沈君劼 林俊卿 索金龍 鮑丙波 柴益民 鄭憲友

周圍神經(jīng)損傷是指因創(chuàng)傷等造成的神經(jīng)軸突中斷或斷裂，從而影響神經(jīng)傳導功能，導致患者出現(xiàn)軀干及四肢的感覺、運動功能及交感神經(jīng)功能障礙，可嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。針對周圍神經(jīng)損傷的治療方式包括自體神經(jīng)移植、神經(jīng)移位修復、神經(jīng)松解減壓等。這些治療方式各有優(yōu)缺點，其中自體神經(jīng)移植是臨床治療周圍神經(jīng)損傷的常用方法和“金標準”方法，但其仍存在一些不足之處，如供區(qū)損傷、移植物來源有限以及移植后神經(jīng)粗細不匹配等。

近年，生物工程技術(shù)及組織工程化神經(jīng)技術(shù)逐漸被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療中。組織工程化神經(jīng)即應(yīng)用“支架材料-細胞-生長因子”復合物橋接神經(jīng)缺損的斷端，以達到修復缺損神經(jīng)的解剖結(jié)構(gòu)及功能連續(xù)性的目的[2]。本文就組織工程化神經(jīng)中支架材料、種子細胞及生長因子的研究進展進行綜述。

1 支架材料

支架材料是組織工程的核心要素，其要求具備以下性能：①良好的親水性及生物相容性，以有利于種子細胞黏附并降低移植后的免疫排斥反應(yīng)；②生物可降解性，以滿足軸突再生速率與支架降解速率的匹配；③優(yōu)良的機械性能，以避免外部組織壓迫引起內(nèi)壁坍塌，阻礙軸突再生[3]。目前，組織工程神經(jīng)導管領(lǐng)域應(yīng)用較多的支架材料包括可降解聚合材料、脫細胞材料及碳納米材料。

1.1 可降解聚合材料

盡管早期研究證實不可降解導管也具有一定的周圍神經(jīng)修復作用，但殘留材料引起的排異反應(yīng)限制了其進一步應(yīng)用。目前，組織工程神經(jīng)導管的材料選擇從應(yīng)用人工或天然可降解材料到開發(fā)交聯(lián)技術(shù)聚合人工/天然材料，已取得較大進展[4]。近年來常用天然材料包括蛋白質(zhì)類(絲素、膠原等)和多糖類(明膠、殼聚糖、纖維素、藻酸鹽等)，常用人工材料主要包括脂肪多元脂類、導電聚合物及水凝膠材料[5-8]。由于天然可降解材料具有優(yōu)良的生物相容性、親水性，而人工可降解材料能保證支架的可調(diào)機械性，因此復合支架構(gòu)建是生物工程的發(fā)展趨勢，并有望在組織工程神經(jīng)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

為進一步提升生物支架的綜合性能，近年來對于可降解聚合材料開發(fā)的熱點逐漸延伸到材料的化學改性以及3種以上材料的交聯(lián)復合方面。Luo等[9]將明膠賦予甲基丙烯酸酐官能團，制備成甲基丙烯酰胺基明膠(GelMA)神經(jīng)導管。他們開展的體外實驗表明，該水凝膠三維結(jié)構(gòu)更適合神經(jīng)生長，并具有促血管再生和促神經(jīng)干細胞定向分化的能力。Lopez-Silva等[10]將具有多肽結(jié)構(gòu)的自組裝水凝膠導管用于大鼠周圍神經(jīng)卡壓模型治療。他們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比該水凝膠導管能明顯加快神經(jīng)纖維再髓鞘化和促進功能恢復。此外，也有學者提出使用乙?；男詺ぞ厶腔鶎щ姀秃喜牧稀４笫篌w內(nèi)實驗表明，該材料具有良好的生物相容性、導電性和可降解性[11]。以上研究表明，通過技術(shù)改性及材料的交聯(lián)復合，可進一步提高可降解聚合材料在神經(jīng)導管研究中的價值。

1.2 脫細胞材料

脫細胞材料去除細胞成分而保留了細胞外基質(zhì)和大部分生長因子，其在降低免疫反應(yīng)的同時可更接近自體神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)與功能，對神經(jīng)再生具有極大應(yīng)用價值。周圍神經(jīng)修復材料包括血管、肌肉、神經(jīng)等[12-13]。Li等[14]在臨床研究中使用人去細胞神經(jīng)導管結(jié)合對側(cè)C7神經(jīng)移位術(shù)治療臂叢神經(jīng)損傷，通過4年隨訪發(fā)現(xiàn)治療組的預(yù)后功能恢復更滿意。由于同種來源脫細胞支架的來源有限，異種來源脫細胞支架的使用拓寬了其應(yīng)用范圍。近年文獻報道的異種脫細胞材料來源包括大鼠、小鼠、兔、豬等[15]，它們均在體外實驗中被證實有利于種子細胞黏附、增殖以及軸突再生。其中，豬來源異種脫細胞神經(jīng)導管因其組織結(jié)構(gòu)更接近人體，被認為最有望替代同種脫細胞支架。

