李夏林 劉赫 易偉宏

骨關節(jié)炎是一種常見的關節(jié)退行性病變，通常是由于肥胖、勞損、創(chuàng)傷、畸形等因素引起的關節(jié)軟骨退化及損傷，全球約有2.5億人患病，而其中又以膝關節(jié)最易受累。膝骨關節(jié)炎常表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、僵硬，打軟腿，晚期易出現(xiàn)關節(jié)畸形、活動嚴重受限等癥狀。隨著世界人口肥胖、老齡化等問題日益嚴重，膝骨關節(jié)炎發(fā)病率呈增高趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全世界60歲以上人口男性發(fā)病率約為10%，女性發(fā)病率約為13%，患者生活質量明顯下降[1]。目前膝骨關節(jié)炎的治療策略主要為階梯治療。膝骨關節(jié)炎早期可以通過理療、功能鍛煉、口服消炎止痛藥、關節(jié)內注射皮質激素等治療緩解癥狀[2]，改善生活質量。膝骨關節(jié)炎進展到晚期，關節(jié)軟骨磨損嚴重，關節(jié)疼痛嚴重，并可出現(xiàn)關節(jié)畸形，此時只能通過膝關節(jié)置換術來緩解疼痛癥狀，矯正畸形，提高運動能力。目前尚無一種方法能逆轉膝關節(jié)軟骨退變病理過程，從而徹底治愈膝骨關節(jié)炎。

既往觀點認為，膝骨關節(jié)炎始動因素主要為關節(jié)軟骨損傷和退變。近年有研究表明，膝骨關節(jié)炎是由全關節(jié)組織退變及功能失衡造成，其中包括關節(jié)軟骨損傷退變、關節(jié)滑膜炎癥、軟骨下骨重建、關節(jié)韌帶和半月板退變，以及關節(jié)周圍肌肉和神經等病理變化，它們均對膝骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展產生影響[3]。而外泌體是一種由細胞分泌的有膜結構的特殊微小囊泡，它作為一種生物信號傳遞的中介，在細胞間進行信息傳遞，通過各種信號轉導通路調控細胞功能[4]。近年來大量研究表明，不同組織來源的內生性外泌體在膝骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，同時不同干細胞來源的外泌體對膝骨關節(jié)炎能起到保護和治療的作用。

1 外泌體生物學特點

外泌體是一種由細胞分泌的特殊細胞外囊泡。細胞外囊泡包括凋亡小體(直徑500 nm ～2 mm)、微泡(直徑100～1 000 nm)及外泌體(直徑30～150 nm)。有學者最早發(fā)現(xiàn)一種在成因、大小、成分等方面有獨立特點的細胞外囊泡，于是將其單獨分出來并定義為外泌體。外泌體直徑為30～150 nm，含有mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等多種RNA分子，以及脂類、蛋白質、氨基酸等多種生物活性分子[5-6]。外泌體可通過其攜帶的這些生物活性大分子來調節(jié)受體細胞生物學活性，并參與細胞分化、遷移免疫應答、抗原提呈等方面的信號傳遞。

2 外泌體制備及鑒定

分離高純度的外泌體是進行外泌體相關研究的關鍵步驟。目前外泌體分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、過濾法、篩分分離法、免疫分離法、沉淀法等。每種方法都有自己的優(yōu)勢及不足，而其中差速離心法是外泌體分離最常用的技術之一。其步驟主要為低速離心去除細胞及細胞碎片，然后中速離心以去除較大的囊泡，最后高速離心沉淀外泌體。高速離心力一般介于100 000～150 000 ×g 之間，這種方法能分離出純度較高的外泌體，缺點是其過程需要昂貴的高速離心機，同時高速離心也常會影響外泌體結構，從而可能影響實驗結果[7]。

外泌體可以通過形態(tài)學分析、粒子大小分布及特異的結構蛋白分析等方面進行鑒定。透射電鏡分辨率可達0.1～0.2 nm，非常適合外泌體雙層囊膜超微結構的觀測。納米顆粒追蹤分析技術則可以體現(xiàn)樣本中所有外泌體的粒徑分布情況，快速、精準地分析外泌體濃度粒徑，為外泌體存在提供有力證據(jù)。而通過蛋白免疫印跡(Western Blot)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等技術則可以鑒定外泌體中的一些特殊標志性蛋白，如CD9、CD63、CD81、HSP90等，為外泌體進一步研究提供了有力的保障[8]。

