何易祥 趙宇昊 高昭 張通 趙海燕 王文己

骨骼系統(tǒng)參與了人體內諸多生理活動的調控，在維持人體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關鍵作用，包括保護及支持其他器官、儲存和調節(jié)礦物質、調節(jié)血液pH值等，其內容納了造血干細胞及多種生長因子[1]。由嚴重外傷、骨骼畸形矯正、骨腫瘤切除等導致的骨結構破壞需采取有效措施進行治療，避免發(fā)生不愈合，影響人體功能[2]。目前臨床上廣泛采用的自體或異體骨移植方法尚存在諸多問題[3]，因此需探究是否有更有效的治療措施?；诮M織工程研制的生物材料可為人體提供具有良好性能、有助于修復受損骨組織、對人體無毒性作用的人工骨材料，在骨缺損修復中發(fā)揮重要作用。近年來隨著基因水平研究的不斷進展，基于DNA分子特點研究有合適結構且具有生物活性的生物材料逐漸成為骨組織工程研究的熱點。

1 DNA納米材料及骨修復

隨著基因研究的不斷進展，基因治療技術被發(fā)現(xiàn)可用于治療多種疾病?；蛑委熜栌奢d體介導進入細胞后發(fā)揮作用，以DNA分子為基礎的DNA納米技術隨之得到發(fā)展。Seeman[4]報道，核苷酸序列將優(yōu)先形成固定的連接而不是線性雙鏈，從而提出“結構納米技術”概念。隨后他們首次自組裝合成了具有雙螺旋結構邊的三維立方體DNA納米結構[5]。此后多種形態(tài)的DNA立體結構被相繼合成[6-12]。

DNA納米結構的可編輯性及生物相容性等特點使其成為基因治療技術的熱點[13]。DNA分子在適宜的條件下，憑借獨特的雙螺旋結構及高度特異性的堿基互補配對原則可進行自組裝，將設計好的單鏈DNA組裝成多種形態(tài)的DNA納米結構。它具有獨特的優(yōu)點：①相較于DNA大分子，易穿透帶負電的細胞膜進入胞內[14]；②由于以人體固有的DNA為原料，幾乎無細胞毒性作用[15]；③有豐富的修飾位點，可攜載多種生物分子進入細胞[16]。

隨著基于納米技術的生物材料被開發(fā)，基因療法被廣泛應用?；虔煼ㄅc骨組織工程相結合，即將成骨相關基因載入生物材料中形成復合體，隨后介導入胞發(fā)揮作用，從而在基因水平上刺激骨組織修復過程。Bara等[17]將強力霉素誘導的Tet-on腺病毒載體與骨髓基質細胞(MSC)、纖維蛋白及雙相磷酸鈣陶瓷(MBCP)相結合用于修復裸鼠骨缺損，體內研究臨界尺寸的股骨缺損中腺病毒BMP-2基因遞送對骨骼愈合的影響，通過調節(jié)強力霉素濃度調控BMP-2的表達，結果顯示實驗組缺損部位新骨形成明顯多于對照組，且不同的載體遞送方法(直接應用與預包被MBCP顆粒)均可達到治療效果，強力霉素誘導的BMP-2表達通過軟骨內骨化作用啟動骨愈合過程。此外，Li等[18]使用摻入BMP-2質粒DNA的殼聚糖納米顆粒修復大鼠和比格犬骨缺損。Pan等[19]使用金納米顆粒作為載體研究miR-29b調節(jié)成骨作用的特性，結果顯示它在人體內幾乎無細胞毒性，且可誘導成骨基因如RUNX2、OPN、OCN、ALP等的長期表達，促進成骨細胞分化和礦化。以上研究均顯示了生物材料介導的基因療法在骨組織修復中的有效性。

2 四面體DNA納米結構組成

四面體DNA納米結構(TDN)材料是一種通過DNA折紙技術形成的具有四面體結構的DNA納米材料。2004年，Goodman等[8]首次設計合成TDN，其具有良好的機械強度和結構穩(wěn)定性，且易于合成。

TDN合成是由4條預先設計相互配對的單鏈DNA等量加入緩沖液中，通過堿基互補配對原則，經成熟的退火法操作，兩兩間相互配對折疊形成四面體。每條單鏈DNA的堿基分為3個小片段，各片段間使用不配對的堿基相隔，以保證頂點具有柔韌性，每條單鏈的1個小片段與另1條單鏈的1個小片段互補配對，形成四面體的1條邊。每條單鏈DNA的5′-端和3′-端交匯于四面體頂點或在邊上形成1個端口，交匯于頂點時，可在單鏈的5′-端或3′-端連接功能分子，實現(xiàn)其功能化；交匯于端口時，可添加功能分子修飾或使用DNA連接酶封閉端口。合成后的TDN可由聚丙烯酰胺凝膠電泳、原子力顯微鏡及動態(tài)光散射技術等進行表征。