1.3 碳納米材料

石墨烯碳納米材料具有良好的導電性和機械強度，在組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。過去數(shù)年，石墨烯納米材料在周圍神經(jīng)損傷修復中的應(yīng)用已取得很大進步。Huang等[16]將施萬細胞孵育在石墨烯材料表面，發(fā)現(xiàn)其能通過電信號刺激促進細胞遷移增殖，并提高神經(jīng)生長因子(NGF)的表達。由于周圍神經(jīng)損傷后軸突的定向再生需要借助施萬細胞引導，上述發(fā)現(xiàn)為石墨烯材料的體內(nèi)實驗研究提供了理論支持。學者們進一步在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，石墨烯能誘導人多能干細胞[16]、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞[17]、小鼠胚胎干細胞[18]等向神經(jīng)譜系細胞分化發(fā)育，提示不同動物來源及人來源的干細胞移植到石墨烯材料后均能生存并分化。由于石墨烯材料親水性較差、脆性較高，應(yīng)用于體內(nèi)研究常需和其他材料進行復合。有學者制備出石墨烯/聚L-丙交酯-己內(nèi)酯(PLCL)神經(jīng)導管，大幅提升了神經(jīng)細胞的黏附、增殖能力，以及S100、NGF等神經(jīng)蛋白的表達水平。有研究將該導管移植入大鼠10 mm坐骨神經(jīng)長段缺損模型，結(jié)果顯示復合石墨烯的導管在動作電位、神經(jīng)傳導速度和神經(jīng)支配功能恢復上均優(yōu)于PLCL導管[19]。Park等[20]則利用GelMA水凝膠復合氧化石墨烯制備出一種可導電神經(jīng)導管，并顯示出其對周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有促進再生的效果。

雖然上述研究結(jié)果均提示石墨烯在修復神經(jīng)損傷中的優(yōu)越性，但石墨烯碳納米材料難以在體內(nèi)被降解吸收，具有潛在的生物毒性[21]。為解決這一問題，Qian等[22]通過改進制備方法，首次提出層層制模法制備單層和多層復合石墨烯神經(jīng)導管。該導管的表面微孔有助于營養(yǎng)交換和代謝，并通過確定最佳石墨烯含量來降低體內(nèi)的細胞毒性反應(yīng)。近期有學者使用熒光素標記碳納米材料，利用活體成像技術(shù)監(jiān)測神經(jīng)導管降解后石墨烯在體內(nèi)的分布，這種方法為明確石墨烯碳納米材料的體內(nèi)生物毒性提供了新思路[23]。

2 種子細胞及其衍生物

種子細胞及其衍生物是組織工程的原材料之一，它們參與構(gòu)建了組織工程化神經(jīng)導管，同時也轉(zhuǎn)化為生物組分，促進和引導軸突再生，為神經(jīng)再生提供適宜的微環(huán)境。因此，種子細胞的合理應(yīng)用成為組織工程化神經(jīng)導管成功的關(guān)鍵要素。

2.1 施萬細胞

施萬細胞是周圍神經(jīng)損傷修復中極為重要的結(jié)構(gòu)和效應(yīng)細胞。損傷發(fā)生時，施萬細胞可增殖并募集巨噬細胞來吞噬碎片，后期的軸突再生修復也需要施萬細胞引導并分泌生長因子[24]。多項體內(nèi)外實驗證實，負載施萬細胞的組織工程神經(jīng)導管能上調(diào)NGF的表達，顯著改善受損神經(jīng)的形態(tài)和功能，并促進軸突再生[25]。雖然施萬細胞作為種子細胞具有一定效應(yīng)，但由于它是終末期細胞，增殖能力較差，提取較為困難，限制了其推廣。有研究人員從大鼠皮膚組織中分離出施萬前體細胞，并將其成功填充于神經(jīng)導管，以促進新生軸突髓鞘化及運動功能的改善[26]。

2.2 干細胞

干細胞具有向神經(jīng)元細胞和類施萬細胞分化的潛能，被認為是組織工程學中的重要細胞。研究證實，神經(jīng)導管結(jié)合誘導多能神經(jīng)干細胞具有促進周圍神經(jīng)再生的能力，并且細胞移植的免疫原性較低[27]。但是考慮到細胞存活率、體外擴增難易度以及提取途徑等問題，誘導其他組織來源干細胞向神經(jīng)樣細胞分化是目前的研究熱點。大量體內(nèi)外實驗證實，骨髓、胚胎、毛囊、脂肪、肌肉等組織來源的干細胞均具有向神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的潛能，其修復周圍神經(jīng)損傷的效果優(yōu)于單一神經(jīng)導管，其中骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞目前應(yīng)用最為廣泛[28]。由于大部分研究缺少不同干細胞之間的比較，因此尚不能推斷何種細胞是神經(jīng)組織工程的最佳種子細胞。近期，有學者對相同支架負載骨髓間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損進行比較研究。他們發(fā)現(xiàn)，負載脂肪間充質(zhì)干細胞的支架細胞增殖速度更快，但再生神經(jīng)纖維數(shù)目、再生神經(jīng)纖維直徑以及大鼠步態(tài)指數(shù)在兩種支架間未見顯著性差異，因此還需要開展更多對照研究，來比較不同種類干細胞在周圍神經(jīng)修復中的差異[28]。