3 不同組織來源外泌體對膝骨關節(jié)炎的影響

3.1 軟骨細胞來源外泌體

軟骨細胞是關節(jié)軟骨組織中唯一的細胞種類，多項研究表明軟骨細胞能分泌外泌體并對膝骨關節(jié)炎進展產生影響。Ni等[9]研究發(fā)現(xiàn)，骨關節(jié)炎患者關節(jié)軟骨組織分泌的外泌體能促進巨噬細胞產生白細胞介素(IL)-1β，從而誘導炎癥反應。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞能分泌外泌體，從而促進骨髓間充質干細胞(BMSC)向軟骨細胞分化，而其作用機制是外泌體中的miR-8485通過調控BMSC的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路實現(xiàn)的。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞來源外泌體可以成功誘導軟骨祖細胞在皮下分化成為軟骨組織；體外實驗也證實，該外泌體能在抑制血管生成的同時，促進軟骨祖細胞成軟骨分化，并使軟骨形成特異性標志蛋白表達增加。這些研究結果表明，關節(jié)軟骨細胞能分泌外泌體，軟骨細胞來源外泌體可介導軟骨細胞與靶細胞間的信號傳導，并對膝骨關節(jié)炎病理過程產生重要影響。

3.2 關節(jié)滑膜組織來源外泌體

關節(jié)滑膜對于膝關節(jié)內穩(wěn)態(tài)起了非常重要的作用。Kolhe等[12]在體外關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)中加入骨關節(jié)炎患者關節(jié)液分離出的外泌體，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞合成代謝相關基因表達降低，而分解代謝相關基因表達增加。Domenis等[13]成功從膝關節(jié)病患者關節(jié)液中分離出外泌體，并發(fā)現(xiàn)它能促進M1型巨噬細胞釋放前炎癥因子。這提示關節(jié)液內的外泌體對骨關節(jié)炎進展起促進作用。Zhou等[14]對比骨關節(jié)炎患者及健康人關節(jié)液中外泌體組分，發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)炎組外泌體中miRNA-126-3p表達明顯下降，而miRNA-126-3p能促進軟骨細胞分化和增殖，并抑制IL-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子表達，同時抑制軟骨細胞凋亡。

3.3 其他組織來源外泌體

肌腱是膝關節(jié)結構重要組成部分，其中肌腱干細胞也能產生外泌體，可能對膝骨關節(jié)炎產生影響。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肌腱干細胞及其分泌的外泌體能抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-3及增加基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-3、Ⅰ型膠原蛋白α1表達，從而促進肌腱組織修復。Zhao等[16]用脂多糖預處理牙周韌帶纖維母細胞，然后將其分離出的外泌體作用于MG-63成骨細胞，結果顯示其可上調IL-6及TNF-α水平，并抑制骨保護素生成，從而導致炎癥并抑制骨生成。因此，肌腱及韌帶組織內產生的外泌體均可能對膝骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展產生影響，但其具體作用機制仍需進一步研究。

4 間充質干細胞來源外泌體對膝骨關節(jié)炎的治療作用

既往有眾多研究表明BMSC或脂肪間充質干細胞(AMSC)能促進軟骨細胞再生，有臨床研究顯示其治療膝骨關節(jié)炎的療效良好，但具體分子機制仍不十分清楚。越來越多的研究表明，間充質干細胞對骨關節(jié)炎的治療作用主要來源于其旁分泌的作用，其中就包括外泌體[17]。近期有多項研究表明，不同組織來源的間充質干細胞來源外泌體對骨關節(jié)炎均有明確的治療作用，它能減少軟骨內炎癥因子產生，促進軟骨基質合成，并延緩骨關節(jié)炎進展[18-21]。