而Li等[20]使用1條含有286個核苷酸的單鏈DNA成功設計合成了TDN。該組裝過程簡化，易于擴增，且具有較好的抵抗酶解特性，為合成TDN提供了新方法。

與其他DNA結構相比，TDN能利用特殊的三維結構，在有或沒有轉染劑的輔助下，均可有效進入哺乳動物細胞內[14]，它通過小窩蛋白的內吞作用進入細胞[21]，避免了原始DNA分子在沒有輔助劑的情況下難以大量進入細胞的缺陷。

使用TDN進行治療時，它需進入體內并在體內環(huán)境中維持穩(wěn)定性，避免被過度降解消除。研究表明，二價離子可有助于平衡DNA螺旋結構間的靜電排斥作用，因此在緩沖液中加入Mg2+可保持DNA納米結構的完整性[22]。Mg2+濃度過高可使其過度聚集，過低則影響TDN合成，因此需進一步探究適宜的Mg2+濃度。

3 TDN應用

TDN已被證實有重要的功能，可通過DNA納米材料傳導生物活性分子如miRNA、siRNA、藥物等入胞發(fā)揮作用，且可調節(jié)細胞功能，從而進細胞增殖。

3.1 藥物運輸

TDN結構中的黏性末端可作為其他物質的結合位點用以構建TDN復合物，介導功能性分子進入細胞內，從而發(fā)揮生物學功能。TDN由于能滲透入細胞膜且具有生物相容性和可降解性，因此可作為藥物運輸載體，在修飾位點結合不同官能團后可改變其藥物輸送能力。Li等[23]將抗癌適配體AS1411連接到TDN末端，組成Apt-TDN后，比較低氧狀態(tài)下Apt-TDN與TDN在腫瘤細胞和正常細胞中的定位及對細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)Apt-TDN對腫瘤細胞有更好的靶向性，并能高效進入腫瘤細胞內發(fā)揮生理作用，證實結合抗癌適配體AS1411可提高TDN的藥物輸送能力。Kim等[24]將TDN與阿霉素進行結合，發(fā)現(xiàn)其更易遞送到靶細胞，可顯著抑制多重耐藥性(MDR)細胞生長。有研究將阿霉素插入經過修飾的KLA-TDN后，KLA-TDN-阿霉素復合體靶向傳遞至線粒體，啟動了線粒體介導的程序性細胞凋亡途徑[25]。以上研究表明，結合不同的適配體可能發(fā)揮不同的作用或影響生物材料生理功能。

目前有研究將TDN作為基因載體與其他物質結合。Lee等[26]將siRNA通過與TDN結合傳遞到細胞內，進而靶向抑制腫瘤基因表達，該復合物在體內有較長的半衰期，有助于分子發(fā)揮作用。Meng等[27]為增加DNA核酶被細胞攝取的能力，使用TDN作為載體，將Dz13序列直接添加到單鏈DNA的5′-末端，形成四面體結構，進而將其介導入胞，結果顯示其具有高效的細胞攝取效率，且不影響Dz13活性，可靶向裂解c-Jun的mRNA，從而抑制鱗狀細胞癌生長。

3.2 生物分子檢測

攜載分子的三維DNA結構也可用于檢測其他生物大分子。Hu等[28]將TDN結合到鏈霉親和素涂層的量子點(QD)，獲得了QD-Cy3-Texas Red-Cy5四面體DNA，并證實該物質不僅可在復雜的生物樣品中同時均質檢測多種核酸酶如HaeⅢ、EcoRV和Pvull等，而且可用于進行多種酶抑制劑的篩選。Li等[29]將設計合成的TDN共價偶聯(lián)到玻璃表面，其顯示出良好的生物識別能力，可高度敏感和選擇性地檢測不同類型的生物活性分子如蛋白質、miRNA等，且較為高效，應用前景廣闊。

3.3 組織血管形成

實現(xiàn)組織血管化是進行受損組織修復的重要部分。新生血管能將營養(yǎng)物質輸送到代謝活躍的組織內，促進愈合，因此對骨修復具有重要作用[30]。血管生成是血管內皮細胞遷移和增殖形成具有血管網絡系統(tǒng)的過程，體內植入假體后，周圍組織炎性反應將有助于誘導血管發(fā)生，但此過程速度較慢，不利于組織修復過程，而TDN可在此過程中增強血管生成作用。Zhao等[31]培養(yǎng)小鼠內皮細胞，使其暴露于250 nmol/L濃度的TDN中，發(fā)現(xiàn)TDN可進入內皮細胞且促進內皮細胞增殖和遷移，同時檢測到血管生成相關生長因子表達上調，并伴有Notch信號轉導通路激活。

在糖尿病患者中，為防止致殘及降低截肢風險，對伴發(fā)的糖尿病傷口預防十分必要，傷口愈合過程中的血管化對于傷口恢復不可或缺。Lin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，TDN可以保護內皮細胞功能，減輕炎癥，并經Akt/Nrf2/血紅素加氧酶-1(HO-1)信號轉導通路通過其抗氧化活性抵抗氧化損傷。

3.4 干細胞功能調節(jié)

