劉起 馮元勇 葛勝優(yōu) 尚偉

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，山東 青島 266003； 2 高密市人民醫(yī)院口腔科)

口腔鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其中舌鱗癌是最常見的口腔腫瘤[1-2]。治療方式主要有手術(shù)以及放化療，患者5年的生存率約為50%[3-4]。泛素水解酶-22(USP-22)是泛素特異性加工酶家族的成員，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及激活基因轉(zhuǎn)錄等過程，與食管癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5-8]。但是USP-22基因與舌鱗癌生物學(xué)行為的相關(guān)性報道較少。本研究通過對臨床舌鱗癌患者腫瘤組織中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并探討siRNA-USP-22沉默質(zhì)粒對人舌鱗癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，以期為臨床上舌鱗癌的治療提供新的靶點。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1

人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113 細(xì)胞及 Tb 細(xì)胞均購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清(以色列BI公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)；CCK-8試劑盒以及Transwell試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.2

選取2014年2月—2019年7月青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的21例舌鱗癌患者(男11例，女10例)的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本，將標(biāo)本置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的甲醛溶液中，Bouin氏固定液固定，乙醇脫水后制備成蠟塊，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3

將收集到的舌鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本，根據(jù)病理檢測結(jié)果分為癌旁組織(對照組)21例，舌鱗癌高分化組(高分化組)11例及舌鱗癌中低分化組(中低分化組)10例。對所有標(biāo)本按照試劑盒說明書進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色處理，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4

先將人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113 細(xì)胞以及Tb細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)60%以上時棄掉含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，給予去極化處理，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.5

利用PubMed基因庫篩選USP-22基因序列，設(shè)計USP-22基因擴(kuò)增序列，以環(huán)狀RNA為載體，構(gòu)建沉默該基因的siRNA質(zhì)粒，慢病毒包裝后進(jìn)行后續(xù)舌鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，將細(xì)胞分為TCA8113細(xì)胞對照組(A組)、TCA8113細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組(B組)、TCA8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染組(C組)及Tb細(xì)胞對照組(D組)、Tb細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組(E組)、Tb細(xì)胞轉(zhuǎn)染組(F組)。C組和F組細(xì)胞給予慢病毒包裝的siRNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，感染復(fù)數(shù)為50，慢病毒滴度為3×1010U/L，B組和D組細(xì)胞給予慢病毒包裝的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，A組和C組細(xì)胞給予等量PBS溶液作為對照。

1.6

將經(jīng)慢病毒包裝的質(zhì)粒處理72 h后的A～F組細(xì)胞離心，接種于6孔板中，使用無菌10 μL槍頭畫一寬0.5 mm的劃痕，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，分別于0 和12 h在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移距離。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7

將A～F組細(xì)胞按照Transwell試劑盒的說明書要求，配置基質(zhì)膠，與預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基混合，加入結(jié)晶紫染色試劑孵育，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組侵襲細(xì)胞數(shù)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.8

2 結(jié) 果

2.1

染色結(jié)果顯示，對照組組織內(nèi)未見癌巢及角化珠(圖1A)；高分化組癌巢與周圍組織界限清楚，可見癌巢和角化珠(圖1B)；中低分化組癌巢與周圍組織無明顯界限，無明顯角化珠(圖1C)。

A：對照組，B：高分化組，C：中低分化組，200倍

2.2

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組、高分化組以及中低分化組中USP-22蛋白的表達(dá)量分別為1.014±0.001、1.110±0.023、1.131±0.010，ERK5蛋白的表達(dá)量分別為1.143±0.007、1.201±0.014、1.208±0.009，3組間兩種蛋白的表達(dá)量比較差異均具有顯著性(F=377.72、211.29，P<0.05)，其中高分化組和中低分化組中USP-22蛋白和ERK5蛋白的表達(dá)量與對照組比較差異均具有顯著意義(q=22.72～34.13，P<0.05)，高分化組中USP-22蛋白的表達(dá)量與中低分化組比較，差異具有顯著性(q=5.39，P<0.05)。

