據(jù)同源序列比對(duì)情況所獲得候選GPCR相比，以及對(duì)其特性研究相比，研究較好地實(shí)現(xiàn)了全部候選GPCR蛋白的諸多特性研究，有效地解決了禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白的性質(zhì)不明等問題，為深入開展其他植物病原真菌中候選GPCR蛋白特性解析提供了重要的理論指導(dǎo)。同時(shí)，近期研究發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲中有部分GPCR蛋白可以通過控制UPR和p38MAPK信號(hào)通路來控制免疫穩(wěn)態(tài)[25]，而研究中所發(fā)現(xiàn)的候選GPCR蛋白并未與上述蛋白信號(hào)通路發(fā)生明顯關(guān)系，有待于進(jìn)一步開展互作蛋白找尋及功能分析提供重要的理論支撐。在酵母中有3個(gè)GPCR蛋白，其中2個(gè)可作為激酶，1個(gè)可作為感應(yīng)器[26]，而對(duì)于禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白功能的解析，特別是蛋白互作通路方面的解析將是未來研究的重點(diǎn)。前人明確禾谷鐮刀菌中85個(gè)候選GPCR蛋白與其生長(zhǎng)及產(chǎn)孢等生物過程調(diào)控密切相關(guān)，推測(cè)不同蛋白具有功能的冗余性[9]，而本研究中禾谷炭疽菌中220個(gè)候選GPCR蛋白在理化性質(zhì)方面存在著諸多相似性特征，推測(cè)其也具有功能冗余性。

基于前期所獲得的220個(gè)候選GPCR蛋白，對(duì)其進(jìn)行生物信息分析，明確7個(gè)具有七跨膜結(jié)構(gòu)域含有信號(hào)肽的候選GPCR蛋白，多屬于中性或堿性蛋白，不穩(wěn)定性分布相對(duì)均勻且全是疏水性蛋白，同時(shí)，明確了上述候選GPCR蛋白之間存在著較為相近的親緣關(guān)系。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)禾谷炭疽菌中候選GPCR蛋白的功能研究提供重要的理論依據(jù)，也為實(shí)現(xiàn)同屬于炭疽菌屬中核桃炭疽病菌中GPCR蛋白功能解析提供重要的理論指導(dǎo)。