對干細胞分化及功能進行調節(jié)是骨組織工程研究的重點，TDN對于干細胞遷移及功能表達具有明顯作用。研究證實，TDN在脂肪來源干細胞、牙髓干細胞、神經干細胞等中具有促進細胞增殖、遷移及成骨分化的作用[33-37]。脂肪來源干細胞是一種由脂肪組織中分離得到的具有多向分化潛能的干細胞，主要參與促進組織細胞再生、加快組織細胞修復等。脂肪來源干細胞具有向成骨樣細胞分化的能力，與骨髓來源干細胞相比，其來源豐富，易于獲取且對患者損傷程度小，被視為理想的骨再生干細胞[38]。但單獨的脂肪來源干細胞沒有足夠的成骨能力，不能修復較大骨缺損，因此需與其他生物材料相結合以增強其成骨能力。Shi等[39]研究TDN對大鼠脂肪來源干細胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)TDN可顯著增強大鼠脂肪來源干細胞遷移，并下調長非編碼RNA(lncRNA)XLOC 010623，從而激活Tiam1和Rac1的mRNA表達。此外，TDN可上調RHOA、ROCK2和VCL的mRNA和蛋白表達，進而證實TDN通過抑制lncRNA XLOC 010623轉錄并激活Tiam1/Rac1和RhoA/ROCK2信號轉導通路基因表達，促進細胞遷移，且TDN促進脂肪來源干細胞遷移的作用呈濃度依賴性。Shao等[40]將脂肪來源干細胞暴露于TDN，發(fā)現(xiàn)其增殖和成骨分化作用增強，免疫熒光測定顯示有β-catenin表達，Wnt/β-catenin信號轉導通路相關基因和蛋白表達上調，且暴露24 h后出現(xiàn)更強的熒光信號，表明TDN在脂肪來源干細胞分化增殖過程中具有重要作用，且經典的Wnt/β-catenin信號轉導通路可能是其發(fā)揮作用的重要機制，為基于脂肪來源干細胞骨缺損修復提供了新方向。

3.5 骨與軟骨細胞修復

骨關節(jié)炎是一種常見的退行性關節(jié)軟骨病變，其病理過程伴隨著大量的軟骨細胞凋亡。因此，骨關節(jié)炎治療過程中應關注軟骨細胞功能的修復。軟骨細胞凋亡和骨關節(jié)炎發(fā)生與細胞自噬減少有關。TDN對細胞自噬有促進作用。Shi等[41]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞暴露于TDN后，在沒有輔助劑的情況下，TDN可以順利進入軟骨細胞，且主要集中在軟骨細胞細胞質內。隨后，Shi等[42]成功合成TDN并使其進入經白細胞介素(IL)-1β誘導的軟骨細胞內，發(fā)現(xiàn)TDN通過激活BCL2/BAX/caspase-3信號轉導通路來減少軟骨細胞凋亡，通過激活Nrf2/HO-1信號轉導通路來抑制IL-1β誘導的氧化應激，通過上調LC3-Ⅱ、Beclin1和Atg7增強自噬。此外，TDN還可通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號轉導通路發(fā)揮軟化作用。以上研究表明，TDN作為生物材料可防止骨關節(jié)炎進展，對骨關節(jié)炎有潛在的治療價值。

在骨組織工程研究中，利用生物材料對軟骨細胞表型及增殖過程進行調節(jié)是一種有效的方法，以此可將軟骨細胞引向所需的位置，從而發(fā)揮功能。TDN可能會對軟骨細胞產生生物效應，并促進軟骨細胞向損傷部位運動。Shi等[43]采用退火法合成TDN，使用實時細胞分析和傷口愈合實驗研究TDN對從大鼠關節(jié)軟骨分離的軟骨細胞運動的影響，使用定量聚合酶鏈反應、蛋白免疫印跡法和免疫熒光檢測相關基因及蛋白變化，證實TDN可增強軟骨細胞活動能力，且RhoA、ROCK2和vinculin的mRNA和蛋白表達增強，這種作用在TDN濃度為250 nmol/L時最為顯著，表明TDN結構可能有助于軟骨修復過程，且與濃度相關。Shao等[44]使分離得到的小鼠軟骨細胞暴露于制成的TDN中，發(fā)現(xiàn)TDN能調節(jié)軟骨細胞表型，促進軟骨細胞增殖，同時出現(xiàn)與Notch信號轉導通路相關基因和蛋白低表達及Ⅱ型膠原高表達。這些結果表明，TDN可能是軟骨增殖及功能調節(jié)的重要物質，可能可用于軟骨修復。

4 結語

已有諸多研究逐漸證實了TDN功能及其在骨組織分化過程中的作用，為解決臨床問題提供了新思路。但目前尚有諸多問題未能完全解決，如對骨髓來源的造血干細胞是否有積極作用及其機制如何、其結合位點是否能攜帶與成骨有關的因子、如何保持其在體內的生物活性、能否對肌肉組織產生作用等，仍需進行進一步研究。