2.3

A、B和C組細(xì)胞的遷移距離分別為(92.47±2.02)、(98.46±10.48)和(63.34±12.10)μm，3組細(xì)胞遷移距離比較差異具有顯著意義(F=12.21，P<0.05)，其中C組細(xì)胞的遷移距離明顯短于A、B組(q=5.41、6.53，P<0.05)。D、E和F組細(xì)胞的遷移距離分別為(92.72±2.93)、(93.48±3.95)和(73.15±6.45)μm，3組細(xì)胞遷移距離比較差異具有顯著性(F=18.17，P<0.05)，其中F組細(xì)胞遷移距離明顯短于D、E組(q=7.24、7.52，P<0.05)。

2.4

A、B和C組侵襲細(xì)胞的數(shù)量分別為(61.33±3.81)、(59.31±3.07)和(36.03±4.15)個，3組細(xì)胞侵襲能力比較差異具有顯著意義(F=43.22，P<0.05)，其中C組細(xì)胞的侵襲能力明顯低于A、B組(q=11.83、10.89，P<0.05)。D、E和F組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為(99.18±2.18)、(98.32±2.61)和(69.87±10.69)個，3組細(xì)胞侵襲能力比較差異具有顯著性(F=19.90，P<0.05)，其中F組細(xì)胞侵襲能力明顯低于D、E組(q=7.84、7.61，P<0.05)。

3 討 論

舌鱗癌是臨床上常見的口腔腫瘤，目前針對舌鱗癌僅局限于手術(shù)切除腫瘤并結(jié)合放化療進(jìn)行綜合治療，對于晚期的舌鱗癌患者，手術(shù)效果欠佳，5年生存率較低[9]。因此，需要尋找更為準(zhǔn)確的分子標(biāo)志物，從而做到早期診斷和早期治療，這對提高患者的預(yù)后非常重要。

USP-22是泛素蛋白特異性蛋白酶家族中的一員,屬于去泛素酶家族。泛素特異性蛋白酶是去泛素酶家族中最大且最具特異性的亞家族,具有物種和組織特異性,其核心催化域約由350個氨基酸組成。既往研究認(rèn)為，USP-22與人宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化功能密切相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，USP-22基因可以通過Sirt1/JAK/STAT3信號通路介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力[11-12]。USP-22基因還可以介導(dǎo)胰腺癌的自噬過程，USP-22基因敲除實驗顯示，其可以通過促進(jìn)自噬抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡[13-14]。ERK5信號通路是MAPK信號通路中的一員，可以參與細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等過程[15-17]。既往研究表明，ERK5蛋白的差異性表達(dá)與前列腺癌的增殖以及侵襲密切相關(guān)，并且ERK5的過度表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[18-19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，ERK5也與非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20-21]。同時ERK5蛋白在食管鱗癌組織中具有差異性表達(dá)的特點，可以作為分子標(biāo)志物。但是，USP-22和ERK5在舌鱗癌發(fā)生中的作用鮮有報道。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測舌鱗癌患者的癌旁組織、高分化以及中低分化舌鱗癌組織中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，高分化組和中低分化組中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá)量均顯著高于對照組，相較于癌旁組織，高分化和中低分化舌鱗癌組織中可以檢測到USP-22和ERK5的高表達(dá)，提示USP-22和ERK5可以作為舌鱗癌的生物標(biāo)志物，對其早期診斷和早期治療起到一定的提示作用。

為進(jìn)一步揭示舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移機(jī)制，本研究選取了兩種舌鱗癌細(xì)胞系，即人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113細(xì)胞及Tb細(xì)胞作為研究對象，應(yīng)用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測siRNA沉默質(zhì)粒對上述兩種細(xì)胞的侵襲與遷移能力的影響。結(jié)果證明，siRNA沉默質(zhì)粒沉默USP-22基因表達(dá)后，可以有效抑制舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

綜上所述，USP-22與ERK5可以作為舌鱗癌早期診斷的生物標(biāo)志物，siRNA-USP-22沉默USP-22基因表達(dá)后可以有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。但本研究中臨床樣本例數(shù)較少，而且侵襲與遷移能力的測試均是進(jìn)行的體外細(xì)胞實驗，后續(xù)應(yīng)該加大樣本量以及進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗，為臨床提供更加真實可靠的參考數(shù)據(jù)。