鄭芳，肖新益

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率位于全球癌癥第六位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]，局部浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者死亡的主要原因[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤血管的增長是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要過程，而且腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與血管生成有關(guān)[3-5]。TRF2是端粒重復(fù)結(jié)合因子2，通過轉(zhuǎn)錄激活血小板源生長因子受體β促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管的生成[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TRF2在肝癌、皮膚癌和結(jié)腸癌等中高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[7]，且TRF2具有調(diào)控結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的功能，能夠促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[8-9]，說明TRF2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌因子的作用。但TRF2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用目前尚未有研究報(bào)道。因此，本研究通過探究TRF2在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，闡明TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，以期為控制宮頸癌轉(zhuǎn)移研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與組織來源及主要試劑

18例宮頸癌組織及癌旁正常組織均來自黃石市愛康醫(yī)院于2018年3月至2020年2月收治的宮頸癌病例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查確診為宮頸癌。宮頸癌患者年齡26～75歲,臨床分期：I期(11例)，II期(6例)，III期(1例)；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌(14例)，腺癌(4例)；淋巴轉(zhuǎn)移(1例)，未轉(zhuǎn)移(17例)。所有患者術(shù)前均未行化療或放療，取其宮頸癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本，保存于-80 ℃。宮頸癌細(xì)胞Hela與宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic 均購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，常規(guī)傳代培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰酶購自中國賽默飛世爾科技有限公司。HUVEC細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司。蘇木素-伊紅染色試劑盒購自中國索萊寶公司。si-NC、si-TRF2、Lipofectamine 3000及BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen公司。大鼠源TRF2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、HIF-1α及VEGF-A抗體及二抗(山羊抗鼠)購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

宮頸癌細(xì)胞Hela與宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長密度更換新鮮培養(yǎng)基。HUVEC細(xì)胞用其專用培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞Hela，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×106個(gè)，接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長密度至65%～75%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 3000試劑說明書分別轉(zhuǎn)染si-NC與si-TRF2，分別設(shè)置為si-NC組與si-TRF2組。

1.3 免疫組織化學(xué)法

對(duì)宮頸癌組織樣本和癌旁正常組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟后蒸餾水浸洗1 min后，進(jìn)行抗原修復(fù)后，滴加3%的過氧化氫于切片組織上，室溫孵育10 min，PBS沖洗5次，每次2 min。滴加稀釋好的山羊血清，孵育40 min，去除玻片周圍液體，滴加TRF2抗體，置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS沖洗切片5次，每次2 min，去除玻片周圍液體，滴加二抗37℃孵育25 min。PBS沖洗切片，滴加DAB顯色液，自來水沖洗終止染色后，Harris蘇木素復(fù)染45 s，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來水水洗返藍(lán)。將切片置于無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ脫水后，平置于通風(fēng)櫥晾干，鏡檢拍照。

1.4 Western blot

用含有苯甲磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液裂解各組Hela細(xì)胞及HcerEpic細(xì)胞。利用BCA試劑盒檢測各細(xì)胞蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白后轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，加如TRF2(1∶1 500)、E-cadherin(1∶1 200)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶8 000)、HIF-1α(1∶1 000)及VEGF-A(1∶1 200)，4°C孵育過夜。TBST漂洗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶5 000)溫育1 h。滴加ECL顯影曝光后，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集各組Hela細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞至2 000個(gè)細(xì)胞/ mL，接種于6孔板內(nèi)(接種密度為1×104個(gè)/孔)。培養(yǎng)7天后觀察細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入1 mL 4%多聚甲醛，4℃固定細(xì)胞1 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入1 000 μL結(jié)晶紫染色液作用細(xì)胞2 min，ddH2O洗滌細(xì)胞3次，晾干后拍照，在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)且計(jì)數(shù)?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell板的上室涂加100 μL的Matrigel，將各組Hela細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到上室，下室加入體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。采用棉簽擦拭上室細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞。體積分?jǐn)?shù)95%乙醇固定細(xì)胞10 min，結(jié)晶紫染色液作用15 min，PBS洗滌3次，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

將各組Hela細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用微量胰蛋白酶消化，將密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔的Hela細(xì)胞平鋪在6孔板上。設(shè)置3個(gè)平行孔。使用200 μL的無菌槍頭輕輕劃過6孔板，每次平行劃5次左右。將處理后的6孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS沖洗3次。用倒置顯微鏡對(duì)各孔中同一劃線位置細(xì)胞拍照。采用Image J軟件測量各圖中細(xì)胞未爬行區(qū)域的空白面積，并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h空白面積-48 h空白面積)/0 h空白面積×100%。

1.8 小管形成實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠在4 ℃融化使其充分溶解后，吸取50 μL加入96孔板中并在37℃下培養(yǎng)2 h以固化基質(zhì)膠。收集各組Hela細(xì)胞的上清，離心去除細(xì)胞上清中的細(xì)胞碎片。利用各組細(xì)胞上清和HUVEC的專用培養(yǎng)基重懸HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，加入預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的96孔板內(nèi)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。在顯微鏡下觀察各組小管形成情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRF2在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1a)顯示，宮頸癌組織中TRF2的表達(dá)高于癌旁正常組織；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1b)顯示，宮頸癌細(xì)胞Hela中TRF2的蛋白表達(dá)高于宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a:TRF2在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化)； b:TRF2在宮頸癌細(xì)胞Hela和宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic中的表達(dá)。相對(duì)于HcerEpic細(xì)胞，**P<0.01。