值得注意的是，干細胞移植前的預(yù)處理階段、宿主體內(nèi)微環(huán)境變化均會對移植效果產(chǎn)生影響，導致最終分化的神經(jīng)細胞數(shù)目不足[3]。有研究表明，支架移植入缺損神經(jīng)后僅約5%的骨髓間充質(zhì)干細胞能分化為類施萬細胞[29]。因此，解決細胞移植后低存活率和低分化率問題是目前種子細胞研究的熱點。Zhou等[30]為提升移植干細胞存活率，引入旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來提高植入細胞及生長因子的生物活性。Yurie等[31]利用3D打印技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細胞作為生物墨水，結(jié)果顯示制備過程加快，且仿生三維支架結(jié)構(gòu)可提高種子細胞的生存能力。

近年，基于種子細胞的基因編輯技術(shù)為提高細胞移植后的修復效率提供了新策略。Sultan等[32]通過基因技術(shù)改造骨髓間充質(zhì)干細胞使其具備分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力，發(fā)現(xiàn)改造后的細胞能誘導神經(jīng)細胞突觸延伸，進而促進神經(jīng)修復。

2.3 細胞外囊泡

外泌體是一種攜帶信使RNA、微RNA、長鏈非編碼RNA、蛋白質(zhì)等信息的納米級細胞外囊泡。外泌體是重要的細胞間通訊工具，對周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控具有重要作用，正逐漸成為組織工程神經(jīng)的研究熱點[33]。學者們首先發(fā)現(xiàn)施萬細胞外泌體能促進神經(jīng)細胞遷移，將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型后可顯著促進軸突再生[34]。隨后，Guo等[35]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源外泌體修復周圍神經(jīng)損傷的能力與施萬細胞外泌體在周圍神經(jīng)損傷中的修復效果相似。Rao等[36]將殼聚糖支架包裹人牙間充質(zhì)干細胞來源外泌體，并將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，移植12周后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組再生神經(jīng)纖維數(shù)目和神經(jīng)纖維直徑均明顯增加，腓腸肌失神經(jīng)支配現(xiàn)象明顯減輕。上述研究表明，細胞外泌體能促進周圍神經(jīng)損傷后的再生，為組織工程神經(jīng)提供了新方法。

3 細胞因子

周圍神經(jīng)損傷后內(nèi)源性因子常無法滿足神經(jīng)再生的需求，因此神經(jīng)導管緩釋外源性細胞因子成為組織工程研究的又一方向。文獻已報道的神經(jīng)細胞因子包括NGF、神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等[37]。Singh等[38]使用3D打印技術(shù)將NGF填充于組織工程神經(jīng)導管，并將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型。他們發(fā)現(xiàn)，NGF組不僅再生神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)更接近于正常神經(jīng)組織，大鼠損傷后步態(tài)功能恢復也優(yōu)于單純支架組。Fadia等[39]在恒河猴上建立50 mm正中神經(jīng)缺損模型，并將GDNF添加于聚已內(nèi)酯(PCL)支架上，發(fā)現(xiàn)PCL/GDNF治療組相比單純PCL支架組能更顯著地促進施萬細胞定向遷移及軸突再生。近年來有學者嘗試將多種細胞因子混合，以進一步提高組織工程神經(jīng)的修復效率。Lu等[40]使用水凝膠支架包裹GDNF和血管生長因子，制備出雙功能性神經(jīng)導管。他們將該導管用于大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損模型中，發(fā)現(xiàn)雙細胞因子組神經(jīng)周圍微血管新生更明顯，同時體內(nèi)電生理信號和神經(jīng)纖維新生密度均強于單一使用兩種細胞因子組。

這些體內(nèi)外研究表明了細胞因子在組織工程神經(jīng)中具有的潛能。此外，鑒于上述兩種細胞因子組合后效果優(yōu)于單細胞因子，也有學者直接使用富血小板血漿等含多種生長因子的組織成分復合支架材料來修復周圍神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)修復效果與自體神經(jīng)移植接近[41]。由于細胞因子是大分子蛋白，易受支架材料制備時的高溫高壓或物理環(huán)境影響，所以組織工程神經(jīng)制備過程中保持細胞因子活性也是今后研究的方向[37]。

4 存在問題與展望

周圍神經(jīng)再生解剖及生理功能的復雜性對組織工程神經(jīng)導管提出了許多挑戰(zhàn)。近年來，盡管支架材料、種子細胞和細胞因子在體內(nèi)外實驗中的應(yīng)用均有顯著突破，但仍然存在諸多問題亟待解決，如支架材料的降解速率、生物相容性、結(jié)構(gòu)和制備方式的優(yōu)化、種子細胞的來源及倫理、移植后存活率、移植劑量、擴增后宿主免疫反應(yīng)、細胞因子移植量及生物活性的保持等。