4.1 BMSC來源外泌體

BMSC來源外泌體能參與調節(jié)多項生理及病理過程，其中包括免疫反應、血管生成、骨形成等。有研究表明，BMSC來源外泌體能促進損傷組織如軟骨組織及軟骨下骨等修復。Cosenza等[22]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體能誘導骨關節(jié)炎小鼠關節(jié)軟骨細胞產生Ⅱ型膠原蛋白，并抑制炎癥及分解代謝；體內實驗也表明，BMSC來源外泌體對骨關節(jié)炎小鼠關節(jié)軟骨有明顯的保護作用。Qi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體能被軟骨細胞吞入，并抑制IL-1β誘導的線粒體膜電位異常及細胞凋亡。Dong等[24]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體能抑制IL-1β誘導的軟骨細胞損傷作用，這種保護作用是通過外泌體中miR-127-3p先抑制軟骨細胞CDH11，而后抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導通路完成的。Mao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高表達miR-92a-3p的 BMSC來源外泌體能通過抑制WNT5A表達促進軟骨細胞增殖及軟骨基質合成，活體實驗也證實這種外泌體對骨關節(jié)炎小鼠模型關節(jié)軟骨起到明顯的保護作用。因此，通過調控BMSC來源外泌體分泌或通過基因修飾等手段調控外泌體內容物可增強其治療膝骨關節(jié)炎的療效，為以后膝骨關節(jié)炎治療提供了很有前景的新方案。

4.2 滑膜間充質干細胞來源外泌體

許多研究表明，滑膜間充質干細胞(SMSC)來源外泌體也具有較強的促進軟骨細胞分化能力。Zhu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，人SMSC能促進軟骨細胞增殖及遷徙；在膠原酶誘導的骨關節(jié)炎小鼠模型中，關節(jié)腔注射SMSC來源外泌體能明顯延緩骨關節(jié)炎進展。Tao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，SMSC來源外泌體能促進軟骨細胞增殖及遷移，但是它會抑制細胞外基質生成，而高表達miR-140-5p的SMSC來源外泌體則能在促進軟骨細胞增殖的同時，避免對細胞外基質生成的抑制。

4.3 AMSC來源外泌體

由于對膝骨關節(jié)炎患者行關節(jié)鏡手術探查可以較容易地獲取髕下脂肪組織并從中提取AMSC，故近年來用AMSC及從中提取的外泌體治療膝骨關節(jié)炎的研究越來越多。Tofino-Vian等[28]研究發(fā)現(xiàn)，AMSC來源外泌體能下調衰老相關因子β-半乳糖苷酶活性，同時能抑制IL-6及前列腺素(PG)E2等炎性介質釋放，因而對骨關節(jié)炎有保護作用。隨后他們從腹部吸脂手術的患者脂肪中分離提取出AMSC來源外泌體，從骨關節(jié)炎患者中提取關節(jié)軟骨細胞，將軟骨細胞體外培養(yǎng)并添加IL-1β進行刺激，然后進行共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)外泌體能明顯減少TNF-α、IL-6、PGE2 及一氧化氮等炎癥因子釋放，而抗炎因子IL-10及Ⅱ型膠原蛋白表達明顯增多[29]。這一結果與之前的動物實驗結果相吻合。Wu等[30]從小鼠膝關節(jié)髕下脂肪墊中分離出AMSC來源外泌體，回輸入關節(jié)后發(fā)現(xiàn)其能減少細胞凋亡，增加軟骨基質合成，減緩骨關節(jié)炎進展；外泌體的這種保護作用主要源自其內高濃度的miR-100-5p。

5 結語

外泌體在關節(jié)腔內產生及釋放的分子機制尚不十分清楚，目前研究證實不同組織來源的外泌體對膝骨關節(jié)炎產生及發(fā)展都起到了重要的作用，因此探索外泌體在膝骨關節(jié)炎病理發(fā)展過程中的作用機制將有助于篩選潛在的治療靶點。同時間充質干細胞來源外泌體治療膝骨關節(jié)炎也展現(xiàn)出光明的前景。相信未來以外泌體為基礎的治療手段將不斷成熟完善，并使越來越多的膝骨關節(jié)炎患者受益。