2.2 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖2a)、Transwell實(shí)驗(yàn)(圖2b)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(圖2c)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TRF2組Hela細(xì)胞的克隆形成數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)及劃痕閉合均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a:沉默TRF2對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖的影響；b:沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響；c:沉默TRF2對(duì)子宮頸癌細(xì)胞遷移的影響。相對(duì)于si-NC，*P<0.05。圖2 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.3 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞血管生成能力的影響

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3a、b)顯示，與si-NC組相比，si-TRF2組細(xì)胞血管形成能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4a、b)顯示，與si-NC組相比，si-TRF2組Hela細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，而N-cadherin、Vimentin及Snail的蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5a、b)顯示，與si-NC組相比，si-TRF2組Hela細(xì)胞的HIF-1α與VEGF-A的蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：沉默TRF2對(duì)子宮頸癌細(xì)胞的血管生成的影響。相對(duì)于si-NC，*P<0.05。圖3 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞血管生成能力的影響

注：TRF2沉默對(duì)子宮頸癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響。相對(duì)于si-NC，*P<0.05。圖4 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞上皮間-質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)的影響

注：TRF2沉默對(duì)宮頸癌細(xì)胞HIF-1α/ VEGF信號(hào)通路的影響。與si-NC相比，*P<0.05。圖5 沉默TRF2對(duì)宮頸癌細(xì)胞HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響

3 討論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)中的第一步，其關(guān)鍵過程是極性分布靜止的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無極性分布且運(yùn)動(dòng)活躍的間質(zhì)樣細(xì)胞[10]，活躍的間質(zhì)樣細(xì)胞則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及抵抗細(xì)胞凋亡，而且通過產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[11]。

近年研究顯示，TRF2的異常表達(dá)參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。TRF2是端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體因子2，定位于染色體16q22.1，其基因全長30 kb，分子結(jié)構(gòu)域分為堿性區(qū)(basic)、二聚化區(qū)(dimerization)、定向序列(NLS)和DNA結(jié)合區(qū)(Myb)[12]。研究顯示，TRF2通過參與T環(huán)與D環(huán)的形成，抑制經(jīng)典的非同源末端連接(C-NHEJ)DNA修復(fù)機(jī)制和ATM依賴的DDR，以此確保其染色體結(jié)構(gòu)完整以及避免其染色體的不正確修復(fù)[13]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。Roy等[14]研究顯示，TRF2在頭頸癌組織中高表達(dá)，沉默TRF2可顯著降低頭頸癌細(xì)胞中p38的磷酸化水平進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及耐藥性。Picco等[15]研究顯示，TRF2參與調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。與Roy等研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)TRF2在宮頸癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，沉默TRF2可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，說明TRF2在宮頸癌中也發(fā)揮其促癌因子的作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個(gè)涉及細(xì)胞的形態(tài)和行為改變的可逆的生物學(xué)過程。而且研究已證實(shí)，腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)[16-17]。巴彩霞等[18]研究顯示，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后能夠離開原發(fā)灶，入侵和轉(zhuǎn)移至其他組織及器官；Tsai等[19]研究顯示，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，侵襲及遷移能力明顯增強(qiáng)。研究顯示，上皮特征[E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白及細(xì)胞角蛋白]的缺失和間充質(zhì)特征[N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和纖連蛋白(Snail)]的獲得，會(huì)使癌細(xì)胞具有更快更強(qiáng)的侵入性[20-21]。李雪蓮等[22]研究顯示，山慈菇通過促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制Snail、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，阻止乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；趙曉珍等[23]研究顯示，肺巖寧方通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin 表達(dá)，抑制腫瘤異質(zhì)粘附能力和運(yùn)動(dòng)能力抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，說明調(diào)控上皮特征蛋白與間充質(zhì)特征蛋白表達(dá)，可影響腫瘤細(xì)胞的侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，在本研究對(duì)TRF2是否影響上皮特征蛋白與間充質(zhì)特征蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示沉默TRF2不僅促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)，而且抑制N-cadherin、Vimentin及Snail蛋白表達(dá)，這說明TRF2調(diào)控上皮特征蛋白與間充質(zhì)特征蛋白表達(dá)，以此影響宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后腫瘤組織中微血管數(shù)目與微淋巴管密度均增多[5]。腫瘤血管形成是腫瘤生長的必須途徑，通過不斷地為腫瘤提供營養(yǎng)和排除代謝產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。HIF-1α是血管形成主要調(diào)控因子，可上調(diào)VEGF-A表達(dá)，促進(jìn)VEGF-A與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-2結(jié)合，使腫瘤局部毛細(xì)血管和淋巴管通透性增加，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞移行并刺激其增殖、分化和成熟，形成原始內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，并通過內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化與外膜覆蓋，最終形成新生的腫瘤血管[25]。郭科軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過上調(diào)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)組織中血管的形成，促進(jìn)宮頸癌前病變的進(jìn)展和宮頸癌的生長及浸潤，說明HIF-1α與VEGF具有調(diào)控宮頸癌血管生成的作用。El等[27]研究顯示，TRF2通過結(jié)合和激活PDGFR的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)血管生成；Zizza等[8]研究顯示，沉默TRF2降低結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞分泌體中的VEGF-A，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化和血管的生成。本研究結(jié)果顯示沉默TRF2能夠降低血管形成相關(guān)分子HIF-1α與VEGF-A的表達(dá)水平，抑制HUVECs細(xì)胞血管壁的形成。

綜上所述，沉默TRF2的表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這可能是由于沉默TRF2抑制了HIF-1α介導(dǎo)的血管生成。

致謝：感謝華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院覃元老師在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中給予的指導(dǎo)和幫助。